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免疫沉淀法测定血清中与两种脂蛋白结合的γ-谷氨酰基转移酶活性及其诊断肝癌的价值
目的建立免疫沉淀法测定血清中与低密度脂蛋白及极低密度脂蛋白结合的γ-谷氨酰基转移酶活性(LDL-VLDL-GGT),并观察其在肝癌鉴别诊断中的价值.方法以抗载脂蛋白B抗体为沉淀剂,沉淀血清中LDL-VLDL-GGT,测定其活性,并对65例肝癌、53例肝硬化、32例慢性肝炎病人及75名正常人进行检测分析.结果抗载脂蛋白B抗体能很好地沉淀血清样品中的LDL和VLDL,该方法批内精密度CV值为3.6%～8.2%,批间精密度CV值为5.5%～9.8%.在0～587 U/L范围内线性良好.以10 U/L为临界值,其对肝癌的诊断敏感性达86.2%,肝癌与肝硬化及肝癌与慢性肝炎鉴别诊断的特异性分别为67.9%和81.3%.结论本法检测血清LDL-VLDL-GGT活性对鉴别肝癌与其他肝病具有重要意义.
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免疫共沉淀联合液相色谱串联质谱技术应用于精子膜蛋白筛选
目的 为了揭示免疫性不育的机制,研究通过免疫共沉淀联合液相色谱串联二级质谱技术筛选与抗精子抗体(ASA)结合的精子膜蛋白.方法 病例对照研究.选取2015年9至12月在中国人民解放军总医院生殖中心门诊就诊的不明原因不孕症血清标本521份,采用ELISA试剂盒进行ASA阳性血清的筛选,再应用混合抗球蛋白试验对ASA阳性血清进行确认,得到ASA阳性血清标本56份作为疾病组,同时选择在该院临床检验科正常查体的血清ASA阴性的已正常生育过的健康人血清标本31份作为对照组.选取2016年1至4月在中国人民解放军总医院行正常查体男性志愿者精液标本48份,混合后提取精子膜蛋白.进行免疫共沉淀反应,精子膜蛋白分别与ASA阳性血清、ASA阴性血清孵育后,同时加入蛋白A/G(protein A/G)孵育,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳对免疫沉淀复合物进行分离,切胶酶解后,进行液相色谱串联二级质谱分析,得到相应的蛋白编码.通过UniProt数据库检索查找这些蛋白的名称、生物学功能、细胞定位等信息.结果 筛选出ASA阳性不育患者血清56份(女39例、男17例),ASA阴性正常生育者31例(女17例、男14例).共鉴定出40种相关蛋白,可分为3组蛋白,分别是:仅与正常组血清相结合的蛋白(11种);既与正常组血清结合,也与ASA阳性不育组血清结合的蛋白(14种);仅与ASA阳性不育组血清结合的蛋白(15种).这15种蛋白分别是精子阳离子通道蛋白1,精子阳离子通道蛋白3,精子阳离子通道蛋白4,精子相关抗原9,载脂蛋白A-I,轴丝动力蛋白重链14,多波段多肽-2,精卵融合蛋白4,硫氧还蛋白结构域蛋白2,含有蛋白H的IQ域,含有蛋白F1的IQ域,精子发生相关蛋白5,精子发生相关蛋白5样蛋白1,精子顶体膜相关蛋白1,E3泛素蛋白连接酶RNF114.结论 利用免疫共沉淀联合液相色谱串联二级质谱分析技术筛选出15种免疫性不育相关的候选蛋白,可能对揭示免疫性不育病因有重要意义.
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Survivin mRNA反义寡核苷酸诱导胰腺癌细胞凋亡
目的:用反义寡核苷酸(ASODN)封闭胰腺癌细胞中Survivin基因的表达,研究其诱导细胞凋亡的作用及其机制.方法:用脂质体介导SurvivinASODN转染人胰腺癌细胞株SW1990细胞,用Annexin V-FITC/PI复染、流式细胞术检测及电镜术观察凋亡,激酶活性检测法测定细胞内caspase-3活性变化,免疫沉淀法测定细胞内丝裂原活化蛋白激酶p38(p38MAPK)活性的变化早期细胞变化情况.结果:脂质体介导SurvivinASODN转染胰腺癌细胞后细胞内p38MAPK及caspase-3活性较对照组明显升高(55.3% vs2.9%,3.2%,4.5%,4.8%respectively,P＜0.05).细胞出现典型的凋亡形态学特征,细胞凋亡率较对照组明显增加(8.81±1.33vs47.87±2.91,and 14.73±1.36 vs 23.47±3.61,P＜0.05).结论:脂质体介导转染Survivin ASODN可以诱导细胞激活,诱导活化进而诱导细胞发生凋亡.
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代谢性谷氨酸受体5变构调节剂对β淀粉样蛋白寡聚体引起细胞毒性影响的研究
目的 研究代谢性谷氨酸受体5 (mGluR5)变构调节剂对细胞型朊蛋白(PrPc)免疫共沉淀效应的影响,筛选能有效阻断β淀粉样蛋白寡聚体(Aβo)细胞毒性信号化合物.方法 人胚胎肾293细胞进行培养,按照加入mGluR5变构剂的不同,随机分为8组,分别为:对照组、3-[(2-甲基-4-噻唑基)乙炔基]吡啶盐酸盐(MTEP)组、6-甲基-2-(偶氮苯基)-3-羟基吡啶(SIB)组、S-(4-氟苯基)-{3-[3-(4-氟苯基)-5-(1,2,4)-恶二唑基]-1-哌啶基}-甲酮(ADX-47273)组、二羟基苯基甘氨酸(DHPG)组、6-甲氧基-N-(4-甲氧基苯基)-4-喹唑啉铵盐酸盐(LY-456236)组、4-丁氧基-N-(2,4-二氟苯基)苯甲酰胺(VU-0357121)组、3,3'-二氯二苯甲醛双腙(DCB)组,利用转基因技术及免疫共沉淀技术,研究上述不同的mGluR5变构调节剂对PrPc和mGluR5的免疫共沉淀的影响.结果 MTEP组、SIB组的prPc(30.87±2.65、40.25±3.21 vs 100.00±0.00,P＜0.05)和mGluR5(30.12±4.23、51.67±7.09 vs 100.00±0.00,P＜0.05,P＜0.01)免疫共沉淀较对照组均明显减少(P＜0.01),其中MTEP对免疫共沉淀的抑制强.ADX-47273组、DHPG组、LY-456236组和VU-0357121组的PrPc和mGluR5免疫共沉淀较对照组均明显增加,其中DHPG组对免疫共沉淀信号增强效应强.结论 负性变构调节剂MTEP能减弱Aβo的细胞毒性信号向细胞内传递,可能为阿尔茨海默病治疗的药物.
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免疫共沉淀联合质谱分析筛选结直肠癌组织中GPAA1相互作用蛋白的初步研究
目的 通过筛选结直肠癌组织中GPAA1相互作用蛋白以探讨GPAA1及其相互作用蛋白在结直肠癌增殖、侵袭、转移过程中的作用.方法 利用免疫共沉淀技术筛选新鲜结直肠癌原发灶组织标本中GPAA1相互作用蛋白;利用MALDI-TOF/TOF-MS质谱分析技术分析鉴定GPAA1相互作用蛋白,质谱数据用Mascot软件在NCBInr数据库内进行检索,通过生物信息学分析GPAA1及其相互作用蛋白在结直肠癌增殖、侵袭、转移过程中的作用.结果 通过免疫印迹检测发现结、直肠癌原发灶组织中均有GPAA1蛋白表达,大小在70 kD和62 kD之间.质谱分析筛选出5个与GPAA1相互作用蛋白,包括:PHD finger protein 10(PHF10)、促凋亡蛋白Bcl-2 修饰因子、Bcl-2-related protein A1(Bcl-2A1)、Microtubule-associated protein 6(MAP6)、β1,4-半乳糖基转移酶.结论 利用免疫共沉淀联合质谱分析技术成功筛选出GPAA1相互作用蛋白,GPAA1可能通过Bcl-2家族蛋白相互作用,从而阻断程序性凋亡过程促进结直肠癌细胞增殖,生长.
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人瘢痕疙瘩成纤维细胞中CASK/Id1通路的初步研究
目的 验证人瘢痕疙瘩成纤维细胞中钙/钙调蛋白依耐性丝氨酸蛋白激酶(calcium/calmodulin dependent serine protein kinase,CASK)/分化抑制因子1(inhibitors of differentiation 1,Id1)通路的存在及意义.方法 通过免疫荧光激光共聚焦证实瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞中CASK和Id1蛋白表达和定位;RT-PCR和Western-blot分析瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞中CASK和Idl的表达和差异;通过免疫沉淀验证瘢痕疙瘩成纤维细胞中CASK和Idl蛋白的天然结合.结果 正常情况下体外培养的瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞中均存在CASK和Id1蛋白的表达,CASK和Id1主要分布在成纤维细胞胞浆和胞核中;RT-PCR结果表明瘢痕疙瘩组CASKmRNA的表达量为0.658±0.024,低于正常对照组的I.076±0.008(t=11.159,P＜0.05);Id1的表达量为0.497±0.014,高于正常对照组的0.307±0.017(t=15.148,P＜0.05);Western-blot结果表明瘢痕疙瘩组CASK蛋白的表达量为0.057±0.006,低于正常对照组的0.168±0.012(t=13.524,P ＜0.05);Idl的表达量为0.812±0.035,高于正常对照组的0.368±0.031(t=16.356,P＜0.05);免疫沉淀结果显示,CASK沉淀物中能检测到Id1,Id1沉淀物中能检测到CASK,CASK和Id1在瘢痕疙瘩成纤维细胞中存在天然结合.结论 可能存在CASK/Id1信号通路参与了瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖,这与瘢痕疙瘩的发生存在一定联系.
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基于全基因组水平的维吾尔族多囊卵巢综合征患者卵巢组织的特异性甲基化谱改变
目的 在全基因组水平上,探讨维吾尔族多囊卵巢综合征(PCOS)患者卵巢组织的特异性甲基化谱改变.方法 选择2014年5月至2016年6月,于喀什地区第一人民医院进行诊治的60例维吾尔族PCOS患者的卵巢组织(PCOS组)及60例维吾尔族卵巢囊肿患者的正常卵巢组织(对照组)为研究对象.采用甲基化DNA免疫共沉淀结合芯片(MeDIP-chip)技术,对2组卵巢组织的基因组DNA进行全基因组胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(CpG)岛和启动子区域甲基化扫描.将MeDIP-chip结果中,峰值得分≥2的区域,判定为阳性甲基化区域,以筛选甲基化基因;对PCOS卵巢组织峰值得分≥5的特异性高甲基化基因,进行基因本体(G())分析及Pathway分析,以探讨这些特异性高甲基化基因对机体相关功能的影响.对2组卵巢组织的甲基化谱差异,采用配对t检验及x 2检验进行统计学比较.本研究遵循的程序符合2013年修订的《世界医学协会赫尔辛基宣言》的要求,所有受试者均自愿参加本研究,并签署知情同意书.结果 ①MeDIP-chip结果显示:PCOS组全基因组CpG岛和启动子的甲基化率,分别为12.9％(3 633/28 226)和3.8％(687/18 028),对照组分别为13.3％(3 759/28 226)和3.6％(643/18 028).2组卵巢组织全基因组整体甲基化水平,以及甲基化片段在基因组各区的分布比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).②2组卵巢组织全基因组转录调控区的上游调控区和核心启动子区域甲基化水平比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).PCOS组转录调控区的基因编码区甲基化水平为(3.14±0.21),显著低于对照组的(3.96±0.23),并且差异有统计学意义(t=2.653,P=0.010).③2组卵巢组织全基因组高甲基化启动子的高-CpG含量启动子(HCP)、中-CpG含量启动子(ICP)及低-CpG含量启动子(LCP)的分布比较,差异有统计学意义(x2=3.208,P=0.002),其中PCOS组卵巢组织全基因组HCP比例高(40.1％),对照组HCP比例则低(13.3％).PCOS组卵巢组织全基因组HCP甲基化水平为(0.68±0.08),低于对照组的(0.71±0.09),而ICP及LCP甲基化水平分别为(0.74±0.13)和(0.76±0.11),则高于对照组的(0.61±0.07)和(0.32±0.03),并且差异均有统计学意义(t=1.686,P=0.049;t=1.992,P=0.028;t=3.361,P=0.002).④GO分析及Pathway分析结果显示:维吾尔族PCOS患者卵巢组织的特异性高甲基化基因,主要参与受体结合、蛋白质结合、激素活性、转录调节活性、转录因子活性和DNA结合等过程.结论 维吾尔族PCOS患者卵巢组织的基因编码区甲基化水平,较正常卵巢组织低;全基因组高甲基化启动子的HCP比例高,但是甲基化水平较正常卵巢组织的低,ICP及LCP的甲基化水平,较正常卵巢组织的高.这些特异性甲基化改变,可能与维吾尔族女性的PCOS发生、发展有关系.
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喉癌Hep2细胞凋亡调控中HLA-B的作用机制
目的:探讨人类白细胞抗原B(HLA-B)在喉癌Hep2细胞凋亡调控中的作用机制.方法:免疫共沉淀结合蛋白质印迹技术鉴定HLA-B与S100结合蛋白A8(S100A8)、S100A8与S100A9及HLA-B与S100A9在体外发生相互作用的情况,免疫细胞化学对HLA-B、S100A8和S100A9在Hep2细胞中的表达进行定位,同时验证三者之间可能的关系;进一步应用RNA干涉技术,通过Real-timePCR及蛋白质印迹评估相互作用基因的表达情况.结果:Hep2细胞中HLA-B和S100A8蛋白在体外存在相互作用,而S100A8和S100A9并没有以异源二聚体的形式存在.免疫细胞化学结果显示,Hep2细胞中S100A8蛋白主要表达于细胞质中,HLA-B主要定位于细胞质和细胞膜上,而S100A9蛋白主要分布于细胞核中.另外,与转染PBS及无义小分子干扰(siRNA)组相比,RNA干涉HLA-B基因能明显下调S100A8 mRNA和蛋白的表达水平,F值分别为553.024、603.582,P值均为0.000;而RNA干涉S100A8基因对HLA-B mRNA和蛋白表达变化无显著影响,F值分别为1.266、1.087,P值分别为0.348、0.395.结论:HLA-B与S100A8相互作用,部分通过调节S100A8/Bcl-2的表达而激发喉癌Hep2细胞凋亡发生.中华肿瘤防治杂志,2011,18(9):659-662
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唑来膦酸对破骨细胞分化中Ca2+/钙调蛋白赖性蛋白激酶Ⅱ与钙调蛋白结合及下游基因表达的影响
目的 探讨唑来膦酸对破骨细胞分化中Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,CaMKⅡ)与钙调蛋结合及下游活化T细胞核因子c1(nuclear factor of activation of T cells-1,NFATc1)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)基因表达的影响,探索其抑制破骨细胞分化的分子机制.方法 将小鼠RAW264.7细胞分为A、B两组,每组均以5x103个/孔接种于直径为30 mm的培养皿中培养.A组(对照组)在NF-κB受体激活蛋白配体(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)诱导下向破骨细胞形成,B组(唑来膦酸组)在RANKL诱导培养1d后加用1×10-6mol/L唑来膦酸处理2d.应用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)及反向Co-IP对CaMKⅡ与钙调蛋白的结合进行分析;应用蛋白质印迹法及免疫荧光细胞化学检测两组NFATc1、TRAP蛋白表达,并对破骨细胞生成进行评价.结果 B组新生多核破骨细胞数、牙本质吸陷窝数和面积分别为(11.3±1.5)个、(8.7±2.1)个和(5 034.4±775.4) μm2,均显著低于A组[分别为(37.7±5.7)个、(23.0±4.0)个和(15 042.7±1 906.0) μm2](P＜0.01).Co-IP及反向Co-IP检测显示,B组CaMKⅡ与钙调蛋白的结合较A组分别显著下降了59.8％和50.9％(P＜0.01);在总蛋白中,B组钙调蛋白与CaMKⅡ蛋白较A组,分别显著降低了52.1％和51.5％(P＜0.01).NFATc1、TRAP蛋白水平B组较A组显著下降了52.4％和38.9％(P＜0.01);免疫荧光化学检测也显示B组蛋白表达强度较A组弱.结论 唑来膦酸可以显著抑制破骨细胞分化中CaMKⅡ与钙调蛋白的结合,并下调下游NFATc1、TRAP的蛋白表达.
关键词： 钙-钙调蛋白依赖性蛋白激酶2 钙调蛋白 唑来膦酸 免疫沉淀法 -
肿瘤细胞表面抗原的单克隆抗体-免疫沉淀筛选法
目的 筛选新的肿瘤特异性抗原,为探索新的肿瘤诊断标志物和肿瘤疫苗奠定基础.方法 将人宫颈癌细胞系Hela细胞免疫BAKLB/c小鼠,制备杂交瘤,应用杂交瘤培养上清对人结肠癌细胞系Golo205、人Burkitt淋巴瘤细胞系Raji等细胞进行红细胞花环形成实验以筛选阳性杂交瘤.应用Golp205、Raji、人肺癌细胞系PLA801、人胃癌细胞系7901、人T细胞白血病细胞系Jurkat、小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0等肿瘤细胞系、胚胎细胞系人胚肾上皮细胞系293T、人脐静脉内皮细胞系ECV304和健康人外周血单个核细胞(PBMC)等对所筛选的单克隆抗体进行活细胞免疫荧光染色和流式细胞仪鉴定单克隆抗体对多种细胞系膜表面天然抗原的识别情况,同时应用免疫沉淀法和Western blotting检测所筛单克隆抗体对细胞膜抗原的识别.结果 采用红细胞花环形成实验从制备的抗体中成功筛选出3株单克隆抗体,流式分析显示其可同时识别Hela、293T、ECV304、Raji和Colo205细胞,但却不能识别Jut-kat、PLA801、7901、SP2/0细胞以及静止或活化的人PBMC.Western blotting证实这3株抗体可识别表达于Heh、Raji细胞膜的分子量约为47kD的膜蛋白.结论 成功地制备了3株可识别肿瘤抗原候选分子的mAb,为筛选和鉴定肿瘤特异性抗原提供了有力手段.
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泛素连接酶Smurf1促进Smurf2的Nedd化修饰
目的 探讨泛素连接酶Smad泛素化相关因子2(Smad ubiquitination-related factor 2,Smurf2)Nedd化修饰的机制.方法 梯度过表达Nedd8检测Smurf2的蛋白水平变化,免疫共沉淀(IP)和Western印迹分析Smurf2的Nedd化修饰,GST融合蛋白沉降技术(GST-pulldown)验证相互作用,分析Smurf1 C426A基因敲入(knock in)小鼠体内Smurf2在淋巴、脾、肝和肺组织的蛋白表达水平.结果 Smurf2可发生Nedd化修饰,过表达Nedd8可导致Smurf2蛋白水平下调,Smurf1和Smurf2能相互作用,且Smurf1可使Smurf2的Nedd化修饰增强.在Smurf1 C426A基因敲入小鼠的组织细胞中Smurf2蛋白水平上调.结论 Smurf1能促进Smurf2的Nedd化修饰.
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采用IP-XL/MS技术研究SGC7901胃癌细胞中EGFR信号通路动态变化
目的 研究胃癌细胞在表皮生长因子(EGF)刺激下表皮生长因子受体(EGFR)相互作用蛋白的时序性变化.方法 筛选高表达EGFR的胃癌细胞系;EGF刺激不同时间后,利用甲醛固定免疫沉淀联合质谱(IP-XL/MS)技术对胃癌细胞中EGFR相互作用蛋白表达谱进行无标定量,捕获EGFR网络的动态变化.结果与结论 8种胃癌细胞系中,SGC7901细胞表达EGFR量高. 4次生物学重复实验,共鉴定到3728个蛋白,625个EGFR相互作用蛋白,包括已知的相互作用蛋白( GRB2、CBL、SHC1 等) ,并发现59 个新蛋白( ANKFY、LGR4、SNX3、VPS26 A、ZFYVE20等). ANOVA检验分析得到406个响应EGF刺激的差异表达蛋白,根据动力学变化可分成5个簇,其具有不同的生物学功能,如蛋白转运、內吞、囊泡循环和蛋白酶体输运等,共同参与EGFR信号传递的动态调控,交叉调节多条信号通路.
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CLIP相关技术的研究进展
在真核生物基因表达的转录后调节中，RNA结合蛋白（ RBP）起着关键作用，很多RBP的异常与人类疾病的发生密切相关。自2000年的RNA免疫沉淀和芯片分析方法（ RNA immunoprecipitation with differential display or microarray analysis ， RIP-ChIP）出现以来，人们开始就RBP与RNA相互作用进行了系统而广泛的研究。经过改良和发展，基于体内实时紫外交联免疫沉淀法（ ultraviolet crosslinking and immunoprecipitation ， CLIP ）、交联免疫沉淀cDNA文库高通量测序法（ high-throughput sequencing of CLIP cDNA library ， HITS-CLIP）、光催化核糖核苷增强交联和免疫沉淀法（ photoactivatable-ribonucleoside-enhanced crosslinking and immunprecipitation ， PAR-CLIP）以及提高个别核苷酸分辨率交联和免疫共沉淀法（ individual nucleotide resolution CLIP ， iCLIP）等RIP-ChIP衍生方法相继产生，使用这些方法，可以解析RBP的RNA识别特异性，而且通过与高通量测序技术结合，可以实现转录组尺度的RBP的靶序列的鉴定，分辨率也得到极大提高。该文就RNA与蛋白的相互作用的基本原理及其研究进展、相关技术存在的问题以及发展趋势进行简要综述。
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前列腺特异性抗原的基础研究进展
前列腺特异性抗原(Prostate-specific antigen,PSA)于1971年由Grim从人精浆中提取,Hara首先描述,1979年Wang等用免疫沉淀法成功地从人前列腺组织中将其分离出,并认识到它在前列腺癌中的重要性.以后的研究发现,尽管正常男性血清中PSA浓度很低,但通过免疫学检测方法仍能被测出,而且大多数前列腺癌患者血清中PSA水平超过正常值.由于PSA的特异性和敏感性已成为比酸性磷酸酶更为重要的前列腺癌肿瘤标记物,所以它的应用亦日趋广泛.本文就PSA某些基础方面的研究做一综述.
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缩宫素受体主要存在形式的研究
目的 研究缩宫素受体(oxytocin receptor,OTR)在体外培养细胞中及动物组织中的主要存在形式,为进一步研究OTR多聚化的部位及多聚化在OTR功能调节中的作用提供依据.方法 取体外培养的中国仓鼠(CHO)细胞中表达的OTR及大鼠不同的组织,分别用anti-OTR抗体进行免疫沉淀及免疫印迹,观察得到的OTR条带的情况;分别在样品中加入还原剂DTT,再进行免疫印迹,观察得到OTR条带的大小与数量.结果 在体外培养的细胞中检测到OTR的多聚体,在大鼠的组织中同样也检测到OTR的多聚体.表明在动物体内,OTR也是以多聚体形式存在,跟体外细胞表达的OTR形成的多聚体不同的是,在动物体内的OTR多聚体主要以四聚体为主,而二聚体、三聚体量很少,特别是三聚体,几乎没有.OTR的多聚体可被还原剂DTT还原为单体形式.结论 OTR形成的多聚体是一种同源多聚体,此种多聚体中的单体是由共价键连接,而这种共价键常见的是半胱氨酸残基间形成的二硫键,因此推测半胱氨酸残基是OTR多聚体形成的关键残基.
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白塞病相关自身抗原Kinectin的表达型cDNA文库筛选与鉴定
目的研究白塞病患者血循环中的自身抗体及其针对的细胞内靶抗原.方法应用免疫印迹-化学发光法对39例白塞病患者血清进行初步研究,以含有高滴度抗体的患者血清作为"探针"免疫筛选表达型λZAP噬菌体cDNA文库并鉴定候选克隆,通过真核转录、翻译以及免疫沉淀实验分析阳性克隆表达产物的抗原性.结果文库筛选获得6个独立候选克隆,均为人Kinectin部分全长cDNA,以其中大克隆的基因表达产物为抗原基质的免疫沉淀研究显示,23.1%(9/39)的白塞病患者血清呈阳性反应,正常人以及系统性红斑狼疮、干燥综合征患者对照阴性.结论Kinectin是白塞病相关自身靶抗原;抗Kinectin抗体与白塞病免疫发病机制的关系值得深入探索,抗体可能对疾病具有潜在血清学诊断价值.
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免疫沉淀法分离血清APO-B在慢性丙型肝炎与脂代谢研究中的应用
目的:为研究西安地区慢性丙型肝炎(HCV)感染与脂代谢关系而探讨脂质简便分离技术的可行性. 方法:以羊抗人APO-B抗血清沉淀并分离HCV抗体阳性者血清APO-B,再以PCR技术进行扩增检测APO-B中HCV-RNA,并作血清HCV-RNA检测及HCV抗体阴性组对照.结果:在HCV抗体阳性者血清APO-B实验组中,检出了HCV-RNA,且拷贝数占血清中HCV-RNA的较大比率(4.74% ～ 27%),而各对照组中没有HCV-RNA表达.结论:免疫沉淀法分离血清APO-B的实验方法是一项传统的成熟技术,操作方便稳定可靠,实验结果进一步支持和证实了HCV与LDL结合的密切关系.
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天疱疮的自身抗原及血浆置换疗法的应用
200年前,一种在外观正常皮肤上反复出现水疱的疾病被命名为天疱疮.1950年Lever通过对患者病变皮肤的病理研究第一次将其分为天疱疮和类天疱疮;1960年Jordon和Beutner发现了抗细胞间物质的IgG型自身抗体,从而明确了天疱疮是一种自身免疫性疾病.20世纪70～80年代Sehiltz、Hashimoto、Anhalt等通过体外的皮肤器官培养及动物实验证明了自身抗体可以诱导水疱的形成,同时Stanley等应用免疫沉淀法得到了天疱疮自身抗原的分子量.进入20世纪90年代天疱疮自身抗原的cDNA被成功克隆,明确了天疱疮自身抗原为细胞间的粘附因子.21世纪的主要的研究方向为①应用分子生物学的方法,表达得到重组的天疱疮自身抗原,以确立新的诊断方法;②致力于特异性治疗方法的开发研究;③制作能够持续产生病态自身抗体的动物模型,从细胞及分子水平阐明自身抗体的产生机制.
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结直肠癌细胞中RAD18与FANCD2蛋白相互作用的实验研究
背景：范可尼贫血（ FA）通路作为DNA交联损伤修复的主要通路在维持染色体稳定性方面起重要作用。近年来，有关FA通路在DNA损伤以及肿瘤发病机制等方面的研究越来越多。目的：研究人结直肠癌细胞株SW480中RAD18蛋白与FANCD2蛋白是否存在相互作用。方法：应用免疫共沉淀法沉淀抗原抗体复合物；应用蛋白质印迹法检测复合物中兔抗人FANCD2和RAD18蛋白的表达。将GST-RAD18和GST质粒分别转化到BL21细菌中诱导目的蛋白表达，提取细菌总蛋白，以GST琼脂糖珠结合GST-RAD18蛋白，与SW480细胞裂解液孵育后，加入兔抗人FANCD2抗体，进行蛋白质印迹检测。结果：在利用FANCD2抗体沉淀下来的复合物中可检测到RAD18蛋白，且在利用RAD18抗体沉淀下来的复合物中可检测到FANCD2蛋白；GST-RAD18蛋白作诱饵蛋白时可以捕获SW480细胞中的FANCD2蛋白。结论：RAD18蛋白与 FANCD2蛋白在 SW480细胞内存在相互作用；GST-RAD18蛋白与FANCD2蛋白也存在相互作用。
关键词： 结直肠肿瘤 细胞 范可尼贫血互补群蛋白质D2 免疫沉淀法 -
丙型肝炎病毒非结构蛋白4A与钙离子信号调节亲环素配体的相互作用
目的 应用酵母双杂交技术及免疫共沉淀技术证实HCV非结构蛋白4A(HCV NS4A)与钙离子信号调节亲环素配体(CAML)的相互作用.方法 CAML编码基因进行克隆,并构建其酵母表达载体,在酵母细胞中与HCV NS4A进行回交验证后,构建HCV NS4A及CAML真核表达载体,转染293细胞,行免疫共沉淀实验及Western印迹检测.结果 成功克隆CAML基因,并构建CAML的酵母表达载体,在酵母细胞中回交验证HCV NS4A与CAML的相互作用,构建HCVNS4A及CAML的真核细胞表达载体,并利用免疫共沉淀技术验证了两者的相互作用.结论 CAML与HCV NS4A的相互作用可能对HCV感染细胞的钙离子浓度、细胞凋亡等生物过程产生影响,从而在HCV感染慢性化过程中发挥作用.
