肺炎链球菌临床分离株PBP2b基因序列分析及其应用探索

目的 通过分析肺炎链球菌PBP2b基因转肽酶编码区的序列差异,建立可区分对青霉素敏感肺炎链球菌(PSSP)与青霉素不敏感肺炎链球菌(PNSSP)的分子生物学方法.方法 检测青霉素对肺炎链球菌的低抑菌浓度(MIC),对菌株PBP2b转肽酶编码区进行PCR扩增和序列分析,根据序列差异设计相应引物和探针,并采用PCR-反向杂交方法区分PSSP与PNSSP.结果 43株肺炎链球菌(42株临床分离株及1株标准株)中8株为PSSP,30株为青霉素中介株(PISP),5株为青霉素耐药株(PRSP).经PBP2b基因限制性片段长度多态性分析(RFLP)及测序分析,PSSP与PNSSP(PISP+PRSP)存在谱型及序列差异.根据序列差异建立的检测方法可正确区分PSSP与PNSSP.结论 肺炎链球菌PSSP和PNSSP菌株的PBP2b基因转肽酶编码区之间存在可供鉴别的序列差异,据此可建立快速、特异的分子生物学方法,有望为该菌耐药基因的快速诊断提供客观依据.

丙型肝炎病毒非结构蛋白4A与钙离子信号调节亲环素配体的相互作用

目的 应用酵母双杂交技术及免疫共沉淀技术证实HCV非结构蛋白4A(HCV NS4A)与钙离子信号调节亲环素配体(CAML)的相互作用.方法 CAML编码基因进行克隆,并构建其酵母表达载体,在酵母细胞中与HCV NS4A进行回交验证后,构建HCV NS4A及CAML真核表达载体,转染293细胞,行免疫共沉淀实验及Western印迹检测.结果 成功克隆CAML基因,并构建CAML的酵母表达载体,在酵母细胞中回交验证HCV NS4A与CAML的相互作用,构建HCVNS4A及CAML的真核细胞表达载体,并利用免疫共沉淀技术验证了两者的相互作用.结论 CAML与HCV NS4A的相互作用可能对HCV感染细胞的钙离子浓度、细胞凋亡等生物过程产生影响,从而在HCV感染慢性化过程中发挥作用.

丙型肝炎病毒F反式调节靶基因反式激活基因的筛选和生物信息学分析

目的 构建丙型肝炎病毒(HCV)F反式调节靶基因FTP2的反式激活基因的cDNA文库,克隆FTP2反式激活基因.方法 以HCV FTP2表达质粒pcDNA3.1(-)-HCV FTP2转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并合成cDNA,经Rsa Ⅰ酶切后将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠埃希菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析.结果 成功构建人HCV FTP2反式激活相关基因差异表达的cDNA.扩增后得到56个200～1000 bp插入片段的克隆,随机挑选其中24个插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得20种编码基因,其中1个为未知功能的新基因.结论 筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、物质代谢和细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因.

不动杆菌感染的调查研究

不动杆菌是需氧,粗短或球形的革兰阴性菌,经DNA杂交可将其分为:醋酸钙不动杆菌、洛菲不动杆菌、溶血不动杆菌、鲍曼不动杆菌、琼不动杆菌和约翰逊不动杆菌.本菌广泛分布于外界环境,为机会性感染致病菌,常引起医院内感染,由于其对多种抗生素耐药,一旦感染,病情多较严重[1].

高脂喂养大鼠血清瘦素水平与肝脏瘦素受体mRNA的表达

与正常大鼠相比,肥胖大鼠血清瘦素升高(P＜0.05),而肝内瘦素受体mRNA表达降低(P＜0.05),两者呈负相关(r=-0.823,-0.827,均P＜0.05),提示肥胖大鼠高血清瘦素对瘦素受体mRNA表达有抑制作用.

基质溶素-1及其抑制剂在溃疡性结肠炎肠黏膜的过表达

近有报道提示溃疡性结肠炎(UC)活检组织有基质金属蛋白酶(MMP)的过表达.特别是基质溶素-1(MMP-3)在UC溃疡性病变组织中表达明显增加,而金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)的表达无明显变化,所以MMP-3和TIMP-1的比值增加可能是基质降解的原因,由此推断其在肠道黏膜损害中起关键作用,导致黏膜基质的降解[1].为进一步了解MMP-3在国人UC发病机制中的作用,本研究拟采用RT-PCR和Western杂交研究UC患者肠黏膜的MMP-3及其抑制剂TIMP-1的表达.

肝脏缺血-再灌注后热休克蛋白70mRNA的表达

目的:探讨缺血-再灌注后大鼠肝脏热休克蛋白(HSP)70mRNA的表达规律.方法:通过已建立的大鼠肝脏缺血-再灌注模型,应用人HSP 70cDNA,采用dot blot 杂交,观察缺血-再灌注后大鼠肝脏HSP 70mRNA的表达.结果:肝脏缺血15min,30min再灌注后没有HSP 70mRNA的表达,缺血60min再灌注2h伴有HSP 70mRNA的表达,高水平HSP 70mRNA的表达持续到再灌注12h,以再灌注4h表达水平为高.缺血120min再灌注2h,HSP 70mRNA升高,高水平表达维持4h,再灌注12h HSP 70mRNA消失.结论:肝脏缺血-再灌注后可以诱导HSP 70mRNA的表达,必要的缺血时间所造成的肝脏损伤是HSP基因激活的基础,再灌注期间氧自由基的释放可能是其表达增加的原因.

抑制性消减杂交技术筛选干扰素α转染HepG2细胞中上调的表达基因

目的:应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术筛选干扰素α(IFN-α)真核表达质粒转染HepG2细胞后差异表达上调的基因.方法:首先构建IFN-α真核表达载体pcDNA3.1(-)-IFN-α,并转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa Ⅰ酶切后,将实验组cDNA分成2组,分别与2种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制多聚酶链反应(PCR),将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增鉴定,进行测序及同源性分析.结果:构建了pcDNA3.1(-)-IFN-α真核表达质粒,并成功构建了该质粒转染HepG2细胞后差异表达基因的cDNA消减文库.文库扩增后得到200个白色克隆,随机挑取70个进行菌落PCR分析,结果显示均含有插入片段,将含有200～1000 bp插入片段的35个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得17种已知基因序列和1个染色体序列.结论:应用SSH技术成功构建了pcDNA3.1(-)-IFN-α转染的HepG2细胞中差异上调表达基因的cDNA消减文库.该文库的建立为进一步阐明IFN-α作用的分子生物学机制提供了重要的理论依据.

两种人乳头瘤病毒分型检测方法的比较

目的 通过比较PCR联合地高辛标记探针杂交法与实时荧光定量PCR法检测宫颈液标本中人乳头瘤病毒(HPV)感染的一致性,评价PCR联合地高辛标记探针杂交法的临床应用价值. 方法 将4型HPV(16、51、54和56)探针3′端加尾地高辛标记,检测标记探针的灵敏度和特异性.收集63例第二代杂交捕获(HC-Ⅱ)阳性和18例HC-Ⅱ阴性的宫颈液标本,采用HPV通用引物MY11/09对所有标本L1区基因序列进行PCR扩增,利用地高辛标记探针杂交法对PCR产物进行检测分型;同时利用实时荧光定量PCR对这81例标本进行检测,将两者的检测结果进行比较. 结果 地高辛标记探针杂交法检测出HC-Ⅱ阳性标本中HPV-16型40例,HPV-51型2例,HPV-56型2例,分别占HC-Ⅱ阳性标本的63.5%、3.2%和3.2%,HC-Ⅱ阴性标本中检测出HPV-16型1例;实时荧光定量PCR法检测出HC-Ⅱ阳性标本中HPV-16型39例,HPV-51型2例,HPV-56型2例,占HC-Ⅱ阳性标本的61.9%、3.2%和3.2%,HC-Ⅱ阴性标本中检测出HPV-16型1例;重复性检测显示两种方法检测4型HPV感染的变异系数(CV)为0～1.45%和0～1.50%,检测标本中4型感染的符合率为97.5% ～100%. 结论 PCR联合地高辛标记探针杂交法具有较好的灵敏度和特异性, 可能对于临床HPV分型检测有应用价值.

淡色库蚊溴氰菊酯抗性与敏感品系单蚊杂交群体的构建

目的 建立淡色库蚊溴氰菊酯抗性与敏感品系单蚊杂交群体,并对比观察杂交系与自交系的生物学特性,为鉴定抗性基因遗传多态性和遗传作图奠定基础.方法 正交组以抗性品系为母本交配敏感品系雄蚊,即R-S组；反交组以抗性品系雄蚊交配敏感品系雌蚊,即S-R组；对照为抗性品系和敏感品系自交,即R-R组和S-S组.观察比较4组产卵率、孵化率及各发育阶段成活率.WHO蚊幼虫浸渍法检测各组幼虫对溴氰菊酯的抗性水平.结果 产卵率:S-S组为94.44％,R-R组为100％,R-S组和S-R组分别为61.11％和72.22％；孵化率:S-S组和R-R组分别为94.12％和100％,R-S组和S-R组分别为36.36％和69.23％；各组幼虫成活率,成蛹率及羽化率均达到90％以上,无显著性差异；抗性水平:R-R组、R-S组和S-R组F2代的抗溴氰菊酯水平分别是敏感品系的53倍、29倍和10倍.结论 杂交群体F2代的抗性水平位于两亲本之间,符合遗传学规律.

"杂交手术"清除"炸弹"

反向斑点杂交法检测流感嗜血杆菌核酸

目的探讨早期、快速检测流感嗜血杆菌的方法.方法应用流感嗜血杆菌编码外膜蛋白特异的P6基因设计引物,通过聚合酶链反应合成特异探针,采用反向斑点杂交法检测生物素标记DNA,并应用于痰标本的检测.结果只有流感嗜血杆菌扩增出351 bp的DNA片段,该探针能检测出10 ng的细菌DNA,与其他细菌、病毒、真菌无交叉反应.该方法和培养法分别检测50份痰标本,两者的阳性率分别为30%和22%.结论该方法快速、特异,对流感嗜血杆菌感染有早期诊断价值.

膜微阵列技术的建立及检测细菌条件的优化

目的探讨膜微阵列技术检测细菌的可行性.方法在细菌的16S rRNA基因内设计了通用引物和特异性探针,将探针点在膜上制备微阵列,再与地高辛标记的DNA杂交,比较了随机引物标记法和PCR掺入标记法的灵敏度,探讨了硝酸纤维素膜和尼龙膜作基片的可行性,并比较了不同的固定条件和杂交条件下的杂交结果,以标准菌株DNA为样本,建立起微阵列技术.结果随机引物标记法和PCR掺入标记法的灵敏度均为0.1pg;尼龙膜较之硝酸纤维素膜可更好的结合寡核苷酸,经紫外线交联3 min,与杂交液3(5×SSC,5 g/L SDS,1%封闭剂)在55 ℃杂交结果好.标准菌株除结核杆菌、变形杆菌外,均能与其对应的特异探针杂交.结论利用膜微阵列技术检测细菌有快速、敏感、特异、无放射性污染的特点.

寡核苷酸芯片杂交技术对HBV DNA分型的研究

目的建立单碱基延伸(SBE)标记靶序列的方法,解决目前寡核苷酸芯片存在的空间障碍、特异性差、重复性差等问题.方法利用不同的方法标记靶序列或把已标记好的长片段靶序列片段化后,与寡核苷酸芯片进行杂交分析.结果用两种方法检测HBV DNA及分型,得到了相同的结果.结论以单碱基延伸(SBE)标记靶序列的方法重复性好,适用于病毒基因的检测及分型.

Eu标记RT-PCR检测丙型肝炎病毒RNA

目的采用一种新的铕螯合物BHHCT,制备高灵敏度荧光标记物,建立检测丙型肝炎病毒(HCV)RNA的方法.方法采用柱层析纯化的方法抽提血清中HCVRNA.以5＇端带有生物素的引物进行RT-PCR Tth酶一步法扩增,通过固定于微孔板上的捕获探针与带有生物素的PCR扩增产物杂交后,利用标记有铕的链霉亲合素与生物素的特异性结合,将铕连接到待测核酸上,在特定波长的激发光激发下发出荧光,进行检测.结果铕标记检测法与酶标法的变异系数、敏感性、特异性分别为10.43%、100%,100%与16.25%,94%,100%.结论Eu标记RT-PCR Tth酶一步法检测HCV RNA,具有敏感、特异、快速、重复性好、不受环境因素影响和无溴乙锭污染等优点,可望取代酶标法及电泳法.

应用DNA探针检测甲氧西林耐药葡萄球菌

目的 建立一种快速检测葡萄球菌和甲氧西林耐药葡萄球菌的斑点杂交技术.方法 设计金黄色葡萄球菌nuc基因、甲氧西林耐药mecA基因、葡萄球菌tuf基因的特异引物,用聚合酶链反应合成其特异DNA探针,并用生物素标记,分别与固定在硝酸纤维素膜上的标准菌株和临床分离株模板DNA杂交,观察其敏感性和特异性.结果 3对引物分别扩增出270 bp、310bp、370bp 3种DNA探针,均具有高度特异性.50株金黄色葡萄球菌tuf、nuc基因均为阳性,mecA基因阳性者22株.30株表皮葡萄球菌tuf基因均为阳性,nuc基因均为阴性,mecA基因阳性者9株.而其他非葡萄球菌与3种DNA探针杂交结果均为阴性.该方法可检测出1 ng细菌DNA.结论 斑点杂交技术检测耐甲氧西林葡萄球菌快速、有效,具有较高的应用价值.

两种DNA探针在肺炎链球菌DNA检测中的应用价值

目的研究寡核苷酸探针和长链DNA探针在肺炎链球菌检测中的诊断价值.方法合成肺炎链球菌特异的21 bp寡核苷酸探针和263 bp长链DNA探针并用生物素标记,两种探针分别与细菌全染色体DNA进行斑点杂交,比较两种探针检测痰液标本的敏感性和特异性,并与痰培养法比较.结果寡核苷酸探针和263 bp探针检测肺炎链球菌基因组DNA的敏感性分别是100ng和1 ng.培养法和杂交法同时检测100份痰标本,培养法、21 bp探针和263 bp探针的阳性检出率分别是7%、6%和17%.结论263 bp长链DNA探针是检测肺炎链球菌DNA的较佳选择.

新的迟缓爱德华菌溶血相关基因的检测

目的检测新的溶血相关基因(eha)在迟缓爱德华菌(ET)染色体上的分布.方法 PCR 扩增部分溶血相关基因,制成地高辛探针与26株ET菌进行斑点杂交和Southern blot.结果新的ET溶血相关基因以单拷贝形式存在于一部分ET菌染色体上,且这部分ET菌表型既有溶血 ,也有不溶血.结论有溶血表型又有溶血相关基因的ET菌的临床意义值得进一步研究.

抽提模板的温度和杂交温育方式对丙型肝炎病毒RNA检测的影响

逆转录聚合酶链反应-微孔板反向杂交法检测丙型肝炎病毒核酸(HCV-RNA)影响因素较多.本实验室通过对室温和低温条件下抽提HCV-RNA及不同杂交温育方式检测扩增产物的试验,探讨其对检测结果的影响.

蕈样肉芽肿T细胞抗原受体γ基因重排的研究

蕈样肉芽肿(MF)是一种低度恶性的皮肤T细胞淋巴瘤.淋巴细胞恶性增殖的主要特点是克隆性增殖,在T淋巴瘤表现为TCR的单克隆性重排,而绝大多数炎症及反应性淋巴细胞浸润则是表现为多克隆性的.根据此点,近十几年来,国外用Southern杂交或聚合酶链反应检测皮损的T淋巴细胞的克隆性,主要是检测TCR-β和γ基因重排.由于γ基因重排可出现在几乎所有的T淋巴细胞及T淋巴细胞瘤,且其结构相对简单,故与Southern印迹方法相比用聚合酶链反应(PCR)方法检测TCR-γ基因重排更简便易行,且检出阳性率较高.我们应用巢式PCR法检测福尔马林固定、石蜡包埋的MF患者皮损TCR-γ基因重排,探讨MF的单克隆性,以用于该病的辅助诊断.