乙型肝炎病毒表面抗原蛋白基因的克隆及其在P815细胞中的表达

1 材料与方法1.1 质粒的构建pCP10质粒含有ayw亚型HBV全基因组.该质粒作为扩增S蛋白基因的模板,上、下游引物含BglⅡ的酶切位点.

鼠双微粒体2/p53通路与乳腺癌的研究进展

肿瘤抑癌基因p53所编码的产物P53蛋白能调节正常细胞周期,在细胞DNA受到损伤或其他应激反应时,P53使控制细胞周期和保持细胞基因组完整的基因活化并转录,从而导致细胞周期停滞或细胞凋亡.

用mRNA差异显示法分离大鼠吗啡依赖相关基因

目的:分离并克隆大鼠吗啡依赖相关基因.方法:SD大鼠用递增剂量的吗啡作皮下注射,形成吗啡依赖的动物模型.分离鼠脑的中脑导水管周围灰质、伏核、纹状体等核团,提取总RNA,用mRNA差异显示(differential display PCR,DDPCR)的方法,筛选吗啡依赖大鼠特异表达产物的cDNA片段.用3组锚定引物(T12MN,M=A,G,T或C,N＝A,C或G)和6组随机引物(AP1～AP6)作不同组合进行PCR扩增.结果:获得了80余个差异表达产物的cDNA片段,经斑点杂交初步筛选,克隆了10个阳性片段,选取4个克隆进行序列分析,获得了4个cDNA片段.结论:通过BLAST数据库序列比较,现已确认获得了4个吗啡依赖表达的新基因片段.

一组癌基因扩增与胃癌生物学行为的相关分析

目的:探讨癌基因HER2、mdm-2和C-myc扩增与胃癌恶性程度、转移及预后的关系.方法:用差异竞争性多聚酶链反应检测胃癌原发灶、癌旁、转移淋巴结及远处脏器转移癌中HER2、mdm-2和C-myc的基因变异.结果:HER2扩增频率在近端胃癌组中明显高于远端胃癌组(分别是11/13和5/19, P<0.005),侵及浆膜组明显高于未侵及浆膜组(12/18和4/14, P<0.05).mdm-2的扩增频率在转移淋巴结中高于胃原发癌(12/21和12/32,P>0.05),在3例淋巴结微转移灶中发现mdm-2扩增.C-myc在胃癌原发灶及转移淋巴结中的扩增频率分别是6/32和5/21, 2例远处脏器转移癌中有扩增.结论:HER2 、mdm-2和C-myc基因扩增与胃癌的快速生长有关,三者联合检测可能为判断胃癌恶性程度、转移及预后提供有价值的信息.

人外周血淋巴细胞体外扩增培养前后CD25、CD29、HLA-DR系列表型研究

目的 观察35例恶性肿瘤患者外周血淋巴细胞在体外经扩增培养后细胞CD25、CD29、HLA-DR系列表型的变化.方法 体外诱导扩增恶性肿瘤患者外周血淋巴细胞及单个核细胞,应用流式细胞术测定扩增前后CD25+、CD29+、HLA-DR+、CD4+CD25+、CD4+CD29+、CD3+HLA-DR+、CD3+HLA-DR-、CD4+HLA-DR+、CD4+HLA-DR-、CD8+HLA-DR+、CD8+HLA-DR-细胞百分比的变化.结果 经体外扩增培养后,CD25+,CD29+,CD3+HLA-DR-,CD8+HLA-DR+和CD8+HLA-DR-细胞比例较培养前明显增加(P<0,01);而CD4+CD25+,CD4+CD29+,CD4+HLA-DR+和CD4+HLA-DR-细胞比例则明显降低(P<0.01);HLA-DR+细胞和CD3+HLA-DR+细胞培养前后细胞比例变化无统计学意义(P>0.05).结论 经体外扩增培养后,CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)细胞比例降低,活化性T细胞的比例与培养前无统计学差异.

免疫组织化学法在非小细胞肺癌EML4-ALK融合基因检测中的应用

目的 探讨免疫组织化学法检测非小细胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC)患者EML4-ALK融合基因的效果.方法 选取2014年6月-2016年7月本院病理诊断为非小细胞肺癌的患者281例(其中腺癌259例,鳞癌17例,腺鳞癌5例)为研究对象,分别采用PCR法和免疫组化法(Ventana)检测281例患者石蜡组织EML4-ALK融合基因改变情况.以PCR法为金标准,比较两种方法的阳性率,计算Ventana法的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值.结果 281例样本中,PCR检测法检测EML4-ALK融合基因阳性率10.0%,Ventana法阳性率为12.8%,两种方法无统计学差异(P=0.057);Ventana法的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为89.3%、95.7%、69.4%、98.8%.结论 Ventana法可有效检测EML4-ALK融合基因,有较好的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测,且较经济、简便、快捷.

误诊为病毒性脑炎的线粒体脑肌病伴高乳酸血凝症和卒中样发作综合征一例报告

我们于2005年3月收治1例初误诊为病毒性脑炎,后经PCR基因扩增测序证实为线粒体脑肌病伴高乳酸血凝症和卒中样发作(MELAS)综合征的患者,报告如下.

非显微镜方法诊断疟疾的准确率及使用价值/抗疟预防方法对到南非Kruger国家公园旅游人员的利与弊/一种新的诊断及监疟疾的补充工具——基因扩增技术分析法

乳腺癌扩增基因1与上皮细胞钙黏蛋白在卵巢癌组织中的表达及其临床意义

目的 检测乳腺癌扩增基因1(AIB1)与上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)在卵巢癌组织中的表达,并确定其表达与卵巢癌临床病理特征的关系.方法 采用免疫组织化学EnVision二步法染色检测50例卵巢癌组织和13例正常卵巢组织中AIB1、E-cadherin、雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)与Ki-67等的表达.结果 卵巢癌组织中AIB1阳性表达率[68％(34/50)]显著高于正常卵巢组织[8％(1/13)](P＜0.01),E-cadherin表达下调率为60％(30/50).AIB1阳性表达率在国际妇产科联盟(FIGO)分期Ⅲ+Ⅳ期高于Ⅰ+Ⅱ期(P=0.036),有淋巴结转移高于无淋巴结转移(P=0.027),Silverberg分期G3期高于G1+G2期(P=0.003),浆液性腺癌高于非浆液性腺癌(P=0.049),ER阳性高于ER阴性(P=0.000),Ki-67阳性高于Ki-67阴性(P=0.009)；E-cadherin表达下调率在FIGO分期Ⅲ+Ⅳ期高于Ⅰ+Ⅱ期(P=0.044),浆液性腺癌高于非浆液性腺癌(P=0.002),ER阳性高于ER阴性(P=0.021),Ki-67阳性高于Ki-67阴性(P=0.035).AIB1与E-cadherin表达呈负相关(P=0.026).结论 卵巢癌组织中AIB1与E-cadherin表达情况及临床分期密切相关,可能是参与卵巢癌发展的重要分子.

神经母细胞瘤相关预后因素的研究现状

神经母细胞瘤(neuroblastoma,简称NB)是来源于节后交感神经系统的胚胎性恶性肿瘤,绝大多数来源于肾上腺,在小儿恶性肿瘤中居第三位,占所有小儿恶性肿瘤病死率的15%[1].96%的患儿发病年龄在10岁以前[2].

多重耐药革兰阴性杆菌Ⅰ类整合子结构与功能分析

目的 探索Ⅰ类整合子在多重耐药的革兰阴性杆菌中的功能作用,并对其基因结构进行研究,为阐明革兰阴性杆菌的耐药机制和抑制耐药性的产生提供理论依据.方法 选择温岭市妇幼保健院2009年7月～2011年10月的多重耐药革兰阴性杆菌80株,其中铜绿假单胞菌40株,鲍曼不动杆菌40株,使用K-B纸片法和双纸片协同实验对细菌的耐药性和超广谱β-内酰胺酶(ELSBs)的产生情况进行考察.对耐药且产ELSBs的细菌进行筛选,使用聚合酶链式反应(PCR)扩增实验、电泳法、整合酶Sourthen杂交实验对耐药细菌体内的Ⅰ类整合子存在情况、整合子基因结构、基因位置进行考察.结果 药敏结果显示,40株铜绿假单胞菌中多重耐药且产ELSBs的菌株为27株,40株鲍曼不动杆菌中多重耐药且产ELSBs的菌株为28株.对多耐药且产ELSBs的菌株通过PCR扩增实验进行的Ⅰ类整合子存在情况的考察结果显示,40株鲍曼不动杆菌和40株铜绿假单胞菌中Ⅰ类整合子的阳性率分别为57.5％和55.0％.Ⅰ类整合子的保守区和可变区PCR扩增与测序分析结果显示,保守区内含有qaeE△1-F和sul 1-B这两种特征性基因片段,可变区内以长度为0.15、1.00、2.00、2.30 kb的基因片段出现频率高,0.15 kb含有保守区内基因结果,其它基因片段依次为aadA、aaeA4、craB8这3种基因盒.结论 Ⅰ类整合子与革兰氏阴性杆菌耐药性的产生有着密切的关系,qaeE△1-F和sul 1-B为Ⅰ类整合子基因保守区的特征性片段,两者同时出现则可确证该细菌体内含有Ⅰ类整合子.Ⅰ类整合子基因可变区内含有aadA、aaeA4、caaB8三种出现频率高的基因盒且长短为0.15 kb的基因片段含有保守区的基因结构,这3种基因盒和保守区基因片段的存在是导致细菌间耐药性平行转移的重要因素.

临床基因扩增检验实验室风险评估与防范措施的分析

目的 按照国家有关规定对我院临床基因扩增检验实验室进行风险评估,以加强实验室的生物安全,确保规范开展临床基因扩增检验工作.方法 风险评估方法采用现场评估,并综合分析所采取措施的防范效果.结果 回顾分析显示贵州省细胞工程重点实验室临床基因扩增检验实验室主要存在着危害度等级2级和3级的感染性微生物危害,主要可能存在乙型肝炎病毒、人乳头瘤病毒和结核杆菌等12种常见微生物危害风险,实验室建立的4个工作区布局合理,并采取了有效的控制风险措施,质量、技术管理体系完善,并能严格贯彻执行,有效防范了生物风险.结论 健全风险评估机制和建立防范措施是保证基因扩增检验实验室生物安全的关键措施,也是使实验室良好运行的重要举措.

直接测序联合多重连接依赖探针扩增法检测家族性腺瘤性息肉病APC基因胚系突变

目的 研究中国家族性腺瘤性息肉病(FAP)患者APC基因胚系突变的特点.方法 对来自北京、河北、河南、安徽、内蒙古、山西、福建等地区的14个FAP家系先证者用直接测序法进行APC基因突变检测,对突变检测阴性者应用多重连接依赖探针扩增(MLPA)技术进行APE基因大片段缺失检测.结果 14例先证者中9例(64.3%)检测出APC基因微小突变,其中移码突变6例,剪接区突变2例,无义突变1例;2例(14.3%)检测出APC基因大片段缺失,微小突变与大片段缺失的总检出率为78.6%.c.2336-2337insT、c.3923-3929delAAGAAAA、c.532-2A>T和c.4179-4180GAdelinsT等4个微小突变和外显子11、10A缺失、外显子15 start缺失等2个大片段缺失为首次报道.结论 中国FAP患者APC基因的胚系突变类型多样,以移码突变居多,突变位点以第15外显子居多;直接测序法联合MLPA法检测大片段缺失可提高APC基因突变的检出率.

多重连接探针扩增技术联合Sanger测序对21-羟化酶缺陷症的诊断价值

目的 探究21-羟化酶缺陷症(21-OHD)的基因诊断流程.方法 纳入2016年12月至2017年12月于北京协和医院内分泌科就诊的51例21-OHD患者,男18例,女33例,年龄(16.4±9.9)岁,收集患者临床和血生化资料.利用多重连接探针扩增技术(MLPA)和Sanger测序方法检测CYP21A2基因突变,比较两种方法的检出率,并探究21-OHD基因型与临床表型的一致性.结果 经MLPA检测,51例患者的102个CYP21A2等位基因中大片段缺失、第三外显子8 bp缺失、I2G、I172N及F306+T的比例分别为19.6％(20/102)、1.0％(1/102)、30.4％(31/102)、25.5％(26/102)及1.0％(1/102),基因突变检出率为77.5％(79/102).CYP21A2基因的PCR扩增和Sanger测序检测出除大片段和第三外显子8 bp缺失之外的MLPA方法中包含的所有突变,还检出其他8种突变,分别为:P31L、Q319X、R361L、R357W、V282L、R484Q、G425S和R342W,突变检出率为79.4％(81/102).MLPA联合直接测序确定了全部患者的基因突变,且通过基因型预测表型与临床表型相符.结论 单用MLPA或测序方法诊断21-OHD病因时,都会漏诊部分21-OHD患者,联合应用两种方法,能优势互补,有助于明确21-OHD的病因.

鼻腔NK/T细胞淋巴瘤T-bet基因扩增及特异表达的研究

目的探索鼻腔NK/T细胞淋巴瘤 (N-NK/T-L) 特异基因改变及其表达变化.方法对同一病例的N-NK/T-L肿瘤细胞和外周血白细胞进行限制性酶切路标基因组扫描(RLGS),并结合相应虚拟基因组扫描(VGS)生物信息分析,及基因库检索确定异常基因信号;通过对上述结果发现的异常基因进行克隆和探针制备,对3例新鲜N-NK/T-L肿瘤组织和1例外周血标本进行了Southern和斑点印迹杂交分析,并对20例石蜡组织N-NK/T-L以及对照组包括17例同部位B细胞淋巴瘤、3例正常脾组织和5例慢性炎性鼻黏膜组织进行了原位杂交检测.结果 RLGS 和VGS 法显示N-NK/T-L肿瘤细胞中存在T-bet基因异常;经Southern和斑点印迹杂交检测证明在3例新鲜N-NK/T-L肿瘤细胞中有T-bet基因扩增;原位杂交显示T-bet 基因在20例N-NK/T-L中阳性表达者为18例(90.0%),而B细胞淋巴瘤中仅为2例(11.8%),两者比较差异有统计学意义(P<0.01).在3例脾组织和5例慢性炎性鼻黏膜组织中均未有T-bet表达.结论 T-bet基因在N-NK/T-L肿瘤细胞中存在基因扩增和过表达,T-bet基因的异常表达可能在N-NK/T-L 的发生中起一定作用,并有必要对其是否可作为分类依据和辅助诊断的指标做进一步研究.

转导JAK2基因可促进原始多能造血细胞在体外的长期扩增

目的探讨激活JAK2信号通路是否能够长期扩增调控造血干祖细胞并评价扩增细胞的定向分化潜能.方法构建克隆1个含有JAK2基因和二聚化化学诱导物(AP20187)结合位点所组成的逆转录病毒载体.AP20187可以使JAK2二聚化激活细胞内信号传导.将该载体转入小鼠原始骨髓造血细胞,在无血清培养基中,将JAK2转基因的细胞分为:①空白对照组,②AP20187组,③细胞因子联合组[干细胞因子(SCF)+Flt3-配体(Flt3-L)],④AP20187+ SCF+ Flt3-L组.对扩增的细胞进行免疫表型、定向分化、造血祖细胞集落分析及脾集落形成单位的研究.结果只有AP20187+SCF+Flt3-L组能够使JAK2转基因的骨髓细胞持续大量对数级增殖.约8 d时,细胞数量可以达到扩增前的1019倍.扩增的细胞经流式细胞仪检测为:Sca1阳性细胞为52%～98%,C-kit阳性率为56%～69%,CD34阳性率40%～85%;而其他表型TER119阳性0～20%,CD41阳性5%～36%,B220阳性12%～46%,Gr1阳性6%～17%,CD11b阳性35%～46%,CD3为阴性.扩增细胞在SCF/粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)/白介素(IL)-3条件下,可分化形成明显的粒细胞和巨噬细胞;在SCF/红细胞生成素(EPO)条件下,可分化为红细胞;在SCF/血小板生成素(TPO)/IL-11条件下,可分化为巨核细胞.祖细胞半固体集落培养,可以形成红系爆式集落形成单位(BFU-E)、粒-巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)、混合集落形成单位(CFU-Mix)以及IL-7产生的B淋巴细胞集落,并可在照射过的小鼠体内形成脾集落形成单位.结论 JAK2介导的转基因骨髓造血细胞可以长期扩增调控,扩增的细胞仅限于JAK2转基因的细胞,并且具有多系分化的潜能.

遗传新技术在生殖安全中的应用进展

作为一种减少出生缺陷率，确保生殖安全的重要手段，产前诊断已经成为产科护理的一种重要手段。近分子遗传学新技术的大力发展正在改变产前诊断尤其是非侵入性产前诊断的面貌。介绍3种遗传学新技术及其在产前诊断方面的应用，包括使用比较基因组学杂交芯片技术检测染色体结构变异，深度测序技术和数字相对突变剂量计数法在非侵入性产前诊断方面的应用，技术的快速革新和临床应用的全面开展凸显这几个遗传新技术在产前研究方面的重要作用。

三种反义c-myc RNA对HL-60细胞分化的影响

HL-60是一种c-myc高表达的恶性肿瘤细胞。大量研究显示，当HL-60细胞被多种化学诱导剂诱导产生分化、凋亡及生长抑制时几乎都有c-myc表达的明显下降，甚至在自发产生分化的HL-60细胞中也有c-myc基因扩增消失的现象，提示c-myc表达与HL-60细胞分化之间有密切关系。我们将构建成功的三种反义c-myc逆转录病毒表达载体aM1、aM2和aM3(分别载有c-myc的第1,2和3外显子反义片段)导入HL-60细胞，并观察基因导入对靶细胞分化的影响。

应用多重连接依赖性探针扩增技术进行脊髓性肌萎缩症产前诊断

目的 探讨多重连接依赖性探针扩增技术在脊髓性肌萎缩症产前诊断中的临床应用价值.方法 以脊髓性肌萎缩症6个家系作为研究对象.包括患者7例、父母12名、胎儿6例.采用多重连接依赖性探针扩增技术对运动神经元生存(SMN)基囚及脊髓性肌萎缩症修饰基因进行分析,应用聚合酶链反应-限制性酶切片段长度多态性技术检测SMNI基凶缺失,羊水标本分别通过直接离心沉淀和细胞培养进行DNA分析.结果 多重连接依赖性探针扩增分析提示6个家系中7例患者及1例胎儿(家系Ⅳ)呈SMNI基凶纯合缺失,与聚合酶链反应.限制性酶切片段长度多态性分析结果一致;11名父母及5例胎儿的SMNI拷贝数为1,1名母亲(家系V)SMNI拷贝数为2,均为脊髓性肌萎缩症携带者.多重连接依赖性探针扩增分析显示.6个家系中10名成员SMN2拷贝数为1,15名成员SMN2拷贝数为2;多重连接依赖性探针扩增分析.6个家系中3名成员神经元凋亡抑制蛋白(NAIP)基冈缺失,其余家系成员正常.结论 多重连接依赖性探针扩增技术为一快速而可靠的基凶榆测及定量分析方法,可准确检测SMN基凶及脊髓性肌萎缩症修饰基凶的缺失突变并分析基因拷贝数,适用于脊髓性肌萎缩症患者、携带者的基因诊断及产前诊断.

脊髓性肌萎缩症单细胞巢式聚合酶链反应技术的建立及初步应用

目的 建立单细胞巢式聚合酶链反应技术,并探讨进行脊髓性肌萎缩症基因诊断的可行性,为植入前遗传学诊断奠定基础.方法 应用显微操作技术从外周血中分离单个淋巴细胞,制备单细胞DNA模板.分别应用巢式聚合酶链反应和引物延伸预扩增两种方法扩增正常对照者外周血中单个淋巴细胞运动神经元生存(SMN)基因第7、8号外显子,计算其阳性率,建立SMN1基因的单细胞巢式聚合酶链反应技术.并应用该项技术及限制性酶切对1例脊髓性肌萎缩症患者进行基因诊断.结果 正常对照者巢式聚合酶链反应共扩增60个外周血单个淋巴细胞SMN1基因第7号外显子,其中54个扩增成功,阳性率为90%;引物延伸预扩增共扩增10个外周血单个淋巴细胞,巢式聚合酶链反应分别扩增SMN1基因第7、8号外显子,在20个聚合酶链反应扩增中共有17个单个淋巴细胞扩增成功,阳性率为85%.应用巢式聚合酶链反应和引物延伸预扩增两种方法对1例脊髓性肌萎缩症患者单个淋巴细胞扩增后经限制性酶切显示SMN1基因缺失,结果与全血基因组聚合酶链反应-限制性酶切一致.结论 巢式聚合酶链反应和引物延伸预扩增方法各有优缺点,巢式聚合酶链反应耗时短、操作简便,可作为脊髓性肌萎缩症患者单细胞基因诊断的首选方法.