首页 > 文献资料
-
小鼠胎肝和骨髓细胞基因表达差异的比较研究
造血发育经历了从卵黄囊到胎肝、胎脾并终定位于骨髓的复杂过程.虽然已有部分研究发现决定这一迁移过程的重要因素是造血微环境,但缺乏对不同造血器官微环境差别的系统性比较研究.为了探讨胎肝与成年骨髓造血微环境差别的分子基础,对小鼠胎肝和骨髓细胞RNA进行cDNA微阵列(cDNA microarray)杂交,以生物信息学方法分析杂交结果,并以RT-PCR和Northern blot对杂交结果进行进一步验证.结果表明,在588种具有重要功能的已知基因中,二者相比,骨髓高表达的基因有65种,胎肝高表达的基因有131种.进一步分析发现骨髓高表达的基因中与造血相关的基因有39种,胎肝高表达的基因中与造血相关的有71种,分别占差异基因群的60%和54%.RT-PCR和Northern blot验证的结果表明,CD18、CD44及PSGL-1基因在骨髓中高表达而在胎肝中低表达或不表达,此结果与微阵列杂交结果相符.同时还发现,CD18和CD44基因在胎肝中的表达水平随胎龄增加呈下调趋势.结论:胎肝与骨髓细胞的基因表达谱显著不同,其中某些基因的表达随发育阶段不同而变化.这些基因的差异性表达,尤其是与造血细胞发育、迁移、植入等密切相关基因的差别性表达,可能是胎肝造血兴衰、不同组织造血干细胞性能差别及影响不同造血组织来源的造血干细胞在骨髓植入的分子基础.
-
大鼠肝癌细胞与胚胎肝细胞microRNA差异表达谱的研究
目的 建立大鼠肝癌细胞与大鼠胚胎肝细胞microRNA(miRNA)表达的差异谱,为研究miRNA在肝细胞癌变发生机制中的作用提供新线索.方法 化学致癌剂二乙基亚硝胺(DEN)建立近交系F334大鼠肝癌模型.体外原代培养大鼠肝癌细胞和正常F334大鼠胚胎肝细胞,Trlzol法抽提细胞总RNA,进一步制备Hy3荧光标记的miRNA;利用ExiqonmiRNA基因芯片技术.采用含2056条探针的哺乳动物miRNA表达谱芯片对两组之间差异表达的miRNA进行分析,其实验数据用SAM3.0软件进行差异显著性分析.结果 原代培养可获得稳定传代的肝癌细胞及胎肝细胞,两者在形态上无明显差异;miRNA芯片共获得78个差异表达的miRNAs,其中68个表达上调(foldchange>2),10个表达下调(foldchange<0.5),部分miRNAs与肿瘤关系密切,其中has-miR-21为肝癌癌变相关miRNA.结论 正常肝细胞中存在着与肝细胞癌变及侵袭、转移相关的miRNAs,miRNAs的表达具有明显的时序性,其表达特征的改变可能导致了肝癌的发生.
-
70%肝切除对大鼠胎肝细胞脾内移植后增殖能力的影响
研究70%肝切除对大鼠胎肝细胞脾内移植后增殖影响.分离孕3周SD大鼠胚胎肝细胞,将其移植入70%肝切除大鼠脾内,分别于移植后7天和30天应用流式细胞仪分析肝切除大鼠残肝细胞的细胞周期,用图像分析法检测脾内移植胎肝细胞面积密度.与对照组比较,胎肝细胞移植后7天,肝切除鼠残肝细胞S期细胞比例明显增加(P＜0.05),Gz/M期细胞比例明显减少(P＜0.01).而其脾内移植胎肝细胞面积密度则显著升高(P<0.05);30天后,残肝细胞再生状态与移植胎肝细胞的面积密度与对照组比较均无显著性差异.研究表明,70%肝切除的肝再生有利于大鼠胎肝细胞脾内移植后的增殖.
-
胎肝细胞输注移植联合运动对阻塞性黄疸大鼠肝损伤修复与再生的影响
目的:观察胎肝细胞输注移植联合中等强度有氧运动干预对大鼠阻塞性黄疸致重症肝损伤的修复与再生的影响.方法:40只SD大鼠随机分为假手术、阻塞性黄疸致肝损伤、胎肝细胞及胎肝细胞联合运动干预4组,后3组均采用改良的胆总管结扎法构建大鼠阻塞性黄疸致重症肝损伤模型.自孕龄12～16天的SD孕鼠胚胎中提取肝脏组织,加工制备胎肝细胞.两胎肝细胞组于模型构建过程中的胆总管结扎后进行胎肝细胞肝门静脉输注移植.运动组进行坡度5％、速度16.8 m/min、每天45 min、每周5天、共12周的中等强度跑台训练.12周后大鼠禁食过夜,随后分离出肝组织并取材,应用HE染色法观察大鼠肝细胞形态；生物化学法测定血清总胆红素( TB IL)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)含量；免疫组化技术检测肝组织表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、多药耐药蛋白(MPR2)的蛋白表达；RT-PCR技术检测EGF、FXR、MRP2 mRNA表达.结果:假手术组肝细胞形态结构正常,阻塞性黄疸致肝损伤组可见肝细胞广泛空泡样变性、片状坏死,胎肝细胞组肝细胞少量点状坏死,胎肝细胞联合运动组肝细胞未见明显坏死.胎肝细胞组和胎肝细胞联合运动组大鼠血清TBIL、AST、ALT含量显著低于阻塞性黄疸致肝损伤组(P＜0.05).胎肝细胞组和胎肝细胞联合运动组大鼠HGF、EGF阳性表达显著低于阻塞性黄疸致肝损伤组(P＜0.01),而MRP2阳性表达显著高于阻塞性黄疸致肝损伤组(P＜0.05).胎肝细胞组和胎肝细胞联合运动组大鼠EGF mRNA表达显著低于阻塞性黄疸致肝损伤组(P＜0.01),而MRP2、FXR mRNA含量表达显著高于阻塞性黄疸致肝损伤组(P＜0.05).结论:胎肝细胞肝门静脉输注移植以及胎肝细胞肝门静脉输注移植联合中等强度有氧运动对阻塞性黄疸导致的重症肝损伤有明显的修复与再生作用,其机制可能是通过促进肝细胞再生相关因子的表达和肝细胞的增殖,从而发挥修复与再生作用.
-
体外培养人胎肝细胞与永生化L-02肝细胞的生物学性状比较
目的对比体外培养的人胎肝细胞与L-02肝细胞形态学及增殖分化特征的异同,初步评价其用于移植的可行性,探讨介入性肝细胞移植术的理想供体来源.方法分离培养14～24周的引产胎儿肝细胞,放射免疫法测定上清液中甲胎蛋白(AFP)与白蛋白(ALB)含量,免疫细胞化学法检测细胞角蛋白19(CK-19)的表达.同法检测传代培养L-02肝细胞的蛋白表达.结果人胎肝细胞分离活率达95%,在体外存活长达3周,可同时检测到AFP、ALB及CK-19表达,其中ALB分泌峰值42.06 μg/ml;L-02肝细胞增殖迅速,AFP与CK-19表达阴性,ALB表达在10 μg/ml水平,部分细胞多次传代后发生形态变异,ALB表达缺失.结论人胎肝细胞具有潜在的双向分化能力,是肝细胞移植较为合适的供体来源; L-02肝细胞不适用于移植.
-
PI3K活性与BHA诱导小鼠胎肝细胞表达神经组织细胞特异基因有关
目的:了解丁羟回醚(BHA)对小鼠胎肝(FL)细胞神经组织特异基因表达的影响及其信号途径.方法:小鼠胎肝细胞,以DMEM/F12+10%胎牛血清培养液培养;第4 d后,去悬浮细胞,留黏附细胞,加入或者不加入磷酸肌醇3羟基激酶(PI3K)抑制剂LY294002(20 μmol/L)处理24 h,再加入BHA至终浓度0.2 mmol/L,然后继续培养5d.用Western blot和半定量RT-PCR方法分析BHA处理前后神经组织细胞特异基因表达.结果:胎肝细胞本身表达神经组织特异基因水平较低或者不表达.BHA则促进了胎肝细胞内神经组织特异基因表达:NF-L mRNA增加5.8倍、NF-H mRNA增加8 0倍、TH mRNA增加30倍、BF-1 mRNA增加2.68倍;NF-L蛋白增加11.29倍、NF-H蛋白增加5 5倍、BF-1蛋白增加2.53倍、TH蛋白增加4.76倍.而LY294002能明显抑制BHA诱导的神经组织细胞特异蛋白NF-L、NF-H、BF-1和TH的表达.结论:PI3K活性与BHA诱导小鼠胎肝细胞表达神经组织细胞特异结构和功能基因有关.
-
生物人工肝的几种细胞来源
本文探讨了生物人工肝不同的种子细胞来源及其优缺点及其存在的问题和研究进展.
-
胎肝细胞的分离培养及其功能的研究
目的 探讨人胎肝细胞分离、培养的简单方法并证实其具有近似正常肝细胞的功能.方法 取水囊引产中期(4～6月龄)妊娠死胎,用两步灌注法分离胎肝细胞,观察细胞形态及存活情况,并以正常成人肝组织作正常对照,检测胎肝细胞五种基因的表达,进行光密度分析.结果 经台盼蓝染色、FDA荧光染色观察,细胞培养后11天内均存活良好,长可存活18天;新鲜分离、培养3、5、7、10天组胎肝细胞均可表达GAPDH(Glyceraldehyde Phosphate Dehydrogenase磷酸甘油醛脱氢酶)、ALB(Albumin白蛋白)、CS(Glutamine Synthetase 谷氨酰胺合成酶)、CK(Cytokeratin细胞角蛋白),经光密度分析证实,上述四种基因在培养肝细胞和正常成人肝细胞中的表达无明显统计学差异;AFP(Alpha Fetoprotein甲胎蛋白)基因表达明显强于正常肝细胞,并且于培养5天后呈显著的减弱.结论 经分离、培养的人胎肝细胞存活良好,具有和正常成人肝细胞类似的基因表达.
-
CN2006型生物人工支持装置恒温培养系统对胎肝细胞活性的影响
目的：观察细胞活性，客观评价CN2006型生物人工肝支持装置恒温培养箱控制系统，为生物人工肝的临床应用提供依据。方法选择16周正常引产的人胎肝，胎肝组织采用两步灌流法进行消化分离。在培养条件为37℃、5%CO2、湿度100%下培养24 h后，倒置相差显微镜观察细胞的生长及形态变化；用MTT法检测细胞活力，以2×105/ml细胞数在酶标仪上所测吸光度作为对照；同时，检测胎肝细胞清除氨的能力，设无胎肝细胞的反应器为空白对照。结果胎肝细胞培养24 h后，在倒置相差显微镜下观察发现细胞呈集落状生长。在装置内反应器中培养24 h后，胎肝细胞在装置的反应器中生长良好，而且得到了增殖。细胞在装置内反应器中培养24 h后，加入氯化铵溶液，通过在不同时间检测氨的浓度表明在装置内反应器中培养的肝细胞具有生物转化功能。结论细胞在CN2006型生物人工肝支持装置中不仅生长良好，而且还具有生物转化功能，说明设计的恒温培养系统适宜细胞生长环境，为生物人工肝的临床治疗提供了坚实的理论基础。
-
可用于移植的肝细胞研究进展
肝细胞移植作为治疗暴发性肝功能衰竭及各种终末期肝病一种潜在方法,具有创伤小、安全简单、可一肝多用、重复移植、抗原性低等优点.可以用作移植的肝细胞种类很多,目前也有很多关于这方面的报道,本文就可用于移植的肝细胞的研究进展做一简单总结.
-
鼠,胎肝细胞输注对免疫功能作用的研究
本文探讨鼠胎肝细胞(FLC)对环磷酰胺(CP)诱导免疫功能低下小鼠的作用.用鼠FLC注入实验小鼠腹腔后,观察白细胞介素2(IL2)、红细胞补体受体I型(ECR1)、α-醋酸萘酯酶(ANAE)等指标的变化.结果FLC组对FLC+CP组与CP组的差异均有显著性(P＜0.01).FIC可改善和恢复CP诱导免疫降低小鼠的免疫功能.
-
丙型肝炎病毒体外感染胎肝细胞的初步研究
目的探索原代培养胎肝细胞对丙型肝炎病毒(HCV)的易感性,旨在建立较为稳定实用的细胞感染模型.方法感染血清与培养肝细胞共同孵育6～8h后,收集不同时相点标本,用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测细胞内或上清液中正负链RNA,免疫组化检测细胞内HCV NS3、NS5特异性抗原的表达情况,以及原位杂交检测细胞内HCV负链RNA.结果接种感染血清3d后,即可在细胞内或培养上清液中检出HCV正负链RNA,间断检出至感染后第17天.HCV NS3、NS5特异性抗原可在感染细胞内表达,阳性物质位于胞浆中.原位杂交法证实细胞内存在负链RNA,也位于胞浆中.结论原代培养的胎肝细胞对HCV不但易感,而且稳定地支持HCV复制.
-
骨髓来源干细胞定向肝(样)细胞分化
一、引言肝移植是目前各种原因引起的终末期肝病的唯一治疗方法,供肝的缺乏阻碍了肝移植的进行和开展;细胞治疗给器官移植提供了另一选择,肝细胞移植作为一种肝脏器官移植的替代治疗手段为终末期肝病的治疗提供了新的选择,同样由于肝细胞来源的限制也使得肝细胞移植徘徊不前,而胎肝细胞由于伦理和法律的限制未能在临床上应用;干细胞治疗疾病的研究已在临床各学科迅速开展,胚胎干细胞具有胚胎细胞相似的分化潜能与成体干细胞的可塑性或转分化/横向分化的特性均为终末期肝病的治疗提供了新的思路和前景.
-
脾内移植基因修饰鼠胎肝细胞的生物学特征
目的探讨基因修饰(gene modification,GM)胎肝细胞(fetal liver cells,FLC)脾内移植途径介导细胞因子基因治疗的可行性和有效性,为肿瘤放疗病人免疫和造血功能的恢复提供一种治疗手段和途径.方法将经LacZ或粒/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因体外修饰的小鼠FLC脾内注射后,观察其生物学行为.结果①病毒/细胞感染比率(MOI)为50,转染时间为2 h时,能获得80%～85%的转染效率;②通过FACS分析,基因转移体系对FLC群体的细胞周期、凋亡细胞比例以及CD34+细胞含量无明显影响;③照射小鼠尾静脉注射FLC-GM后,其8 d脾克隆形成单位(CFU-S8)数目明显升高,提示GM-CSF基因转染有助于促进FLC中较晚期定向干细胞的增殖、分化以及体内植入;④[1]1In标记的FLC脾内移植后2 h即有20%～25%细胞转位于肝脏,48 h肝内移入量高,达50%～55%,并持续至检测第5天,只有22%左右的肝细胞滞留于脾脏;⑤血清分泌水平在脾内移植后48 h高,达(356±58)pg/ml,此时行脾切除,GM-CSF仍具有一定量的表达水平;⑥同种异体FLC-GM脾内移植引起的宿主迟发型变态反应(DTH)强度明显弱于同种异体脾细胞皮下致敏组(对照组).结论基因修饰的FLC能够保持其原有的生物学性质,脾内注射后能转位于肝脏,同化人宿主肝内长期存活,并发挥正常功能.
-
胎肝AFT024细胞对脐血CD34+细胞体外扩增及多药耐药基因转染的影响
目的:探讨胎肝AFT024细胞对人类脐血造血干细胞体外扩增的作用及对多药耐药基因(MDR1)转染效率的影响.方法: 应用AFT024细胞支持下体外长期培养的方法将人类MDR1基因转入脐血CD34+ 细胞,观察细胞扩增倍数来检测AFT024细胞对造血干/祖细胞的扩增能力,采用RT-PCR、流式细胞术及耐药集落检测的方法测定基因转染效率、P-糖蛋白(P-gp)的表达及其功能活性.结果: (1)培养21 d后AFT024细胞对有核细胞总数(TNC)的扩增没有明显作用,但CD34+ 细胞和集落形成细胞(CFC)的扩增倍数[(37.9±13.9)倍和(27.1±13.3)倍]均明显高于对照组[(9.1±2.3)倍和(7.7±3.6)倍],差异均有统计学意义(P＜0.01).(2)RT-PCR法可在AFT024组的转染细胞中检测到较高的MDR1 mRNA水平,AFT024组基因转染效率(46.0%)明显高于对照组(15.2%);两组P-gp的表达分别为(31.7±10.2)% 和(12.6±3.9)%;Rhodamine-123排出试验显示,具有P-gp功能活性的细胞分别为(35.5±11.4)%和(16.6±3.2)%,组间比较差异均有统计学意义(P＜0.01).结论: AFT024细胞具有较强的扩增造血干/祖细胞的能力,并能明显提高MDR1基因在脐血CD34+ 细胞中的转染效率.
-
CXCR7:一个与肿瘤发生有关的趋化因子SDF-1和I-TAC的新受体
研究表明SDF-1(CXCL12)能调控许多重要的生物过程,包括心脏与神经的发育、干细胞运动、血管形成、凋亡及肿瘤发生.历来认为,SDF-1是通过CXCR4这个唯一的受体来调控这些不同的过程.本研究发现了SDF-1的一个新受体,称为CXCR7.CXCR7除了能与SDF-1高亲和力结合外,还能结合另外一个趋化因子I-TAC(CXCL11).而以前的研究表明I-TAC、Mig(CXCL9)和IP10(CXCL10)三个趋化因子只能结合CXCR3.CXCR7表达于许多肿瘤细胞系、活化的内皮细胞以及胎肝细胞,别的细胞却很少表达.与别的趋化因子受体不同的是,当配体活化CXCR7后并不引起细胞钙流的变化,也不引起细胞迁移.
-
人胎肝细胞移植治疗代谢性疾病的免疫学研究
目的 利用人胎肝细胞移植治疗小鼠α-L-艾杜糖苷酶(IDUA)缺陷引起的黏多糖贮积症(MPS),观察移植后受体的免疫反应、血清及肝脏IDUA活性恢复情况.方法 将已鉴定纯化的人胎肝细胞移植给IDUA缺陷小鼠,在移植前及移植后第5、10、15天,流式细胞仪检测受体小鼠T细胞亚群CD3、CD4和CD8;ELISA法检测免疫指标IL-2、TNF-α、IFN-γ;荧光分光光度计法检测血清及肝脏IDUA活性情况.结果 胎肝细胞移植后能定植在受体肝脏中,受体在移植后第5、10、15天分别与移植前比较,血清中反映免疫状态的指标T细胞亚群、IL-2、TNF-α和IFN-γ均显著升高(P＜0.05);血清及肝脏IDUA活性在移植后第5天显著提高(P＜0.01),以后随着时间的延长,活性随之衰减.结论 人胎肝细胞移植给IDUA缺陷小鼠后,能够定植在受体肝脏中.然而由于免疫排斥反应,IDUA活性在移植后第5天达到高峰,但在第10天后下降至移植前水平.
-
白细胞介素-18基因修饰的胎肝细胞经脾移植对小鼠免疫功能的影响
目的:观察表达mIL-18的重组腺病毒基因修饰的胎肝细胞(AdmIL-18/BNL.CL2)经脾移植对正常小鼠免疫功能的影响.方法:实验组小鼠经脾移植AdmIL-18/BNL.CL2,同时设LacZ病毒对照组(Ad-LacZ/BNL.CL2),BNL.CL2细胞对照组及空白对照组.2周后处死,留取血清,制备腹腔巨噬细胞、脾淋巴细胞、肝组织匀浆液,提取肝组织总RNA.采用ELISA法检测各组小鼠血清、腹腔Mφ和脾细胞培养上清、肝匀浆中细胞因子的含量;采用半定量RT-PCR法,检测肝组织细胞因子mRNA相对表达量;以LDH释放法测定腹腔Mφ杀伤活性和脾NK细胞活性,用MTT还原比色法测定脾淋巴细胞的增殖活性.结果:实验组小鼠血清、细胞培养上清及肝匀浆中,IL-18、IL-2、IFN-γ、TNF-α含量均高于其它对照组,而IL-4、IL-10水平则低于对照组;半定量RT-PCR结果与ELISA检测结果一致;同时,实验组腹腔Mφ的杀伤活性和脾NK细胞活性,及脾淋巴细胞增殖活性也明显高于对照组.结论:AdmIL-18能有效转染至胎肝细胞并稳定表达mIL-18;AdmIL-18基因修饰的胎肝细胞经脾移植后,可显著提高肝脏、脾脏免疫细胞活性,活化腹腔Mφ,促进Th1类细胞因子表达,抑制Th2类细胞因子的分泌.
-
胎肝细胞移植治疗粘多糖贮积症的实验研究
目的 探讨用胎肝细胞移植治疗小鼠α-L-艾杜糖苷酶(IDUA)缺陷引起的粘多糖贮积症(MPS),筛选免疫抑制方案.方法将人胎肝细胞移植给经不同免疫抑制剂方案处理的IDUA缺陷小鼠,流式细胞仪检测移植前、后受体小鼠T细胞亚群(CD3、CD4/CD8比例);酶联免疫吸附剂测定(EHSA)法检测免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、白介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(TFN-γ)水平;荧光分光光度计法检测血清IDUA活性.结果受体移植后血清中反映免疫状态的指标(T细胞亚群、IL-2、TNF-α、IFN-γ)均显著升高(P<0.05);血清IDUA活性在移植后第5天显著提高(P<0.01),后随时间延长,活性随之衰减;经CTX+CsA+FTY720+强的松联合免疫抑制预处理组在移植后IDUA活性维持持久.结论胎肝细胞移植能提高IDUA活性.由于免疫排斥反应,移植前应进行免疫抑制预处理,以CTX+CsA+FTY20+强的松联合方案免疫抑制效果佳.
-
大鼠肝癌细胞与胚胎肝细胞的microRNA差异表达谱分析
目的 建立大鼠肝癌细胞与大鼠胚胎肝细胞microRNA (miRNA)表达的差异谱,为miRNA在肝细胞癌变发生机制中的作用提供新线索.方法 化学致癌剂二乙基亚硝胺(DEN)建立近交系F334大鼠肝癌模型,体外原代培养大鼠肝癌细胞和正常F334大鼠胚胎肝细胞,Trizol法抽提细胞总RNA,进一步制备Hy3荧光标记的miRNA;利用Exiqon miRNA基因芯片技术,采用含2 056条探针的哺乳动物miRNA表达谱芯片对两组之间差异表达的miRNA进行分析.结果 原代培养可获得稳定传代的肝癌细胞及胎肝细胞,两者在形态上无明显差异;miRNA芯片共获得78个差异表达的miRNAs,其中68个表达上调,10个表达下调,部分miRNAs与肿瘤关系密切,其中miR-122为肝细胞癌变相关miRNA.结论 正常肝细胞中存在着与肝细胞癌变及侵袭、转移相关的miRNAs,miRNAs的表达具有明显的时序性,主要参与转录后基因表达的调控,其表达特征的改变可能导致了肝癌的发生.
