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ipaH基因扩增诊断志贺菌和肠侵袭性大肠埃希菌
我们应用聚合酶链反应(PCR) 直接检测189份腹泻患者粪便标本的ipaH基因。 一、材料和方法 1.菌株来源:取自我院腹泻患者的粪便标本189份。标准菌株:福氏志贺菌(卫生部质控菌株),大肠埃希菌(EICE),小肠结肠炎耶尔森菌(中国药品生物制品检定所);阴沟肠杆菌、奇异变形杆菌、伤寒沙门菌、甲型副伤寒沙门菌、不凝集弧菌、绿脓假单胞菌为本室保存菌株。 2.培养基及诊断血清:中国蓝蔷薇色酸琼脂培养基;志贺菌属诊断血清,肠侵袭性大肠埃希菌诊断血清(11种)。
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实时荧光定量聚合酶链反应技术开始用于临床常规基因诊断
聚合酶链反应(PCR)技术问世20年来,已经成为致病基因分析的重要手段.但是,多年来PCR一直很难直接用于临床疾病的常规诊断,其原因主要是PCR常规实验中存在的污染问题难以解决.常规PCR是将样品和实验反应剂加入小试管进行基因扩增,PCR后汲取反应产物行琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳,用PCR产物是否出现特异性条带来判断样本中有无疾病中发生变异的基因片段.尽管这种方法简便易行,但很难避免试管中的PCR产物飞散于实验室,污染下一次检测的结果,导致出现假阳性,影响疾病诊断.长期进行PCR的许多实验室都有污染造成试验失败的经验和教训.常规PCR的另一缺陷是PCR产物不易定量.
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结核病实验室诊断新技术的临床应用
结核分枝杆菌全基因组测序的完成,使得对结核分枝杆菌的认识进入分子水平,分子生物学和免疫学的发展为诊断新方法提供了技术平台,结核病实验室诊断技术得到快速发展。为帮助临床医生了解现有新技术,以便更好地应用,本文系统介绍现有结核病实验室诊断新技术的原理和临床应用特点。
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分子诊断技术在传染病病原体检测中的应用
传染病病原体的准确检测是传染病有效防控的前提,也是合理用药的基础。然而,传统的病原体分离、培养等诊断方法不能完全满足临床治疗和疾病控制的需要。新发展的传染病分子诊断技术可有效弥补传统方法的不足。本文就新一代测序、核酸扩增、生物芯片和生物传感等传染病分子诊断新技术及其应用研究进展进行综述。
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实时荧光定量PCR检测血清中HCV-RNA
目的:通过实时荧光定量PCR(FQ-PCR)与逆转录PCR(RTPCR)两种方法检测血清HCV-RNA的结果比较,评价FQPCR法的临床应用价值.方法:样本为经ELISA法筛选抗HCV阳性血清401份,其中221份采用实时荧光定量PCR法检测,180份采用RTPCR法检测.结果:FQ-PCR法检测HCV-RNA,阳性率(≥102拷贝/mL)68.3%(151/221),定量范围在102-107拷贝/mL,之间,但≤106拷贝/ml占98.1%(148/151);RT-PCR法检测阳性率为30%(54/180).结论:FQ-PCR检测HCV-RNA较RT-PCR是一种省时、简便、敏感、特异和防污染的体外基因扩增与定量检测方法,其结果对临床诊断和疗效观察有重要的指导意义.
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MDM2基因扩增和蛋白表达与胃癌相关性的研究
目的:研究癌基因mdm2在胃癌中的基因扩增和蛋白表达状况,揭示mdrn2与胃癌发生发展的相关性.方法:用RT-PCR和Westemblot方法对胃癌细胞在mRNA、蛋白质水平上进行检测.结果:mdm2的基因扩增阳性率在胃癌组织中较高,其中低分化12.5%、中分化37.5%、高分化87.5%,与正常组织比较有显著性差异(P<0.05),且与病理分级有关(P<0.05).mdm2的蛋白表达阳性率在胃癌组织中较高,其中低分化25%、中分化37.5%、高分化62.5%,与正常组织比较有显著性差异(P<0.05),与病理分级无关(P>0.05).结论:mdm2的基因扩增和蛋白过表达参与胃癌的发生发展,检测胃癌mdm2基因扩增对估计该肿瘤的预后可能有所帮助.
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IS6O6在中国人群感染幽门螺杆菌中的分布意义
目的探讨转座子插入元件IS606在中国人群感染幽门螺杆菌(Hp)中的分布特征及其与HP致病的相关性.方法采用PC,R方法,将82例临床分离培养的HP菌株,分成IS605阳性(32株)和IS605阴性(50株)两组,扩增IS606中的1000bp片段,同时设立阳性对照及阴性对照.结果IS606在中国人群感染Hp的82例中全部为阴性.结论作为转座子插入元件的IS606在中国人慢性胃炎、消化性溃疡及胃癌等不同疾病来源的Hp中均不存在提示中国人群感染的Hp几乎无IS606插入,IS606与中国人群感染HP的致病性似乎关系不大,且不存在IS605与IS606的双插入.
关键词: 螺杆菌感染/流行病学 螺杆菌 幽门/遗传学 DNA可移植因子 基因扩增 -
大肠癌及癌旁组织中p73基因的表达
大肠癌是常见的消化道肿瘤,是多因素、多阶段、多基因共同作用的结果.目前已证实关系密切的有K-ras,C-myc,p53,PC,DCC等.p73是新近发现的基因,与大肠癌关系尚不明确[1-9],我们通过检测大肠癌及癌旁组织中的p73表达,以期探讨p73基因在大肠癌发生发展中的作用.1 材料和法1.1 材料大肠癌组织40例及相应远离癌灶5的非癌组织由264医院消化内镜中心提供,标本取得后立即用液氮冷却或放至-20℃冰箱保存.
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人内皮抑素与IL3信号肽融合蛋白真核表达载体的构建
目的构建IL3信号肽与内皮抑素融合蛋白基因的真核表达载体.方法用PCR方法扩增IL3信号肽序列和人内皮抑素基因,然后采用重叠延伸PCR拼接的方法将两者拼接和扩增.并将IL-3-endo cDNA克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中.结果IL-3-endo融合蛋白基因包括了IL3信号肽序列和人内皮抑素蛋白全长基因,基因总长度约701bp,被正确拼接,并克隆到pcDNA3.1(+)的CMV启动子下游序列分析证实克隆序列、插入方向和读码框架均正确.结论成功的将IL3信号肽序列连接到人内皮抑素基因序列前并构建了其真核表达载体,为以后的内皮抑素用于基因治疗打下了基础.
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湖北食管癌HLA-DQB1的基因多态性
目的从基因水平探讨湖北地区汉族人食管癌HLA-DQB1等位基因的遗传易感性.方法运用序列特异性引物聚合酶链反应技术,检测无亲缘关系湖北汉族健康人136例、食管癌组42例患者的HLA-DQB1等位基因.SAS system统计软件数据处理.结果湖北汉族人食管癌患者与正常人比较,HLA-DQB1*0301基因频率显著增高(0.2976vs0.1875),P=0.046,OR=1.835,病因分数=0.1354);两组间HLA-DQB1其余各等位基因分布频率的比较,HLA-DQB1*0201(0.0833 vs 0.1016),*0301(0.2976 vs 0.1875),*0302(0.0595 vs 0859),*0303(0.2381 vs 0.1875),*0304(0.0000 vs 0.0039),*0401(0.0714 vs 0.0469),*0402(0.0119 vs 0.0156),*0501(0.0357 vs 0.0703),*0502(0.0595 vs 0.0664),*0503(0.0119 vs 0.0195),*0504(0.0000 vs 0.0039),*0601(0.0595 vs 0.0781),*0602(0.0476 vs 0.0742),*0603(0.0000 vs 0.0078),*0604(0.0238 vs 0.0508),差异均无显著性.结论 HLA-DQB1*0301等位基因与湖北汉族人食管癌正关联,为其易感基因.林军,邓长生,孙洁,周燕,熊平,汪亚平.湖北食管癌HLA-DQB1的基因多态性.世界华人消化杂志,2000;8(9):965-968
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中国人感染幽门螺杆菌中检出cagⅠ的结构差异
目的探讨cag致病岛基因群的右半部分cagI中caggA与cagM在中国人群感染幽门螺杆菌(H.pylori)中存在的差异及意义.方法采用PCR方法检测了107例临床分离培养的H.pylori菌株,选择cagⅠ中的cagA和cagM为观测对象,分别扩增cagA中的298bp片段及cagM中的170bp片段结果oagA阳性的检出率为92.5%,cagM阳性的检出率为86.9%,cagA,cagM在慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌等不同疾病组间的检出率无显著差异(P>0.05)其中cagA与cagM均阳性的检出率为85%(91/107)、cagA阳性、cagM阴性的检出率为7.5%(8/107)、cagA阴性、cagM阳性的检出率为1.9%(2/107),cagA与cagM均阴性的检出率为5.6%(6/107).即在9.4%的H pylori中,cagA与cagM的检出存在不一致性结论 cagA与cagM检出的不一致性表明,中国人群感染的H.pylori中,cag致病岛不仅存在cagⅠ与cagⅡ之间的分割、重排和缺失,还发现在cagⅠ基因群内部,即在cagA和cagM之间出现新的分割、重排和缺失位点,以及存在新的cag致病岛结构形式
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多重聚合酶链反应鉴定幽门螺杆菌基因型
目的建立鉴定幽门螺杆菌(H.pylori)cogA,υacA基因型别的多重聚合酶链反应(PCR)方法,并对90例H.pylori临床分离株的cagA,υacA型别进行鉴定.方法将鉴定cagA基因的引物P1,P2及鉴别υacA基因型别的引物VAG-F,VAG-R,VA1-F,VA1-R,SS1-F加入同一反应管中,一次性扩增出2~4条特异性DNA片段,并判定H.pylori cagA,υacA基因型别.结果建立了鉴定H.pylori cagA,υacA基因型别的多重PCR系统,其灵敏度为300CFU.90例H.pylori菌株中,82例(91.1%)含cagA基因;υacA基因信号区s1a,s1b和s2型分别为46例(51.1%),36例(40.0%)和8例(8.9%);中间区ml和m2型分别为46例(51.1%),44例(48.9%).82例s1型Hpylori菌株中79例(96.3%)为cagA+,8例s2型H.pylori菌株中2例(25.0%)为cagA+,其差异有显著统计学意义(X2=38.39,P<0.001).结论建立的鉴定H.pylori cagA,vacA基因型别的多重PCR方法具有简便、快速、特异、经济的特点.西安地区人群感染的H.pylori菌株绝大多数为cagA+菌株,H.pylori υacA基因的s1型(特别是s1a型)和magA基因的出现密切相关.
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慢性胆囊炎患者胆囊内Helicobacter pylori的细菌学特征
目的:探讨慢性胆囊炎患者胆囊内幽门螺杆菌(H pylori)的细菌学特征.方法:采集手术切除的病理确诊为慢性胆囊炎的新鲜胆囊标本黏膜刮片,接种于H pylori培养板,培养及鉴定后与胃中分离的菌株进行形态学、生化反应、免疫组化、PCR扩增、电镜观察等方面比较.结果:分离出3株细菌,经形态学观察、生化反应、抗Hpylori抗体免疫组化染色,Hpylori尿素酶A、B基因扩增及电镜观察证明他们是H pylori,与同一患者胃内Hpylori比较,除胆囊内H pylori尿素酶活性低于胃内Hpylori外,其他性质均相同.结论:推测胆囊内H pylori可能主要是通过胆道逆行感染进入胆囊.
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胰腺癌的基因不稳定性
目的分析胰腺癌细胞和组织的基因不稳定性. 方法应用RAPD方法7种引物扩增4株胰腺癌细胞株BxPC-3、AsPC-1、SW1990和PaTu8988,3例手术切除胰腺癌及其癌旁组织,1例正常胰腺组织的DNA片段.结果PaTu8988与SW1990扩增的DNA片段类型基本一致,但与BxPC-3、AsPC-1的类型不同;胰腺癌和癌旁组织扩增的DNA类型多数相同,少数存在差异,但与正常胰腺组织及胰腺癌细胞株不同.结论胰腺癌组织中存在着基因不稳定性,这是造成肿瘤异质性的基础.
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重组5型腺病毒高效扩增的研究
目的 探讨高效扩增腺病毒载体的方法.方法 采用人胚肾293细胞株扩增含有SERCA2a基因的重组5型腺病素(Ad-SERCA2a),采用半组织定量法测定病毒滴度,PCR和Western blot法检测SERCA2a基因表达.结果 扩增纯化后腺病毒滴度为1.0×1012 PFU/ml,扩增病毒SERCA2a基因表达.结论 采用人胚肾293细胞扩增重组腺病毒,经纯化后可获得高滴度病毒.
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肌腱蛋白C在急性心肌梗死中的表达及磁共振靶向成像的体内实验研究
目的 探讨肌腱蛋白C(TN-C)抗体标记超顺磁性氧化铁(SPIO)在检测急性心肌梗死中的价值和意义.方法 选择30只ICR雌鼠,建立急性心肌梗死模型的25只为实验组,另5只为对照组.实验组5只用于不同时间心功能检测,另20只于心肌梗死模型3、5、7及14 d时,取材观察,每个时间点5只,通过荧光定量PCR以及免疫荧光染色测定心肌梗死区域TN-C mRNA和蛋白的表达差异.实验组小鼠注入合成靶向TN-C磁共振探针(SPIO anti-TNC0.67 mg/ml,0.05 ml),对照组5d时注入未标记探针相同剂量(SPIO0.05 ml),均开胸左心室注射探针,12 h后行MRI.勾画感兴趣区域,测量磁共振图像对比噪声比(CNR)改变.结果 实验组5 d TN-CmRNA表达高,基因扩增倍数为(24.29±1.41)倍,7d时下降至(7.35±0.09)倍.免疫荧光显示TN C蛋白表达主要在梗死区域心肌细胞周围间质,呈网格状,蛋白表达量与基因表达水平一致.合成的靶向探针抗体浓度为0.02 mg/ml,粒径(46.16±5.17)nm.实验组3 d CNR为6.51±1.13,5 d为14.06±3.19,7d为6.24±2.27,对照组为1.42±0.15,差异有统计学意义(F=14.897,P<0.01).结论 SPIO-anti-TN-C探针能够高效靶向结合心肌梗死组织中TN-C,高场强MRI信号变化显著,可为临床动态监测心肌梗死病理过程提供新的思路.
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膀胱癌MDM2、p53基因表达的临床意义
我们运用点杂交、PCR-SSCP、免疫组化技术(IHC)分别对膀胱移行细胞癌(TCC)组织和配对癌旁组织,以及非TCC正常膀胱粘膜组织中MDM2基因扩增和表达,p53表达和点突变情况进行对比检测,报告如下.
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荧光原位杂交法检测胃癌组织中Her-2/neu基因扩增及其预后意义
很多研究发现Her-2/neu蛋白表达与基因扩增的结果 并不完全一致,Her-2/neu基因扩增能更好地反应恶性肿瘤的生物学行为、监测预后[1].
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Her-2基因扩增与胃癌患者临床病理及预后相关性分析
目的 探讨胃癌组织中Her-2 的基因扩增比例与胃癌临床病理及预后的相关关系.方法 采用荧光原位杂交技术(FISH)法检测62 例胃癌组织中Her-2 基因扩增状态,结合临床病理及总生存率,分析Her-2 基因与临床病理参数、预后的相关性.结果 62 例胃癌组织中Her-2 阳性10 例(16.1%),阴性52 例(83.9%).Her-2 在胃癌组织中基因扩增与患者病理T 分期、N 分期、分化程度、远处转移有关(P < 0.05); 而与性别、临床发病年龄、部位、CEA 增高(> 5 μg/L)、脉管受侵无关;Kaplan-Meier 分析显示Her-2 基因扩增阳性组患者生存时间较阴性组短,差异有统计学意义(P < 0.05).结论 胃癌原癌基因Her-2 与患者的临床及病理特征、5 年生存率有关.
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不同强度张应力影响成骨细胞分化的体外实验研究
目的 探讨不同强度的张应力对人成骨细胞分化的影响.方法 根据骨假体界面应力有限元分析数据和细胞水平应力扩增理论,分别以0.8%、1.6%、2.4%和3.2%的强度在体外对人成骨细胞连续48 h施加1 Hz的牵张应力,观察碱性磷酸酶活性的变化和其他成骨相关基因的表达.结果 成骨细胞碱性磷酸酶活性的提高出现在0.8%和1.6%的应变水平;2.4%和3.2%的应变促进骨钙素的表达;3.2%的应变增强Cbfal/Runx2的表达;与静力对照相比,所有应变组Ⅰ型胶原基因的表达增强;与1.6%应变组相比,Ⅰ型胶原基因的表达在0.8%时减弱,在3.2%时增强(P<0.05).结论 较高强度的应变促进与基质成熟相关的基因的表达,而低强度的应变刺激碱性磷酸酶活性的提高.Ⅰ型胶原基因表达对张应力的应答呈强度依赖性.