单基因遗传病分子诊断的新策略和新方法

单基因遗传病具有复杂的表型异质性及遗传异质性,基因突变可涉及点突变、片段缺失／重复、整个基因的缺失／重复、以及动态突变等众多类别.分子诊断技术使得单基因遗传病可在分子水平乃至单个碱基发生变异的情况下做出准确诊断,然而其可靠性问题成为备受瞩目的技术难点.针对不同遗传病使用不同的解决方案,是目前单基因遗传病分子诊断的主流思想.基因诊断相关人员不仅要了解遗传疾病致病基因及其突变特点,还要熟知各种检测技术的特点,合理选择.

应用改良消减杂交技术克隆妊娠高血压综合征致病相关基因

目的研究妊娠高血压综合征(妊高征)致病相关基因,探讨妊高征的发病机理.方法采用基于聚合酶链反应(PCR)基础上的改良消减杂交技术,克隆妊高征患者及正常产妇的胎盘组织中差异表达的cDNA,并进行DNA的序列测定.结果从86个消减杂交获得的cDNA克隆中,确定、筛选出14个含有妊高症患者及正常产妇胎盘组织差异表达的cDNA,即为可能与妊高征发病相关的基因片段.经与美国国立卫生研究院国家生物技术信息中心的表达序列标签数据库(dbEST)比较,发现其中11个为已知序列片段,3个为未知序列片段.将3个未知序列片段登录美国国立卫生研究院基因库,登录号分别为AF232216、AF232217、AF233648.结论采用消减杂交技术从妊高征患者胎盘组织中克隆出14个可能与妊高征发病相关的基因片段,为妊高征发病机理的研究提供了新的思路和方法.

妊娠高血压综合征患者易感基因的研究

妊娠高血压综合征（妊高征）是当前产科领域中引起母儿病率及死亡率增高的主要疾病之一。该病具有家族遗传倾向已是公认的事实［1］。近些年，随着遗传学理论和技术的飞速发展，特别是人类基因组计划将全面完成，对该病的遗传学病因的研究日渐增多，已从传统的遗传模式研究逐渐发展为探索妊高征患者的易感染色体片段和易感基因，下面就近几年来有关妊高征易感基因的研究作一综述。　　一、妊高征关联的易感染色体片段　　通过家系寻找与疾病关联的染色体片段，然后进一步深入探索该染色体片段内的易感基因，这是从遗传学上来寻找易感基因一种方法。首先确立妊高征患者为家族的先证者（即家族中首先发现此病的患者），然后进行家系调查分析，是否有一级和二级亲属的妊高征患者，如果有遗传倾向的妊高征家系则确立为一个研究对象，当收集多个妊高征家系后，分离患者的外周血白细胞，抽提DNA，选用全基因组或某染色体片段的微卫星DNA标志（microsatellite DNA marker）进行杂交，根据杂交所得结果，并选定妊高征孟得尔遗传模式，用计算机统计软件，进行两点优势对数分析、多点优势对数分析和非参数方法连锁分析，探索妊高征关联的染色体片段。妊高征的遗传模式对该研究结果有非

基因芯片技术在妇产科的应用

基因芯片技术是20世纪90年代中期发展起来的一项划时代意义的生物技术.它综合了分子生物学、免疫学、生物物理化学、微电子技术等学科的新技术,具有对生物分子快速处理的能力.与传统的生物技术如检测、DNA杂交、分型和DNA测序技术相比具有信息量大、处理速度快、所需样品少、污染少等优点.近年来,在疾病的诊断和治疗、药物筛选、新药研制开发、疾病预防等医学领域具有广阔的应用价值.

两种不同遗传学分析方法用于诊断自然流产组织的比较

目的探讨比较基因组杂交(CGH)技术与绒毛细胞培养染色体核型分析用于自然流产组织遗传学诊断的准确性.方法选择妊娠49～91 d的自然流产患者38例,在无菌条件下经宫颈取绒毛,其中难免流产的新鲜组织标本27份,过期流产的陈旧组织标本11份.每份组织标本均采用绒毛细胞培养染色体核型分析,并同时采用CGH技术对全基因组进行分析.结果 CGH技术诊断成功率为100%(38/38),而绒毛细胞培养染色体核型分析诊断成功率为82%(31/38).两种方法的诊断符合率为90%(28/31),在3例出现不同诊断结果的病例中,1例绒毛细胞培养染色体核型分析显示染色体核型正常,而CGH技术显示3q22-q24缺失;另2例绒毛细胞培养染色体核型分析为3倍体,但CGH技术诊断结果显示正常.在7例绒毛细胞培养失败而仅有CGH技术诊断结果者中,3例为染色体非整倍体异常,另4例正常.结论 CGH技术用于诊断自然流产组织是可行的.绒毛细胞培养染色体核型分析比较,CGH技术诊断成功率高,且对非平衡染色体结构重排的诊断有较高的敏感性,可以作为绒毛细胞培养染色体核型分析的补充方法.

妊高征患者的血浆使内皮细胞eNOS mRNA表达增强

妊娠高血压综合征(妊高征)是妊娠期常见的并发症,发病原因尚未完全阐明.近年来,一氧化氮(NO)学说越来越受到重视.本研究采用体外实验的方法,研究妊高征患者的血浆对内皮细胞释放的NO以及应用Northern杂交的方法测定内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)mRNA表达,从而进一步阐明妊高征患者NO水平的改变及其原因.

蛋白尿肾损伤过程中凝血酶敏感蛋白表达的意义

为进一步探讨尿蛋白致肾损伤的机制,我们通过免疫组织化学染色及Northern杂交等方法,观察牛血清白蛋白(BSA)诱导的单侧肾切除大鼠肾损伤过程中,不同时间点蛋白尿对肾组织凝血酶敏感蛋白-1(TSP1)、纤维连接蛋白(FN)核酸及蛋白表达的影响及其意义.

轮状病毒多系统感染二例分析

目的研究轮状病毒(RV)感染肠道外脏器的情况,为临床工作中RV肠道外感染的预防和诊断提供科学基础.方法以间接原位RT-PCR方法检测2例RV感染的婴儿尸解存档石蜡标本,包括脑、心脏、肺、肝脏、脾脏、胰腺、小肠、阑尾、淋巴结、肾脏.标本先经RT-PCR 反应,引物为:PI 5′-GTATGGTATTGAATATACCAC-3′, PII 5′-GATCCTGTTGGCCATCC-3′,循环参数如下: 42℃逆转录1 h,95℃解链5 min,后按94℃1 min,55℃1.5 min,72℃2 min进行PCR循环,共35圈,后72℃10 min结束反应.再与地高辛标记的引物PI作为的探针杂交, 42℃18 h,后DAB显色.结果小肠、肾脏、肝脏、肺呈阳性显色.小肠绒毛、部分肠腺细胞和腺体旁数个淋巴细胞阳性;粘膜下层阴性.肾皮质近曲小管上皮细胞阳性;肾小球、间质及远曲小管、集合管阴性.肺组织内终末细支气管上皮细胞胞浆和部分肺泡上皮细胞阳性,间质细胞阴性.肝脏内部分肝细胞和部分枯否细胞阳性.结论本组2例存在RV多系统感染.RV可侵犯肺、肝脏和肾脏组织,病毒血症是RV的多系统播散的途径.

胃腺癌差异表达基因的cDNA微阵列研究

目的:应用cDNA基因芯片研究筛选人胃腺癌相关差异表达基因,探讨胃癌发生、发展的分子机制.方法:运用含18000个基因克隆的cDNA膜基因芯片,对6对胃腺癌及正常胃组织标本分别进行杂交检测并对比分析.结果:6对人胃腺癌与相对应的胃正常组织相比较,筛选出在3～6对标本中有2倍以上改变的基因克隆共有103条(1条在所有标本中均差异明显),其中胃癌组织表达上调基因56条,胃癌组织表达下调基因47条.结论:人胃腺癌癌变是一个多基因参与的过程,基因芯片技术是一种快速有效的筛选人胃腺癌差异表达基因的方法.

甲状腺癌组织差异表达cDNA消减文库的构建与鉴定

目的:应用抑制性消减杂交技术,构建人甲状腺癌与正常甲状腺差异表达的cDNA消减文库.方法:分别从甲状腺癌及正常甲状腺组织中提取总RNA,应用高效、灵敏的抑制性消减杂交技术,构建成功cDNA消减文库,再转染大肠杆菌进行文库扩增.结果:构建成功具有高消减效率的人甲状腺癌组织cDNA消减文库, 文库扩增得到了400个克隆,随机挑取50个制备质粒,酶切分析均得到50～400 bp大小插入片段,这些片段可能就是载有高度特异性的目的片段,结论:人甲状腺癌组织cDNA消减文库的建立为进一步克隆甲状腺癌特异性表达的新基因奠定了基础.

DNA芯片与小分子金属在医疗诊断领域中的应用

就DNA芯片的概念、特点、原理、制备、分类和用途予以综述.重点讲述了DNA芯片和小分子金属在医疗诊断领域应用中新的发展动态.

人前列腺癌高低转移细胞株差异表达基因的筛选

目的:筛选高低转移能力人前列腺癌细胞株PC3M-1E8和PC3M-2B4间差异表达基因.方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术,对高转移能力人前列腺癌细胞株PC3M-1E8及其同源低转移细胞株PC3M-2B4进行2次消减杂交,第1次SSH实验,以PC3M-2B4细胞株为实验方,PC3M-1E8株为驱动方,构建正向消减文库.第2次实验则以PC3M-1E8株为实验方,PC3M-2B4为驱动方,构建反向消减文库.筛选出来的阳性克隆进行测序,并在Gene Bank数据库中进行同源性比较后从中选取若干序列进行实时定量PCR验证.结果:2个消减文库共得到238个阳性克隆,从中各随机选取8个克隆测序并进行同源性分析,发现其中12条序列来自于11个已知基因,另外4条序列为新的未知功能的基因序列标签(EST).结论:成功构建了高低转移力人前列腺癌细胞株的双向消减杂交文库.

高低淋巴道转移力小鼠肝癌细胞间抑制性消减杂交文库的建立

目的:以抑制性消减杂交技术分离高低淋巴道转移力小鼠肝癌细胞Hca-F和Hca-P间差异表达的基因.方法:采用抑制性消减杂交技术,以高低转移力小鼠肝癌细胞Hca-F为检测子,以低转移力Hca-P细胞为驱赶子,分离高转移力癌细胞中高表达的基因的cDNA片段.将差异表达基因的cDNA片段插入T/A克隆载体,并通过热转化的方法转化大肠埃希菌DH-5α,建立了高低淋巴道转移力小鼠肝癌细胞间抑制性消减杂交文库.以菌液PCR的方法检测随机挑选的白色菌落中插入片段的出现频率.提取14个重组质粒进行序列分析.结果:在消减文库中共获800个白色菌落,对随机挑选的160个白色菌落进行菌液PCR扩增,发现95%的白色菌落中含有100～700bp的插入片段.对重组质粒的序列分析和同源性比对发现,所获的14个序列中3个为已知基因,分别来自小鼠热休克蛋白、ribosomal protein S13、ethanol induced 6基因;4个可能来源于新基因;3个与3个不同的EST同源.结论:成功构建了高低淋巴道转移力小鼠肝癌细胞间抑制性消减杂交文库,为今后高通量筛选癌淋巴道转移相关基因,奠定了坚实的基础.

犬类喉肌是否存在相同结构的杂交纤维?--肌球蛋白重链同构体单纤维分析

牙龈卟啉单胞菌不同毒力株基因差异的比较研究

目的 比较牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis, P. gingivalis)高毒力株W83与低毒力株标准参考菌ATCC 33277之间的差异基因.方法 采用抑制消减杂交技术(SHH)对比牙龈卟啉单胞菌高毒力株W83与低毒力株标准参考菌ATCC 33277的基因差异.以高毒力株W83为被检菌, 低毒力株ATCC 33277为参考菌,将提取的基因组DNA用内切酶RsaⅠ酶切,连接特殊设计的接头进行两次消减杂交和PCR扩增,得到消减混合物,与TA克隆载体连接,转化到JM109中,建立消减文库,经PCR筛选鉴定阳性克隆,进而对部分片段进行测序和同源分析.结果 经SSH筛选鉴定得到36 个片段大小为88～372 bp 的阳性克隆基因片段.结论 从全基因角度研究牙龈卟啉单胞菌高毒力株W83与标准株ATCC 33277之间的分子遗传差异,为牙龈卟啉单胞菌致病基因的筛选及今后牙周病预防、诊治的靶标提供依据.

模拟失重下大鼠骨和骨髓中人重组骨形成蛋白-2的变化

目的研究模拟失重骨质和骨髓内人重组骨形成蛋白-2(Human recombination bone morphogeneticprotein-2,rhBMP-2)形态学的变化.方法选用SD大鼠,随机配对分为悬吊组和自由活动组(5只/组),实验期为14、28 d.组织标本行原位杂交.结果尾吊组大鼠骨质和骨髓内rhBMP-2的表达明显弱于对照组(P＜0.05);尾吊组14 d rhBMP-2的表达明显强于28 d(P＜0.05).结论大鼠后肢去负荷导致骨和骨髓rhBMP-2含量的降低.

乙型肝炎、丁型肝炎病毒联合诊断芯片制备的初步研究

目的制备联合检测乙型肝炎病毒(HBV)、丁型肝炎病毒(HDV)基因芯片并进行杂交验证.方法利用Primer Premier 5.0分别针对HBV、HDV基因保守区域设计多对PCR引物,扩增后的产物克隆至pMD18-T载体,提取阳性克隆质粒进行测序分析鉴定.用PixSys 5500芯片打印仪将PCR产物打印在氨基修饰的玻片上制备成检测芯片.样品荧光标记采用限制性显示(RD)技术,标记后进行杂交验证分析.结果序列分析表明,运用PCR技术得到的多个基因片段均属于HBV、HDV特异基因.杂交结果显示,敏感性、特异性、重复性等指标均佳.结论利用PCR扩增产物作为探针制备HBV、HDV联合诊断芯片是一种快速、简便的实用方法,有着广阔的应用前景;利用RD技术标记样品可提高多种肝炎病毒混合检测的敏感性.

一种新的人端粒相关蛋白T-STAR 的克隆及功能分析

目的筛选、鉴定新的人端粒相关蛋白,为进一步了解端粒酶全酶的结构、生物学功能及其作用机制奠定实验基础. 方法采用研究蛋白质间相互作用非常有效的分子生物学方法酵母双杂交技术、哺乳细胞双杂交技术进行人端粒相关蛋白分子的筛选、鉴定. 结果成功构建端粒酶催化亚单位诱饵融合蛋白表达载体pGBKT7-hTERT,无自身激活活性,pGBKT7-hTERT融合蛋白在酵母细胞AH109内有效稳定表达.以pGBKT7-hTERT为诱饵进行cDNA文库筛选,将阳性克隆质粒cDNA测序,同源性比较获得了已收录人cDNA序列T-STAR.成功构建真核表达载体pVP16-T-STAR、pM-hTERT, 证明T-STAR 与hTERT在哺乳细胞内发生相互作用.T-STAR mRNA在正常胃粘膜组织低表达,在胃癌细胞内高表达. 结论 T-STAR是人端粒相关蛋白新成员,可能参与酪氨酸蛋白激酶信号传递并通过介入hTERT的磷酸化或去磷酸化调节端粒酶的活性.

含亚甲基缩醛键的寡脱氧核苷酸的合成及杂交性质的初步研究

目的本文设计合成了一类新型混合骨架的寡脱氧核苷酸(MBO).方法 3′-O-(二苯膦酰氧)甲基缩醛核苷(1)在三甲基硅三氟甲磺酸酯(TMSOTf)条件下,与3′-位保护的脱氧核苷(2或6)缩合.得到的二聚(3)或三聚体(7)的5′-位经4,4′-二甲氧三苯甲基(DMTr)保护,3′-位与(2-氰乙基N,N-二异丙基)氯化亚磷酰胺缩合,然后应用标准固相DNA合成法掺入到寡核苷酸中.结果本文合成了6条带亚甲基缩醛键的寡核苷酸(ODN-II～ODN-VII),考察了它们的杂交性质,测定了与互补DNA的解链温度Tm值.结论此类寡核苷酸平均每个亚甲基缩醛键的修饰,解链温度Tm值下降约0.8～1.2 ℃,杂交亲和力与对照的天然磷酸二酯键的寡核苷酸相当.

HEK293细胞中细丝蛋白-C对α1A-肾上腺素受体介导细胞外信号调节激酶磷酸化作用的影响

目的寻找与α1A-肾上腺素受体(α1A-AR)相互作用的胞浆内非G蛋白,研究蛋白对受体信号转导的影响.方法应用酵母双杂交技术,以人α1A-AR胞浆内C末端(α1A-AR-CT)为诱饵,筛选人脑cDNA文库,用5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷(X-Gal)定性分析及邻硝基苯基β-D-半乳糖苷(ONPG)定量分析对筛选出的阳性克隆细丝蛋白-C(FLN C)进行确证.采用脂质体转染及蛋白免疫印迹技术探讨人胚胎肾293(HEK293)细胞中FLN C对α1A-AR信号转导通路的影响.结果①缺陷培养基筛选出FLN C的C末端部分片段可以与α1A-AR-CT在酵母中结合.②X-Gal定性分析中,FLN C与α1A-AR-CT的共转子菌落6 h即呈现蓝色,而对照菌落颜色无变化;经ONPG定量分析发现,FLN C与α1A-AR-CT的共转子中β-半乳糖苷酶的活性大约是对照的2～3倍(P<0.01).③编码FLN C的C末端片段的质粒瞬时转染于稳定表达全长α1A-AR的HEK293细胞中,可以明显增强去氧肾上腺素(10 μmol*L-1,30 min)激动α1A-AR介导的细胞外信号调节激酶(ERK1/2)磷酸化作用.结论 FLN C的C末端部分片段可以与α1A-AR-CT在酵母中结合,并且增强HEK293细胞中α1A-AR介导ERK1/2磷酸化的作用.