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胰腺癌细胞株Hedgehog信号通路活化与K-ras基因突变的相关性研究
目的 探讨胰腺癌细胞株中Hedgehog信号通路活化与K-ras基因突变的相关性.方法 采用实时定量PCR法检测人胰腺癌细胞株SW1990、PaTu8988、CFPAC-1、PANC1、AsPC-1、Capanc-2、BxPC-3的K-ras基因突变状况及Hedgehog信号通路主要成员Glil、Smo mRNA的相对表达量.结果 PANC1、CFPAC-1、AsPC-1、PaTu8988细胞为12密码子突变型,SW1990细胞为13密码子突变型,BxPC-3、Capanc-2细胞为纯野生型.AsPC-1、CFPAC-1、PANC1、PaTu8988、SW1990、BxPC-3、Capanc-2的Glil mRNA 相对表达量分别为7.84±8.92、1.82±3.45、1.00±0.00、0.07±0.10、0.88±1.48、0.52±0.98、0.15±0.19；Smo mRNA的相对表达量分别为144.00±58.33、3.48±3.77、1.00±0.00、81.68±28.26、0.72±0.87、0.34±0.60、0.02±0.03.K-ras基因野生型胰腺癌细胞Gli1、Smo mRNA的表达水平均较突变型胰腺癌细胞株显著降低,其中野生型BxPC-3细胞Gli1、Smo mRNA表达量显著低于突变型AxPC-1细胞(P值均＜0.05).结论 胰腺癌细胞株中Hedgehog信号通路活化与K-ras基因突变具有相关性.
关键词： 胰腺肿瘤 K-RAS 点突变 Hedgehog信号通路 转录因子 -
家族性糖尿病人群中线粒体ND-1基因点突变的分析研究
目的 了解线粒体ND-1基因mt3316 G→A、mt3394 T→C变异在中国家族性糖尿病人群中的发生率及其临床特点.方法 应用PCR-RFLP结合直接测序方法对随机抽取的无亲缘关系的770个糖尿病家系的先证者及309例非糖尿病对照者进行线粒体基因mt3316 G→A、mt3394 T→C变异的筛查.结果 在糖尿病先证者组中发现17例(2.21%)mt3316 G→A变异,18例(2.34%)mt3394 T→C变异;在正常对照组中分别发现5例(1.62%)和6例(1.94%)变异携带者,变异的发生率在两组间差异无统计学意义.在糖尿病先证者组见到2例同时携带上述两种变异者.伴mt3316 G→A或mt3394 T→C突变的糖尿病组与无该变异的糖尿病组之间的临床特点(年龄、体质指数、胰岛素抵抗指数)比较差异无统计学意义.结论 线粒体ND-1基因mt3316 G→A,mt3394 T→C变异可能不是中国人线粒体糖尿病发病的致病原因,而是中国人线粒体的基因多态.
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等位基因特异性多重聚合酶链反应方法用于快速检测结核分枝杆菌利福平耐药株
目的建立检测耐利福平(RFP)结核分枝杆菌的等位基因特异性多重聚合酶链反应(multiplex allele specific polymerase chain reaction,MAS-PCR)方法,快速、特异地检测rpoB基因核心突变区的主要突变,用于快速诊断结核分枝杆菌对利福平的耐药性.方法根据结核分枝杆菌的rpoB序列,分别设计出3对特异性寡聚核苷酸引物,采用MAS-PCR技术,分别检测rpoB基因上531、526、516这3个常见的突变位点的突变.结果对临床分离的利福平敏感株(15株)及利福平突变株(81株) 进行检测,以直接测序结果为参照,对利福平耐药株的总检出率为81.5%(66/81).结论MAS-PCR方法敏感、特异,可快速、简便地检测结核分枝杆菌rpoB基因突变,有利于耐药结核分枝杆菌的快速检测.
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阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征患者β3肾上腺素受体基因Trp64Arg突变的研究
随着阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSAHS)研究的深入,越来越多的研究涉及遗传因素.自从1978年Strohl等[1]首次证实了1例家族性OSAHS后,相继出现了OSAHS存在家族聚集现象[2]和遗传因素[3]的报道.有研究指出,几乎有30%～40%的与呼吸暂停发生有关的危险因素可以用遗传因素来解释[4],其中肥胖作为OSAHS的重要危险因素,主要由遗传因素决定[5].β3-AR是一种G蛋白偶联的膜表面受体,主要分布于棕色脂肪组织,具有调节脂肪分解和能量消耗的重要作用.近年有研究报道,β3-AR基因第64位密码子点突变可致机体内脂肪分解下降,生热作用减弱,成为肥胖的发病因素之一[6].那么β3-AR的基因突变是否可能通过肥胖而影响OSAHS的发病呢?我们的研究旨在探讨β3-AR基因突变与肥胖及OSAHS发病之间的关系.目前国内外尚无相关报道.
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线粒体融合素2突变体对血管平滑肌细胞凋亡的影响
目的 研究大鼠线粒体融合素2(mitofusin 2,Mfn2)基因蛋白激酶A(PKA)磷酸化位点的2种突变体对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)凋亡及其相关的信号通路的影响.方法 构建4种重组腺病毒,分别携带磷酸化位点突变为丙氨酸(重组1组)、Mfn2基因(重组2组)、突变为天冬酰胺(重组3组)和半乳糖苷酶基因(对照组),感染培养的VSMCs,另设未感染腺病毒的空白组.流式细胞术比较各组细胞的凋亡率,JC-1染色法检测线粒体膜电位变化,Western blot分析各组Mfn2蛋白的表达以及磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)和活性半胱天冬酶9(caspase-9)表达.结果 与空白组和对照组比较,重组1组、重组2组和重组3组Mfn蛋白显著增加(P<0.01);重组1组和重组2组细胞凋亡率显著增强(P<0.01);线粒体膜电位显著降低(P<0.01);p-Akt表达水平显著降低(P<0.01),活性caspase-9表达水平显著增高(P<0.01);且重组1组作用较重组2组更明显(P<0.01);而重组3组上述指标无显著差异(P>0.05).结论 Mfn2突变为丙氨酸的位点PKA通过Akt信号及线粒体途径诱导VSMCs凋亡的作用较Mfn2更明显,表明PKA磷酸化位点是调控Mfn2诱导VSMCs凋亡的重要功能位点.
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15个多发性内分泌腺瘤2A型家系的临床和RET基因突变研究
目的 研究15例多发性内分泌腺瘤2A型(MEN2A)先证者及其家系成员的临床表型和RET原癌基因突变情况.方法 收集15例MEN2A先证者家系的共119名家系成员,提取其外周血基因组DNA,分别对RET原癌基因第8、10、11、13、14、15、16外显子进行PCR产物直接测序.结果 在15个MEN2A家系中,共有49例检出RET原癌基因突变.其中37例有MEN2A临床表型,另12例为基因携带者,前者诊断MEN2A的年龄显著晚于后者[(43.0±13.9)岁比(9.8±7.4)岁,P＜0.01];37例MEN2A患者中甲状腺髓样癌(MTC)、嗜铬细胞瘤(PCC)和甲状旁腺增生或腺瘤(HPT)的发生率分别为91.9%,56.8%和10.8%;在15个MEN2A家系中,共检出5种基因突变类型,均位于RET原癌基因第11外显子634位点,分别为:C634W(13.3%),C634Y(46.7%),C634R(26.7%),C634F(6.7%),C634S(6.7%).结论 15个MEN2A家系中,37例有临床表型的MEN2A患者平均确诊年龄高于国外相关报道;MEN2A患者MTC和PCC的发病率和国外文献报道的基本一致,而HPT则较低;所有MEN2A患者的RET原癌基因突变均位于634位点,较国外文献报道的单一.
关键词： 多内分泌腺瘤形成2a型 甲状腺肿瘤 原癌基因 点突变 -
2A型多发性内分泌腺瘤家系RET原癌基因突变的分子筛查及五肽胃泌素激发试验的临床意义
目的 检测两个2A型多发性内分泌腺瘤(MEN2A)家系中RET原癌基因突变情况,初步探讨两个家系发病的分子机制及了解五肽胃泌素激发试验在MEN2A诊疗中的意义.方法 提取两个MEN2A家系共6名成员外周血基因组DNA,对RET原癌基因21个外显子进行PCR,PCR产物进行直接测序,对4例患者测定血降钙素并行五肽胃泌素激发试验.结果 两个家系中各有2例患者分别携带RET原癌基因外显子11的C634R突变和C634Y突变.初诊及复发的MEN2A患者血清降钙素明显升高(400.5～13 510.7 ng/L,正常值16.6～132.8 ng/L),五肽胃泌素激发后升高更显著(494.1～33 901.9 ng/L).结论 本研究中临床诊断为MEN2A的家系存在RET原癌基因外显子11的C634位点突变.血降钙素水平及五肽胃泌素激发试验有助于临床诊断和疗效随访.
关键词： 多内分泌腺瘤形成2a型 原癌基因 点突变 肽胃泌素激发试验 -
RET原癌基因点突变所致多发性内分泌腺瘤病2B型一例家系研究
目的研究1例中国家系中RET 原癌基因点突变与多发性内分泌腺瘤病2B 型(MEN-2B)发病的相互关系及其遗传特征.方法收集1例MEN-2B患者术后甲状腺髓样癌肿瘤组织和外周血DNA标本及其父母外周血DNA标本运用PCR和逆转录PCR技术以及直接基因测序技术对上述标本中RET原癌基因16号外显子区域进行分子检测.结果在患者肿瘤组织(c)DNA及其外周血DNA中均检测到RET原癌基因16号外显子918密码子处基因点突变,即:918Met(ATG)→Thr(ACG).且由基因测序图示,该突变为杂合子错义突变.而患者父母外周血DNA样本中均未发现上述RET原癌基因点突变.结论与国外报道相似,在中国MEN-2B患者中,也找到了RET原癌基因16号外显子基因点突变918Met(ATG)→Thr(ACG).虽然其发病具有遗传倾向,但同样存在散发病例.MEN-2B发病的基因检测应成为该病的诊断治疗以及患者一级亲属早期诊断和临床干预的分子基础.
关键词： 多内分泌腺瘤形成-2b 原癌基因 点突变 -
特发性骨髓纤维化患者JAK2V617F和MPLW515L点突变及JAK2外显子12突变的研究
特发性骨髓纤维化(IMF)为慢性骨髓增殖性疾病(CMPD)的一种,缺乏特异性诊治.现在研究表明近一半的IMF患者存在JAK2V617F点突变,另外,MPLW515突变及JAK2外显子12突变的发现提示MPD除了JAK2V617F点突变以外存在其他的发病机制[1].本研究应用等位基因特异性-聚合酶链反应(AS-PCR)及基因测序检测30例IMF患者的JAK2V617F、MPLW515L点突变及JAK2外显子12突变,了解其在IMF患者中的发生情况.
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中国青岛汉族人群Na-Cl共转运子高频杂合突变p.T60M与血压差异的关系
目的 研究中国汉族人群Na-Cl共转运子高频杂合突变p.T60M正常携带者是否具有小剂量应用噻嗪类利尿剂的特征.方法 2009年1月至2010年12月从本研究组既往确诊的Gitelman综合征家系和健康人群中招募p.T60M携带者38例(研究组),其中男19例,女19例,平均年龄(40±12)岁.另以同期在青岛大学医学院附属医院接受体检且性别、年龄和体质指数与研究组匹配的非p.T60M携带者38名为对照组,其中男19名,女19名,平均年龄(41±12)岁.检测血压、血钾、血糖水平,采用直接测序法检测Na-Cl共转运子编码基因.采用t检验或卡方检验进行统计学分析.结果 研究组血压明显低于对照组[收缩压:(110±14) vs( 119±15)mm Hg(1 mm Hg=0.133kPa),t =2.686,P＜0.01；舒张压:(70±7) vs(75±8)mm Hg,t =2.944,P＜0.01],空腹血糖明显高于对照组[(5.4±0.7) vs (5.0±0.7) mmol/L,t =2.432,P＜0.01].研究组空腹血糖受损14人,对照组空腹血糖受损6人.研究组24h尿钠排泄量高于对照组[(170±36) vs( 160±39) mmol/24 h],但差异无统计学意义(t =1.286,P＞0.05).结论 p.T60M携带者血压更低,存在轻度糖代谢异常.
关键词： Gitelman综合征 血压 协同转运子 点突变 -
凝血因子V 1691 A基因突变在新疆地区的分布
凝血因子V(coagulation factor V,FV)在凝血过程中是重要的辅助因子,其基因中一个点突变1691G→A,使它对抗凝血系统中的一种血浆蛋白质C(APC)的失活作用产生抗性,使血栓发生的风险增大.本研究应用多聚酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP),对新疆地区219例(98例汉族、67例维吾尔族和54例哈萨克族)健康个体进行了研究.
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扩张型心肌病和心肌炎患者的线粒体DNA突变
线粒体疾病中常见心脏受累，近几年在扩张型心肌病（DCM）患者中发现多种线粒体DNA（mtDNA）突变。我们研究了原发性DCM和急性心肌炎患儿外周血淋巴细胞中mtDNA缺失和点突变，探讨mtDNA突变与二者的关系。 一、资料与方法 1．对象：（1）DCM组：DCM患儿15例，平均年龄7.9岁，DCM诊断根据九省市心肌炎协作组1980年制定的小儿原发性心肌病诊断依据;（2）急性心肌炎组：根据第六届全国小儿心血管会议制定的心肌炎诊断标准，临床诊断为急性心肌炎的患儿（病程 < 3个月）13例，平均年龄8.0岁;（3）正常对照组：正常小儿10例，平均年龄8.1岁。 2．方法：常规苯酚/氯仿法抽提外周血淋巴细胞DNA。参照人mtDNA Cambridge顺序合成A1(3 108～3 127位) / A2(3 701～3 720位)、B1(8 286～8 305位) /B2(13 831～13 850位)和C1(同B1，8 286～8 305位) / C2(16 142～16 161位)三对PCR引物。（1）保守区3 108～3 717位检测点突变：A1、A2为引物进行PCR扩增，HET（异源双链）胶检测点突变，出现迁移速率不同的两条带者为有点突变者；（2）5 kb（8 469～13 447位）和7.4 kb（8 637～16 087位）缺失检测：分别以B1、B2和C1、C2为引物进行PCR扩增;（3）定量PCR分析：在同一PCR反应体系中同时加入A1、A2和B1、B2两对引物，A1、A2产物反映正常mtDNA含量，B1、B2产物反映5 kb缺失mtDNA的含量。用上海复日生物科技有限公司的生物电泳分析系统软件定量分析两者的相对含量。
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肺栓塞与凝血因子Ⅴ Leiden突变关系的研究
目的探讨凝血因子Ⅴ Leiden突变与具有易栓症的肺栓塞之间的关系.方法经放射性核素肺通气-灌注扫描、螺旋CT和(或)肺动脉造影检查并结合临床资料确诊的肺栓塞患者20例,所有患者均符合易栓症条件,同时选取性别、年龄匹配的健康对照者20例.采用酚-氯仿抽提技术提取基因组DNA,聚合酶链反应(PCR)扩增DNA,用测序技术测定扩增基因序列.结果肺栓塞组及对照组均不存在凝血因子Ⅴ Leiden突变.结论 (1)我国凝血因子Ⅴ Leiden突变频率可能很低.(2)凝血因子Ⅴ Leiden突变可能不是国人肺栓塞的危险因素.
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RASSF1A基因在肝癌中表达失活的研究
新研究进展揭示,抑癌基因功能的抑制或失活,除了与基因片段的丢失,DNA序列的错位、缺失、重组、变换、点突变等机制相关外,还与DNA序列中CpG岛(CpG island)中胞嘧啶(C)碱基环上发生的甲基化(mCpG)有极其重要的相关性.
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干扰素调节因子3及其可变剪接体在膀胱癌组织中的表达及意义
目的 探讨干扰素调节因子3(IRF-3)及其4种可变剪接体在膀胱癌发生发展中的作用.方法 采用Trizol法提取正常尿路上皮原代细胞、769-P人肾透明细胞癌细胞株、EJ膀胱癌细胞株3种细胞及北京大学第一医院2012年9月至2013年1月诊治的24例膀胱癌患者的膀胱癌和癌旁正常组织总RNA,采用RT-PCR技术对IRF-3及其4种可变剪接体(IRF-3a、-3c、-3d、-3e)表达情况进行检测,并对组织IRF-3 cDNA开放阅读框架进行测序,检测突变点,分析实验数据.结果 正常尿路上皮中IRF-3d未见表达,IRF-3e的表达较769-P、EJ细胞株的表达弱.48例病理标本中,IRF-3、-3a广泛表达,-3a的表达水平与膀胱肿瘤的分期相关(P=0.01);-3d、-3e呈现出肿瘤特异性表达趋势(P＜0.05);-3c在膀胱肿瘤中表达也较正常组织广泛,但表达水平与正常组比较差异无统计学意义(P＞0.05).对IRF-3突变点检测发现有2种氨基酸的变异引起该分子蛋白二级结构发生变化.结论 IRF-3在正常及肿瘤组织中普遍存在表达,但其可变剪接体尤其是IRF-3d、-3e与膀胱肿瘤的发生相关,-3a的表达水平还与膀胱肿瘤的分期相关.
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膀胱癌MDM2、p53基因表达的临床意义
我们运用点杂交、PCR-SSCP、免疫组化技术(IHC)分别对膀胱移行细胞癌(TCC)组织和配对癌旁组织,以及非TCC正常膀胱粘膜组织中MDM2基因扩增和表达,p53表达和点突变情况进行对比检测,报告如下.
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三个多发性内分泌腺瘤2A型家系的临床诊治及RET原癌基因突变检测
目的 探讨3个多发性内分泌腺瘤2A型(MEN2A)家系的诊治及RET基因检测的临床意义.方法 分析1990年4月至2011年12月诊治的3个家系10例MEN2A患者的临床资料.男4例,女6例.5例以颈部占位就诊:3例接受了不规范的甲状腺全切除术,2例接受双侧甲状腺全切+双侧颈部改良淋巴结清扫；5例无甲状腺肿瘤症状的RET基因突变携带者行双侧甲状腺全切+至少双侧颈部Ⅵ区淋巴结清扫.6例伴发肾上腺嗜铬细胞瘤(PHEO):5例行双侧PHEO一期切除,1例行单侧PHEO切除.3个家系共23例成员接受外周血RET基因检测.结果 病理均明确诊断双侧甲状腺髓样癌(10/10).有、无症状的甲状腺髓样癌(MTC)患者间的首次平均诊断年龄[39.0(31 ～64)岁比18.2(5.5 ～36)岁]、肿瘤大直径[2.8(1.2～5.6) cm比0.7(0.2 ～ 1.3) cm]、淋巴结阳性转移率[100％ (5/5)比20％ (1/5)],差异均有统计学意义(均P＜0.05).MTC随访7～ 66个月,术后降钙素有症状组均升高(5/5),无症状组仅见1例升高(P＜0.05).6例PHEO(60％)的平均诊断年龄42.0岁,5例为双侧多发,1例为单侧单发；3例双侧PHEO术后需终生口服激素替代.PHEO随访19 ～ 104个月,6例均无复发或转移.基因检测均为RET基因p.C634Y突变(10/23),1个家系为RET基因p.C634Y新发突变(de novo).结论 基于RET基因和血清降钙素检测及早进行规范手术可有效治愈MEN2A-MTC；对伴有双侧PHEO者,应优先选择保留肾上腺皮质功能的腹腔镜下双侧PHEO一期切除术.
关键词： 多发性内分泌瘤病2a型 甲状腺肿瘤 嗜铬细胞瘤 原癌基因 点突变 -
甲状腺乳头状癌RAS基因突变与临床预后的关系
目的 观察甲状腺乳头状癌中RAS基因突变的情况,分析其突变对患者临床特点及预后的影响.方法 选取经病理证实为甲状腺乳头状癌的患者354例,对患者病情、治疗方式、病理特点、预后等情况进行详细研究.依RAS突变与否将患者分为两组.比较两组间病理类型、病情进展、复发情况及生存时间等方面的差异,通过多元回归分析评估RAS突变与不同变量间的相关性.结果 354例患者中86例有RAS突变.突变阳性与阴性者对比,两者原发灶状态(P=0.004)、远处转移(P=0.027)、病情分期(P=0.004)及ATA危险分层(P =0.000)间差异有统计学意义.RAS突变阳性者复发率较高,无复发生存时间较短(P ＜0.005).RAS突变与ATA危险分层存在明显相关性.结论 RAS突变增加了甲状腺癌患者术后复发的危险性,RAS突变和ATA危险分层是预测甲状腺乳头状癌预后的重要指标.
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GDDR位点突变载体的构建和稳转细胞系的建立
目的 构建GDDR位点突变载体,使GDDR翻译蛋白无法通过二硫键与TFF1结合,建立稳定转染GDDR位点突变载体的人胃癌SGC-7901稳转细胞系.方法 设计GDDR Cys38位点突变引物,构建GDDR位点突变的真核表达载体;脂质体法转染重组质粒至人胃癌细胞系SGC-7901;G418筛选阳性细胞并扩大培养;实时定量 PCR检测突变GDDR mRNA在人胃癌细胞系SGC-7901的表达.结果 经限制性内切酶酶切和DNA测序证实质粒中插入的为所需序列; 实时定量 PCR证实突变GDDR在人胃癌SGC-7901稳转细胞系高表达.结论 GDDR定点突变载体构建成功,建立了稳定转染GDDR位点突变载体的SGC-7901细胞系,为进一步研究GDDR的结构和功能提供了条件.
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HBV感染者HBsAg和HBsAb同时阳性的血清学异常模式的研究
目的：分析HBsAg和HBsAb同时阳性的慢性HBV感染者的血清学模式，分析病毒Pre-S/S区基因序列变异或缺失情况对其进行基因分型，并探讨其临床意义。方法采用酶联免疫分析法筛选出HBsAg和HBsAb同时阳性的慢性HBV感染者共100例，采用化学发光微粒子免疫分析确认，用实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测其HBV DNA含量，其中HBV DNA阳性者60例， HBV DNA阴性者40例。将60例HBsAg和HBsAb同时阳性的慢性HBV感染者作为实验组，并选取60例HBsAg（+）HBsAb（-）的慢性乙型肝炎患者作为对照组。采用PCR法体外扩增两组患者HBV Pre-S/S基因序列并测序分析，根据测序结果对患者的基因型进行分型，比较两组Pre-S/S基因变异情况，结合临床资料探讨其临床意义。结果实验组患者中B基因型19例、C基因型41例，对照组患者中B基因型18例、C基因型42例。实验组B基因型患者的年龄[（50.0±16.3）岁]大于C基因型[（34.0±13.4）岁]，差异具有统计学意义（F=31.6，P=0.0432）。实验组B基因型和C基因型的S区氨基酸突变率分别为10.8%和21.6%，差异具有统计学意义（F=24.31，P=0.046）。同样为C基因型的两组患者，实验组S区氨基酸突变为41.6%，显著大于对照组的氨基酸突变率（3.2%），差异具有统计学意义（F=85.68，P=0.006）。结论 HBsAg（+）且HBsAb（+）并伴有HBeAg（+）的患者血清中HBV DNA的阳性率显著增高。HBsAg和HBsAb同时阳性的现象与pre-S/S区基因突变具有显著关性，且C基因型的突变率高于B基因型患者的突变率。
