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HBV感染培养人胎肝细胞后差异应答基因的初步分离和鉴定
目的:建立培养人胎肝细胞感染HBV后差异应答基因的消减文库,并从中克隆鉴定出新的应答基因.方法:分别从HBV感染及未感染的胎肝细胞中提取总RNA,用SMART PCR技术合成全长双链cDNA,经RsaⅠ酶切后将感染细胞的cDNA分为两组,分别衔接两个不同的接头,再与未感染细胞的cDNA进行两轮抑制性杂交及两轮抑制性PCR,将产物与T/A载体连接构建成消减cDNA文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,挑取克隆进行筛选排除假阳性,再行序列分析,鉴定胎肝细胞感染HBV后的差异应答基因.结果:成功构建高效消减的HBV感染胎肝细胞cDNA文库,得到158个白色的克隆,随机选择了128个克隆经PCR扩增获得含有明确单一目的片断的克隆99个,长约100～400 bp,经筛选后得到70个克隆,测序表明有16个差异表达的基因,其中可能的新基因有5个.结论:用抑制性消减杂交技术成功建立了HBV感染培养人胎肝细胞的消减cDNA文库,为进一步大规模筛选HBV感染后的应答基因奠定了基础,初步筛选出的新基因片断为进一步研究宫内感染的分子机制提供了依据.
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MINT蛋白(1～365氨基酸)与Vav1相互作用及其位点的验证
目的: 明确MINT(Msx2-interacting nuclear target protein) N-末端与Vav1之间的相互作用,进一步探讨MINT的转录抑制调控功能及其机制.方法: 以克隆有MINT-F1片段(1～365氨基酸)的pGBKT7-F1质粒作为诱饵,分别与pACT2-V23#,pGADT7-V620,pACT2-V8900,pGADT7-SH2和pGADT7-SH3几个克隆有Vav1不同结构域的质粒,用酵母双杂交方法分析它们之间的相互作用.结果: pACT2-V23#与pGBKT7-F1之间、pACT2-V8900与pGBKT7-F1之间有比较明确的相互作用,而pACT2-V23#与pGBKT7-F2～F6、pGBKT7-F1与pGADT7-V620、pGADT7-SH2和pGADT7-SH3之间均无相互作用.结论: ① MINT N-端的F1段与Vav1发生相互作用;② Vav1与MINT的F1段发生相互作用的区域位于其SH2-SH3-C端结构域,而且独立的Vav1 SH2或SH3-C端结构域均不能发挥与MINT的F1段产生相互作用的功能.
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乙型肝炎病毒前S区不同片段在酵母双杂交系统中的表达及对报告基因激活作用的检测
目的用含乙型肝炎病毒(HBV)前S区不同大小的cDNA片段构建酵母双杂交诱饵载体,并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用. 方法 PCR扩增含HBV前S区不同大小的cDNA片段,分别克隆入pUC19质粒,经测序正确后,再分别亚克隆入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中. 将重组质粒导入酵母菌AH109,检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用. 结果成功获得含HBV前S区不同大小的cDNA片段,HBV前S区不同片段所表达的蛋白对酵母菌AH109无毒性,但是对报告基因均有激活作用. 结论不能利用酵母双杂交Gal4系统3来研究与HBV前S区相互作用的蛋白;证实了HBV前S区不同片段所表达的蛋白的自激活功能,为进一步研究乙型肝炎病毒致病机制打下了基础.
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肝癌细胞凋亡相关基因分析
目的克隆肝癌细胞凋亡相关基因,分析已知基因同源的cDNA序列,探讨三氧化二砷(As2O3)诱导肝癌细胞凋亡的分子机制. 方法用As2O3诱导人肝癌HCC-9204细胞凋亡,应用抑制性消减杂效技术克隆凋亡细胞中的差异表达cDNA,测序并与Genebank中的已知基因序列进行同源性比较. 结果克隆到18个与已知基因高度同源的cDNA序列,包括与抗氧化损伤、线粒体跨膜运输、细胞骨架系统相关的基因、细胞凋亡相关核蛋白PHLDA1基因、核糖体蛋白L37基因、溶酶体ATP酶基因以及与Ibd1、SMT3、DKFZP434J154 protein等基因高度同源的序列. 结论 As2O3诱导的肝癌细胞凋亡后,大量基因表达上调,这些基因大多与As2O3处理肝癌细胞后的应激反应和细胞凋亡有关,提示细胞凋亡是一个有多基因参与调控的复杂过程.
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鼻咽癌组织中EB病毒EBNA-2型的检测
0 引言 EB病毒是一种人类疱疹病毒,分为A,B 2型[1] ,两者在EBNA-2基因编码区的差异为显著[2]. 我们设计了一对扩增EBNA-2A和EBNA-2B基因的通用引物,合成并用地高辛标记分别针对A型和B型扩增片段特异的2种寡核苷酸探针,通过扩增产物与探针的杂交对EB病毒进行分型检测,并应用该方法来研究不同基因型的EB病毒与鼻咽癌的相关性.
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基因芯片及其医学应用研究进展
基因芯片(Gene chip),又称DNA芯片、DNA微阵列(DNA microarray),是将大量的DNA片段按预先设计的排列方式固化在载体表面如硅片、玻片,并以此为探针,在一定的条件下,与样品中待测的靶基因片段杂交,通过检测杂交后的信号,实现对靶基因信息的快速检测.基因芯片可以分为很多种类,常见并广泛应用的有cDNA微点阵和寡核苷酸原位合成.基因芯片能对微量样品中的核酸序列进行检测和分析,其高通量、快速、并行化采集生物信息的特点更是优于其他传统的技术方法.基因芯片技术以一种系统、整体的方法进行研究,打破了"一种疾病、一种基因"的陈旧模式,整体宏观的研究生物体基因的表达及功能.目前,基因芯片技术的应用领域主要有:基因表达谱分析、新基因的发现、基因突变及多态性分析、基因组文库作图、疾病诊断和分型、药物筛选、基因测序等.
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基因表达研究方法的进展
信使RNA的发现,遗传密码的破解,人们对蛋白质合成的基因调节有了更深入的理解,在此基础上提出了基因表达的现代概念.随之出现了全球性的基因表达研究的热点.在检测和定量分析基因表达水平的过程中,出现了很多种方法和技术,本文就Northern杂交法、S1核酸酶保护法、差减杂交技术、差异显示法、cDNA文库的序列测定、基因表达的系列分析、基因表达芯片等技术作一简要的综述.
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63例慢性乙肝e抗原阴性HBV基因多态性检测结果报告
用地高辛标记引物酶显色法,检测了63例e抗原阴性慢性肝炎HBV基因多态性.结果突变率为53.9%(34/63).前C/C区1896位突变率高为49.2%(31/63),1814位38.1%(24/63);BCP区1762位、1764位均为39.7%(25/63),552位突变率为14.3%(9/63).该检测方法灵敏度高,简便易行.严格控制杂交温度及显色温度是检测操作的关键.
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杂交手术在治疗主动脉夹层中的应用现状
主动脉夹层(AD)是指主动脉内膜自其附着的有病变的中层处破裂,在动脉血流进一步的冲击下,内膜自破裂处继续沿此层面扩大分离范围,致使分离的内膜将主动脉腔分隔成真腔和假腔.AD年发病率为5 ～10/10万,病死率1.5/10万,男女发病率之比为2.5:1[1].主动脉夹层是主动脉疾病中常见的致命性疾病,由于发病急,进展快,病死率极高,主动脉夹层的外科治疗往往十分复杂而且风险巨大.
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基因芯片技术在创伤骨科研究领域的应用进展
基因芯是将大量的DNA片段按预先设计的排列方式固化在载体表面,并以此为探针,在一定的条件下与样品中待测的靶基因片段杂交,通过检测杂交后的信号,实现对靶基因信息的快速检测.基因芯片可以分为很多种类,常见并广泛应用的有cDNA微点阵和寡核苷酸原位合成芯片.
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pBP-1对乳癌细胞体外生长的抑制作用
①目的探讨磷酸化胰岛素样生长因子结合蛋白-1(pBP-1)对乳癌细胞选择性生长抑制作用和对胰岛素样生长因子-1(IGF-1)调节机制.②方法以基因工程重组的人IGF-1和从孕妇羊水中纯化的磷酸化、非磷酸化的结合蛋白-1(pBP-1,npBP-1),自乳癌实体瘤手术标本中获取瘤细胞,应用细胞计数、MTT试验以及地高辛标记的IGF-1 cDNA探针做原位杂交和膜上斑点杂交试验,分别定性和定量测定各实验组中乳癌细胞生长和IGF-1 mRNA表达的动态变化.③结果 pBP-1组较对照组细胞生长慢、存活短、IGF-1 mRNA表达平均吸光度值低(F=9.50～31.08,P＜0.01).④结论 pBP-1在体外可抑制乳癌细胞生长,IGF-1 mRNA表达可能与pBP-1的调节抑制作用有关.
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肿瘤坏死因子基因和蛋白及受体在子宫内膜组织的表达
①目的探讨子宫内膜癌组织肿瘤坏死因子(TNF)基因和蛋白及受体的表达及意义.②方法分别采用非同位素原位杂交方法、免疫组化方法对48例子宫内膜癌组织TNF mRNA, TNF蛋白及TNF受体(TNFR)的表达进行检测.③结果子宫内膜癌组织中16例TNF mRNA呈阳性表达,均为间质的单个核细胞和平滑肌细胞,腺癌细胞无阳性表达,对照组未见阳性表达.15例病人TNF蛋白呈阳性表达,25例TNFR呈阳性表达,对照组子宫内膜腺体也有TNFR阳性表达,两组比较差异无显著性(χ2=2.45, P>0.05).TNF mRNA与TNF蛋白表达存在不一致性,TNF与TNFR表达与组织学分化及肌层浸润深度差异均无显著性(χ2=2.17, 0.81,P>0.05);TNFR蛋白表达明显高于TNF,两者比较差异有极显著性(χ2=4.29, P<0.05); TNFR在正常内膜表达与子宫内膜癌表达差异无显著性(χ2=2.45,P>0.05).④结论子宫内膜癌间质细胞能够表达TNF mRNA,并产生TNF蛋白.
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肝移植术后结肠息肉致CA19-9异常增高1例
CA19-9是Koprowski等［1］于1979年用人的结肠癌细胞株免疫BALB/c纯种鼠并与骨髓瘤进行杂交所得的一株编号为1116NS19-9的单克隆抗体，该抗体能与胃肠道肿瘤标志物有关的糖类抗原起反应，所识别的抗原被命名为糖类抗原CA19-9。CA19-9在消化道内含量高［2］。日本学者元雄良治等报道健康人和良性肿瘤患者血清CA19-9的阳性值宜取37.60 U/ml，恶性肿瘤患者宜取100 U/ml［3］。但是结肠息肉导致CA19-9异常增高的病例十分少见，现将本院收治的1例肝移植术后结肠息肉致CA19-9增高的病例报告如下。
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潮汕地区食管癌患者O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶基因多态性的分析
背景与目的:初步研究中国食管癌高发区之一潮汕地区食管癌患者和正常人群 O6-甲基鸟嘌呤 -DNA甲基转移酶 (MGMT)基因编码 84、 143及 160位密码子的单核苷酸多态性 (Single nucleotide polymorphism, SNP). 材料与方法: 应用双色荧光杂交微阵列技术分别检测潮汕地区 100例食管鳞状细胞癌患者及 65例健康对照外周血 MGMT基因 84位密码子 (C2740214T)单核苷酸多态性;用同样的方法检测 76例食管鳞状细胞癌患者和 50例健康对照 MGMT基因 143位密码子 (A2798995G)、 160位密码子 (G2799046A)单核苷酸多态性. 结果: 基因型分布符合 Hardy - Weinberg 定律.统计分析显示食管鳞状细胞癌组与对照组 84位密码子 2740214C和 2740214T等位基因频率差异无统计学意义 (P=0.402), 2740214CT基因型在病例组和对照组中所占的比例分别为 16%和 12.3%, 2740214TT基因型在病例组中所占的比例是 2%.食管鳞状细胞癌组变异基因型拥有者 (CT+ TT)高于对照组,但差异无统计学意义 (P=0.327), 2740214TT基因型仅见于个别肿瘤患者,而在正常对照中未发现. 143位密码子 A2798995G位点仅在对照组中发现一例杂合子,其余均为野生型纯合子,病例组与对照组基因型和等位基因频率差异均无统计学意义. 160位密码子 G2799046A位点检测在所有的病人和对照中均为野生型纯合子. 结论: 潮汕地区食管鳞状细胞癌患者和正常人群中存在 MGMT基因多态性, 84位密码子 C2740214T位点的突变型纯合子仅见于肿瘤患者,可能与食管鳞状细胞癌有关.
关键词： O6-甲基鸟嘌呤 -DNA甲基转移酶 单核苷酸多态性 杂交 食管癌 -
DNA芯片与法医生物物证检验
DNA芯片是把许许多多已知的某种或某类 DNA片段 ( 作为分子探针 ) 以阵列形式有序地点加在某种基质或载体上 , 形成分子探针的集群或矩阵 , 其中每个探针的位置是固定可寻的 , 犹如计算机的芯片一样 . 将被检测物质与芯片进行杂交 , 若其中含有与芯片中阵列 DNA序列相配对的 DNA片段时 , 通过检测手段把这些配对物检测出来 , 分析计算配对物的相对比率 , 就可以对被检物质做出检验或鉴定结论 . DNA芯片又称为 DNA微矩阵 (DNA microarray[1])或基因芯片 (Gene chips), 但作者认为不宜把 DNA芯片与基因芯片等同起来 , 因为基因芯片应是针对可表达的 DNA片段即外显子的 , 而 DNA芯片则是包括了可表达与不能表达的 DNA片段的全部 , 后面要提到的法医物证检验所用 DNA芯片使用的就是不能表达的 DNA片段即内含子 .
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分段杂交挂线术治疗蹄铁形肛瘘
我院采用分段杂交挂线术治疗蹄铁形肛瘘30例,疗效满意,现报告如下.
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DPYD基因芯片的制备及条件的优化
[目的]制备DPYD基因分型芯片,以该芯片为手段预测肿瘤病人对5-Fu的毒副作用.[方法]设计并合成探针、引物,制备基因芯片,提取人外周血中DNA,经PCR仪扩增后,与芯片上的探针杂交,并用扫描仪分析结果,部分结果经直接测序证明.[结果]成功制备了基因分型芯片,优化了制备条件,另外,构建了标准模板,并建立了分型标准.[结论]该基因芯片的灵敏性及准确性均可.
