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新分子细胞生物学方法与技术研究进展
分子细胞生物学是从20世纪60年代迅速发展起来的一门新兴学科,通过对细胞核以及细胞质内的各种超微结构及其功能更为直观的认识,尤其是从分子水平上对其进行深入的探讨,使得分子细胞生物学日臻完善,并且也成为研究生命科学的重要技术.在医学研究领域,体细胞核移植、干细胞定向诱导分化、细胞重编程(特别是诱导性多潜能干细胞技术)的研究为我们制备体外疾病模型、研究疾病发生机制、寻求细胞及组织移植的新材料方面提供了重要的技术支撑.
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毛囊干细胞的研究进展
毛囊干细胞不仅对毛囊的形态发生和毛发的周期性生长起主导作用,同时还是表皮和皮脂腺更新的细胞来源.毛囊外根鞘隆突部的细胞具有干细胞的多种特征,包括慢周期性生长和自我更新能力等,因而被认为是毛囊干细胞的所在.毛囊干细胞的增殖分化受周围环境的诱导.研究者相继提出多种假说,包括隆突激活假说和干细胞迁移假说,解释干细胞在毛囊形态发生和周期性生长中的作用.其分子机制涉及Wnt、BMP、Shh等多种信号途径的相互作用,β-catenin和LEF1/TCF是其中的重要环节.
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干细胞研究的意义和存在的问题
本文以干细胞的定义、造血和神经干细胞的研究和应用为基础,就干细胞研究的意义和存在的问题进行评述.重点就干细胞的扩增和鉴定、干细胞的可塑性和多能干细胞、干细胞在组织修复和个体发育中的意义进行讨论.介绍当前研究动向,从分子生物学水平充分认识干细胞的本质,认识主导干细胞繁殖、定向和跨系分化的内在机制,以更有效地发挥干细胞的潜能,更好地为临床实践服务.
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脂肪来源干细胞的研究及临床应用前景
目的:总结脂肪干细胞的研究进展及在临床上的应用.方法:查阅国内外相关文献,对脂肪干细胞的分化能力及临床应用前景进行汇总分析.结果:脂肪干细胞具有多向分化潜能,在动物模型中进行组织修复、细胞移植等方面有成功报道.结论:作为种子细胞的脂肪干细胞有着广阔的临床应用前景,其研究有待进一步深入.
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干细胞组织工程构建先天性心脏病重建材料的研究进展
目的：总结干细胞组织工程构建先天性心脏病(先心病)外科重建材料的研究进展。方法在万方数据、PubMed 数据库查阅2005年1月—2014年12月与先心病、干细胞、组织工程及外科重建研究相关的文献，进行汇总分析。结果成体干细胞，特别是骨髓来源的间充质干细胞已经成功用于体外构建先心病外科重建材料的研究，在羊、狗等大动物实验中取得良好的结果，并应用于临床单心室的外科重建研究，临床效果满意。胚胎干细胞增殖能力旺盛，在体外能够分化为有功能的心肌细胞和内皮细胞，构建的组织工程心肌具备了新生儿心肌组织的特点。诱导多能干细胞具有胚胎干细胞相似的全能性，且不存在伦理问题，是非常有前途的组织工程心肌或血管研究的种子细胞来源。结论干细胞组织工程研究已经成功应用于临床。随着干细胞研究的深入，将会在先心病外科重建中发挥重要的作用。
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干细胞移植治疗脊髓损伤的实验研究进展
目的:探讨脊髓损伤后干细胞移植对神经功能恢复的作用机制及临床疗效.方法:检索国内外报道的实验大鼠脊髓损伤造模后干细胞移植的相关文献,对实验结果进行综合分析,评估大鼠神经功能恢复效果.结果:胚胎干细胞、神经干细胞、骨髓间充质干细胞、许旺细胞、嗅鞘细胞移植到受损脊髓实验大鼠后可分化成不同功能类型的神经细胞,能释放促进宿主神经元再生的营养因子,重建轴突的连续性.结论:脊髓损伤后干细胞移植可重建脊髓神经传导的连续性,预示着干细胞在脊髓损伤的治疗中具有良好的应用前景.
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骨髓基质干细胞的研究进展
骨修复是骨科的基本问题,因创伤、股骨头坏死和骨组织手术等所导致的骨缺损常常需要植骨愈合.自体骨移植带来供骨部位并发症,异体骨移植存在排斥反应,两者骨来源都有限.关节软骨损伤不能自行修复,软骨移植因为来源有限和塑形困难,不能广泛使用.体内骨修复过程包括:血肿形成,化学信号趋化骨源性干细胞并促其分化,软骨内成骨.体外人工模拟这一过程,包括三方面因素:调控信号、细胞、细胞外基质.
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改良大鼠毛囊干细胞体外培养鉴定及诱导分化的研究
目的：探讨改良体外分离、培养、扩增、纯化 SD 大鼠毛囊干细胞(rHFSCs)及其免疫、超微结构的鉴定方法,观察 rHFSCs 的生物学特性及成脂、成骨分化能力。方法2015年1—6月选取清洁级1周龄 SD 大鼠6只,在无菌条件下切取 SD 大鼠触须部皮肤,用 Dispase 酶和Ⅳ型胶原酶混合液消化,显微镜下分离毛囊隆突部,用梯度加液组织块贴壁法培养 rHFSCs,用两步酶消化法传代,用Ⅳ型胶原差速贴壁法纯化 rHFSCs。收集第3代 rHFSCs,采用流式细胞术、免疫荧光染色及透射电镜观察 rHFSCs 内部结构等方法鉴定 rHFSCs。收集第1~10代 rHFSCs 检测细胞活力,第3、5、7、9代rHFSCs 培养第1~8天时检测细胞增殖能力。收集第3代 rHFSCs,按培养液的不同分为诱导组和对照组,对比两组目的基因 PPAR-γ、C/ EBPa、OPG、Runx2的相对表达量及染色后的光密度(OD)值变化情况,观察 rHFSCs 的成脂、成骨分化能力。结果通过改良方法分离、培养、纯化的 rHFSCs 呈典型的铺路石状,生长曲线呈“S”形,生长增殖能力良好,克隆形成能力强。透射电镜显示细胞处于原始状态。流式细胞术检测显示 Integrin β1、Integrin α6、P63呈高表达,CK15呈中等表达,符合 rHFSCs 标记鉴定特点。免疫荧光染色和透射电镜观察 rHFSCs 内部结构证明细胞的类型属于毛囊干细胞。rHFSCs 成脂诱导培养7 d 后 RFqPCR 定量结果显示,诱导组目的基因 PPAR-γ、C/ EBPa 的相对表达量(5.598±0.168、4.757±0.416)均明显高于对照组(1.119±0.344、1.126±0.355),差异均有统计学意义(t =34.955、20.266,P 值均<0.01)；诱导14 d 后细胞油红 O 染色阳性,诱导组 OD 值(2.472±0.091)明显高于对照组(0.817±0.003),差异有统计学意义(t =114.641, P <0.05)。 rHFSCs 成骨诱导培养14天后 RFqPCR 定量结果显示,诱导组目的基因 OPG 和 Runx2的相对表达量(1.921±0.275,3.892±0.265)明显高于对照组(1.085±0.288,1.046±0.216),差异均有统计学意义(t =4.667、17.332, P 值均<0.01)；诱导21 d 后细胞茜素红染色阳性,诱导组 OD 值(0.716±0.016)明显高于对照组(0.076±0.002),差异有统计学意义(t =14.078, P <0.01)。结论采用改良体外分离、培养、扩增、纯化方法可成功建立 rHFSCs 体外培养体系,rHFSCs 具有纯度大、增殖效率高、多向分化潜能强等特点,可为干细胞组织工程学相关发展提供良好的种子细胞。
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肝细胞生长因子对重症急性胰腺炎小鼠肠黏膜屏障保护作用
目的 探讨肝细胞生长因子(HGF)对重症急性胰腺炎(SAP)小鼠肠黏膜屏障功能障碍修复作用及机制,以及肠道干细胞在黏膜损伤修复中的作用.方法 健康雄性昆明小鼠60只,按数字表法随机分成正常对照(NC)组10只、SAP组25只和HGF组25只.酶耦联紫外分光光度法检测血清D-乳酸水平,肠系膜淋巴结、胰腺、肝脏、脾脏及肺组织细菌培养,流式细胞仪检测肠上皮细胞增殖指数,免疫组化染色法检测小肠隐窝干细胞变化.结果 SAP组血清D-乳酸值为(11.17±1.90) mg/L,较NC组(4.87±0.73) mg/L和HGF组(7.30 ±0.88) mg/L高,差异均有统计学意义(F=78.20,P值均＜0.01).胰腺、肠系膜淋巴结、肝脏、脾脏、肺脏细菌培养器官移位率SAP组(50％,40/80)高与NC组(14％,7/50)和HGF组(29％,29/100)(x2=7.427,x2=4.112,P值均＜0.01).肠黏膜上皮细胞增殖指数SAP组较NC组和HGF组明显下降(F=42.71,P值均＜0.05),HGF组与NC组比较则明显升高(P＜0.01).SAP组小肠隐窝干细胞数(1.26±0.87)个,低于NC组(2.16±0.90)个和HGF组(2.50±0.96)个,差异均有统计学意义(F=8.34,P值均＜0.01).结论 HGF可促进肠黏膜上皮细胞的增殖,降低肠道通透性及肠道细菌移位率,减轻急性胰腺炎小鼠肠黏膜的损伤.
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脊髓神经管神经上皮干细胞的分离培养和诱导分化
目的从胚胎大鼠脊髓神经管中分离神经上皮干细胞并诱导其向多巴胺能神经元方向分化.方法利用无血清悬浮培养、单细胞克隆技术分离神经上皮干细胞;采用5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)标记新生细胞,免疫细胞化学单标或双标染色技术,检测神经上皮干细胞蛋白(nestin)和分化后特异性神经细胞抗原的表达;用纹状体组织提取液,诱导神经上皮干细胞向多巴胺能神经元方向分化.结果从胚胎大鼠脊髓神经管中分离的细胞可以连续传代,表达nestin,它们分化后可以表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原;与对照组3%相比,纹状体组织提取液可以诱导这些细胞中的12%分化成为多巴胺能神经元.结论分离自脊髓神经管的细胞具有自我更新能力和多分化潜能(multipotent),是增殖能力很强的神经干细胞;这些干细胞在一定的体外环境中能被诱导成为特定的神经元,提示其可以为神经移植提供材料.
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胎鼠表皮干细胞的体外分离培养及rAAV2/eGFP转染的研究
目的 对表皮干细胞(ESCs)进行分离培养和鉴定,利用携带绿色荧光蛋白(eGFP)基因的重组腺相关病毒(rAAV)转染表皮干细胞,探索不同滴度rAAV2/eGFP的转染效率.方法 1.获取胎鼠表皮单细胞悬液.2.利用层黏连蛋白(laminin)和Ⅳ型胶原(Collagen Ⅳ)筛选ESCs,在体外进行培养和鉴定.3.将ESCs按5×104个/孔接种入24孔培养板中,按照不同的病毒基因数与转染细胞数之比(MOI)加入所需rAAV2/eGFP病毒,计数绿色荧光细胞数目,并计算转染效率. 结果 1.ESCs对Laminin和Collagen Ⅳ的吸附性很好,克隆形成率较高.2.对ESCs进行β1整合素(Integrinβ1)单抗、角蛋白19(Keration 19,K19)单抗的免疫细胞化学染色,均呈阳性表达.3.利用rAAV1eGFP病毒体外转染ESCs,可稳定表达eGFP.结论 用Laminin和Collagen Ⅳ快速黏附法可从胎鼠皮肤分离和富集ESCs.
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大鼠气管损伤修复过程中ABCG2转运蛋白的表达
目的观察离体大鼠气管上皮损伤修复过程中气管干细胞的动态变化.方法用氟脲嘧啶(5-FU)造成离体大鼠气管上皮损伤,应用间接免疫荧光法和Western blotting动态观测了修复过程中各时间点气管上皮ABCG2的表达.结果 1.5-FU作用12 h后大部分气管上皮脱落,残留的G0期细胞中部分可见ABCG2表达阳性.去除5-FU后3 h细胞数目增多,为扁平状,ABCG2阳性细胞数也随之增多;6～9 h上皮细胞由扁平变为立方,ABCG2阳性细胞数继续增多;24 h上皮细胞呈立方状,并连接成片,ABCG2阳性细胞较前明显减少;48 h气管上皮接近恢复假复层结构,此时仅见极少量ABCG2阳性细胞.正常气管上皮未检测到ABCG2表达.2.Western blotting分析表明,ABCG2表达量的变化趋势与免疫荧光结果一致.结论 ABCG2的表达与干细胞的数量呈正相关,可作为气管干细胞的标志物.
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羊膜对人脐血干细胞分化为多巴胺能神经元的作用
目的 探讨羊膜上皮细胞对人脐血干细胞定向分化为多巴胺能神经元的作用.方法 体外分离、原代培养人羊膜上皮细胞,通过高速离心制备成条件培养液(CM)对P1代脐血十细胞进行诱导,倒置相差显微镜观察细胞形念的变化,应用免疫荧光染色和免疫印迹法检测其酪氨酸羟化酶(TH)及多巴胺转运体(DAT)蛋白的表达情况.结果 P1代脐血干细胞经羊膜上皮细胞条件培养液诱导后,TH及DAT阳性细胞率明显高于对照组,与对照组比较有显著性差异(P<0.01),免疫印迹分析结果 与免疫荧光染色结果 一致.结论 羊膜上皮细胞能诱导人脐血问充质干细胞定向分化为多巴胺能神经元.
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人支气管上皮损伤修复过程中Rhodamine 123 染色的动态观察
目的探讨离体人支气管上皮经5-氟尿嘧啶(5-FU)损伤前后及修复过程中支气管上皮细胞Rhodamine 123的染色情况.方法分别取5-FU作用前后及修复3、6、24 h的人支气管上皮,蛋白酶消化法获取细胞悬液,进行流式细胞仪分析:1.应用PI染色,确定细胞周期中各期细胞所占百分数;2.Rhodamine 123染色,计算Rhodamine 123阴性细胞占活细胞的比例.结果1.5-FU处理后支气管上皮细胞中凋亡细胞增多,增殖期(S+G2/M期)细胞明显减少,剩余细胞绝大部分处于细胞周期的静止(G0/G1)期;随支气管上皮的恢复,S+G2/M期细胞增多;2.5-FU作用后支气管上皮中Rhodamine 123阴性细胞占活细胞的比例较正常组增多;随着损伤的修复,Rhodamine 123阴性活细胞所占比例逐渐降至接近正常.结论5-FU的作用使增殖期细胞凋亡、脱落,残留静止期细胞,其中包含具有Rhodamine 123排出能力的干细胞,由它们完成损伤的修复.应用Rhodamine 123染色,经流式细胞仪分选5-FU作用后残留的细胞,可用于富集纯化支气管干细胞.
关键词： 支气管 干细胞 5-氟尿嘧啶 Rhodamine 123 人 -
人脐血干细胞定向分化为多巴胺能神经元的实验研究
目的 探讨人脐血干细胞定向分化为多巴胺(DA)能神经元的佳诱导条件.方法 体外分离、原代培养人脐血干细胞,流式细胞仪检测其表面标志,分别以EGF+bFGF、ATRA、ATRA+EGF+bFGF、纹状体条件培养液、纹状体星形胶质细胞条件培养液对其进行诱导,倒置相差显微镜观察细胞形态的变化.应用免疫荧光染色技术检测DA能神经元标志物酪氨酸羟化酶(TH)的表达.结果 比较各组对人脐血干细胞定向分化为DA能神经元的诱导作用,纹状体星形胶质细胞条件培养液＞纹状体条件培养液＞ATRA+EGF+bFGF组＞ATRA组＞EGF+bFGF组＞对照组.结论 纹状体组织对人脐血干细胞定向分化为DA能神经元的诱导作用优于其他各组,并且此作用可能主要源于纹状体的星形胶质细胞.
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成人毛囊干细胞分选及β-连环蛋白表达的研究
目的寻找一种快速简便的分离毛囊干细胞的方法,探讨β-连环蛋白(β-catenin)信号分子在毛囊干细胞增殖分化中的调节作用.方法利用毛囊干细胞黏附性强的特点,通过将毛囊细胞悬液黏附于包被有人胶原的平板而使富集毛囊干细胞分离.利用毛囊干细胞标志物Keratin 19(K19)及体外集落形成能力进行鉴定.采用免疫细胞化学及原位杂交技术检测分选后的毛囊干细胞β-catenin的表达情况.结果毛囊干细胞悬液黏附于人胶原20 min后,K19的表达增加1.6倍,集落形成能力增加3.5倍.β-catenin在细胞核中的蛋白表达增加. 结论快速黏附法可以使富集毛囊干细胞分离,β-eatenin参与了毛囊干细胞的增殖及分化调控.
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胰岛素样生长因子-1对骨骼肌源性干细胞的促增殖效应
目的 观察胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对骨骼肌源性干细胞(MDSCs)生长的影响.方法 采用连续预贴壁法从新生小鼠后肢肌分离培养MDSCs;用含2%胎牛血清的DMEM培养基促进其向骨骼肌细胞分化.免疫细胞化学SP法检测于细胞标志Sca-1和骨骼肌细胞标志肌节(α-sarcomeric)肌动蛋白的表达情况;采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测IGF-1对MDSCs增殖的影响,并分析IGF-1效应与培养时间以及与IGF-1浓度之间的关系.结果 从新生小鼠后肢肌成功分离培养MDSCs,90%以上的MDSCs呈Sca-1阳性;在分化培养中MDSCs能够产生α-sarcomeric 肌动蛋白阳性的肌管;IGF-1对MDSCs促增殖作用随细胞培养时间的延长逐渐明显;随IGF-1浓度的增加而增加,并逐渐趋于饱和.结论 IGF-1对体外培养的MDSCs有促进增殖的作用.
关键词： 干细胞 骨骼肌 胰岛素样生长因子-1 免疫细胞化学 小鼠 -
小鼠角膜的发生与细胞凋亡
目的 通过观察小鼠角膜的发生过程,探讨角膜细胞的增殖与凋亡对角膜结构修复与塑形的作用.方法 各日龄共计120只小鼠,用HE染色或4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色对小鼠角膜的一般结构进行观察；用5’-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)技术标记角膜增殖细胞和免疫荧光法标记干细胞和凋亡细胞.结果 胚胎发育及出生后早期,角膜以实质层的发育为主.出生14d(P14)左右,角膜上皮细胞层开始增殖分化为两层细胞,同时内皮细胞也开始分化.至P30时,我们可以辨别出角膜的6层结构.BrdU阳性细胞主要存在实质层中的成纤维细胞,出生以后也可见于角膜上皮细胞层和内皮细胞层.随着角膜发育,P10左右,其他层的BrdU阳性细胞都消失,仅存在于角膜上皮细胞层.增殖细胞核抗原(PCNA)阳性细胞在发育早期散在分布于角膜的各层,P14以后PCNA阳性细胞均匀的分布于角膜上皮细胞的基底层,并维持在稳定状态.在角膜发育早期,在各层可见许多细胞凋亡.结论 角膜的发育与其感光功能形成的过程相一致,角膜干细胞的增殖与其修复有关；有大量的凋亡细胞参与角膜结构的塑形.
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人骨髓间充质干细胞体外分化为结膜上皮样细胞
目的 探讨体外诱导人骨髓基质干细胞(hMSCs)向结膜上皮样细胞(hCjEs)定向分化的可能性.方法 体外分离、培养hMSCs和人hCjEs,分别从细胞形态学和免疫细胞化学的方法对细胞进行鉴定;Transwell非接触共培养法诱导hMSCs向结膜上皮样细胞定向分化;倒置相差显微镜观察分化细胞的形态学改变;免疫细胞化学和反转录聚合酶链反应分别对分化细胞角蛋白13(CK13)的蛋白和mRNA表达进行检测;并用单独培养的hMSCs和hCjEs做对照.结果 实验获取的hMSCs以长梭形为主,融合呈漩涡状;hCjEs呈不规则圆形或多边形,融合的hCjEs成铺路石样;hMSCs阳性表达CD44和CD29,hCjEs阳性表达CK13;非接触共培养使hMSCs的形状由长梭形逐渐变为不规则多边形;免疫细胞化学和RT-PCR分别在蛋白和基因水平证实分化细胞表达CK13,与单独培养的结膜上皮细胞表达相似.结论 在一定条件下,可以诱导体外培养的hMSCs形态发生变化、向具有结膜上皮细胞表型的上皮样细胞定向分化.
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人包皮成纤维细胞来源的多能性干细胞的建立
目的 探讨人包皮成纤维细胞重编程为诱导多能性干细胞(iPSCs)的方法.方法 利用反转录病毒携带绿色荧光蛋白(GFP)作为指示,转导到人包皮成纤维细胞中,确定佳的病毒感染剂量,应用经典的Yamanaka方法,联合小分子物质组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸盐( VPA)诱导人包皮成纤维细胞为多能性干细胞.通过碱性磷酸酶(AKP)染色及免疫荧光细胞化学方法,检测人胚胎干细胞多能性标记物在所建立的诱导多能性干细胞(iPSCs)中的表达,RT-PCR检测拟胚体(EB)三胚层特异基因的表达.结果 以GFP作为指示,建立了高效的反转录病毒感染体系,将人包皮成纤维细胞重编程为iPSCs;所建立的iPSCsAKP染色阳性,表达人胚胎干细胞多能性标记物OCT4、TRA-1-60和TRA-1-81,体外诱导分化后具有三胚层特异基因的表达；小分子物质VPA的添加并未显著提高重编程效率.结论 在GFP所指示的佳病毒感染剂量下,联合小分子物质VPA成功建立了人包皮成纤维细胞来源的iPSCs.
