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嗜人类T淋巴细胞病毒I型核心蛋白P24基因的克隆与表达
目的从感染HTLV-1的中国患者外周血单核细胞(PBMCs)中扩增编码HTLV-1核心蛋白P24的cDNA,并在大肠杆菌中进行表达.方法提取感染者PBMCs基因组DNA,应用巢式PCR方法扩增出HTLV-1核心蛋白P24的cDNA并测序,与pGEX-20T载体构建重组质粒,在大肠杆菌BL21中表达,采用ELISA和Western blot分析重组蛋白活性.结果 HTLV-1核心蛋白P24基因序列高度保守,构建重组载体后,在大肠杆菌中表达的重组蛋白,经检测具有较强的抗原活性.结论成功地表达了HTLV-1型病毒的核心蛋白P24基因,为国产诊断试剂和疫苗的研发打下了基础.
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应用毕赤酵母表达中国株HIV-1核心蛋白Gag
目的构建含HIV-1Gag全长基因的重组酵母表达质粒pPICGAG,并在毕赤酵母中进行表达.方法用Not I和XhoI将含HIV-1 Gag全长基因的质粒pKSGAG双酶切后,克隆到酵母表达载体pPIC9中,构建了重组表达质粒pPICGAG.pPICGAG用SacI线性化后,电转化毕赤酵母GS115,PCR鉴定阳性酵母转化子,并分别将PCR阳性的酵母转化子在BMGY和BMMY培养基中进行诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE电泳分析.结果酵母转化子的整合率为72.7%.SDS-PAGE结果显示表达蛋白的相对分子质量为55000左右,与预计计算的值相同.Western blot结果显示表达蛋白能与单克隆抗体发生特异性反应.结论在毕赤酵母中成功地表达了HIV-1核心蛋白Gag,且表达的蛋白具有良好的反应原性和特异性.
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010 HBV核心蛋白作为免疫载体的研究进展
外源基因插入HBV核心蛋白特定部位基因后,核心蛋白无论在真核细胞或原核细胞都能够正确地折叠和自身装配,因而其作为颗粒样载体具有显著的优越性.对HBc单体及其形成的核壳结构的不断深入了解,在免疫及基因治疗方面正在发挥重要的作用.本文对HBV核心蛋白的结构与功能及其作为免疫载体的应用进行了综述.
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丙型肝炎病毒核心蛋白基因真核表达质粒的构建和表达
目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白真核表达质粒,并在HepG2细胞中稳定表达.方法:采用RT-RCR方法从丙型肝炎患者血清中得到HCVC区的cDNA序列,然后克隆入pcDNA3.0载体,构建真核表达质粒pcDNA-HCV,并进行酶切鉴定和测序鉴定;采用脂质体转染技术将pcDNA-HCV稳定转染于HepG2细胞系,并用G-418进行筛选;采用Western Blotting方法和免疫细胞化学方法检测HepG2细胞中HCV核心蛋白表达情况.结果:从HCV感染者血清中扩增得到的503bpHCV cDNA序列.属于HCV 1型基因C区,并成功构建了真核表达质粒pcDNA-HCV.经Western blotting和免疫细胞化学检测,稳定转染的HepG2细胞中有HCV核心蛋白的表达.结论:成功构建HCV核心蛋白真核表达质粒pcDNA-HCV,并可以在真核细胞HepG2中稳定表达.
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丙型肝炎病毒核心蛋白与信号转导及转录活化蛋白3的相互作用
为了观察丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白(CORE)对信号转导及转录活化蛋白3(STAT3)表达的影响,寻找CORE与STAT3相互作用的功能区域.对Huh-7、转染表达CORE的Huh-7和含有全长HCV基因的复制子(Replicon)Huh-7的STAT3及磷酸化STAT3(p-STAT3)表达水平作比较;并对CORE与STAT3进行免疫共沉淀试验、谷胱甘肽S转移酶(GST)结合试验.结果显示,CORE能直接结合并诱导STAT3和p-STAT3表达,不同病毒株CORE及CORE不同功能区域结合STAT3和p-STAT3能力不同,CORE结合于STAT3主要依耐于CORE的N端的1～126氨基酸.因此,CORE与STAT3的相互作用可能是HCV感染又一新的分子致病机制,在引起HCV持续感染和肝细胞癌的发病机制中起重要作用.
关键词： 丙型肝炎病毒 核心蛋白 信号转导及转录活化蛋白3 -
乙型肝炎病毒BCP区1762/1764突变与肝细胞癌发生的相关性
全球有4亿HBV携带者,每年因HBV相关疾病而死亡的人数已经超过200万,其中有100万死于HBV诱发的肝细胞癌.HBV核心蛋白启动子(BCP)的变异是多位点和复合的,主要是1762(A-T)、1764(G-A)的双突变,BCP区是富含AT的区域,具有肝脏富含因子的独立结合点,变异的BCP可改变这种结合,降低前C区的RNA转录,终使HBeAg表达减少,平均降低70%.
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丙型肝炎病毒核心蛋白活化内源性大麻素系统诱导不完全线粒体自噬
目的 研究丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白活化内源性大麻素系统诱导不完全线粒体自噬的机制.方法 HepG2细胞或表达HCV核心蛋白的HepG2细胞与肝星状细胞(LX-2细胞)共培养.共培养后高效液相色谱-质谱联用技术检测2-AG水平,分光光度法测定检测线粒体呼吸链酶复合体活性,流式细胞仪检测细胞活性氧(ROS)水平,激光共聚焦显微镜检测Ca2+浓度和线粒体膜电位,试剂盒检测线粒体丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量,蛋白质免疫检测大麻素受体1(CB1R)、蛋白激酶B(Akt)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)和p62蛋白表达.计量资料采用t检验.结果 与LX-2细胞和HepG2细胞共培养组相比,LX-2细胞和表达HCV核心蛋白HepG2细胞共培养组,2-AG水平增加,线粒体呼吸链酶复合体活性下降,ROS水平和Ca2+浓度升高,线粒体膜电位下降,MDA升高而SOD下降,CB1R水平升高,p-Akt和p-mTOR表达下降,LC3-Ⅱ表达增加,而p62蛋白表达无明显差异.结论 HCV核心蛋白增加2-AG水平,上调CB1R表达;增加线粒体ROS水平和Ca2+浓度,降低线粒体膜电位;下调Akt和mTOR活性引起不完全线粒体自噬.
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丙型肝炎病毒核心蛋白下调沉默信息调节因子1导致肝窦内皮细胞功能障碍
目的 研究丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白对肝窦内皮细胞(LSEC)沉默信息调节因子1(SIRT1)表达及LSEC功能的影响.方法 HepG2细胞或表达HCV核心蛋白的HepG2细胞与LSEC共培养.应用液体闪烁计数仪、实时荧光定量-PCR(RT-PCR)、Western印迹检测LSEC SIRT1活性、mRNA和蛋白的表达,以及LSEC脂联素受体2(AdipoR2)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、第Ⅷ相关抗原(Von Willebrand factor, vWf)、分化抗原簇31(CD31)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)和CD14蛋白的表达.应用流式细胞仪检测细胞活性氧(ROS)水平,检测共培养上清液中丙二醛(MDA) 、超氧化物歧化酶(SOD)、脂联素、一氧化氮(NO)和内皮素-1(ET-1)的水平.计量资料采用t检验.结果 与LSEC和HepG2细胞共培养组相比,LSEC和表达HCV核心蛋白HepG2细胞共培养组SIRT1活性(0.3±0.1比1.0±0.3,t=5.422,P<0.01)、mRNA(0.4±0.1比1.0±0.2,t=6.573,P<0.01)和蛋白(0.3±0.08比1.0±0.3,t=5.613,P<0.01)水平下降;脂联素[(3.41±0.61)比(5.82±0.87)μg/mL,t=5.556,P<0.01]分泌减少且AdipoR2蛋白(0.3±0.1比0.8±0.2,t=5.477,P<0.01)表达下降;eNOS蛋白(0.4±0.1比0.9±0.3,t=3.873,P<0.01)表达下降;vWf蛋白(0.8±0.3比0.4±0.1,t=3.098,P<0.01)、CD31蛋白(0.9±0.2比0.3±0.1,t=6.573,P<0.01)、VEGF蛋白(0.9±0.3比0.5±0.1,t=3.873,P<0.01)表达增加;CD14蛋白(0.4±0.1比0.9±0.3,t=3.873,P<0.01)表达下降.共培养上清液中NO和SOD水平下降,ET-1和MDA水平升高. 结论 HCV核心蛋白下调SIRT1活性及表达,下调脂联素及受体表达,引起LSEC收缩和肝窦毛细血管化,增加氧化应激反应,导致肝窦微循环障碍.
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丙型肝炎病毒核心蛋白下调沉默信息调节因子1导致肝星状细胞活化
目的 研究丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白对肝星状细胞沉默信息调节因子1(SIRT1)表达及肝星状细胞活化的影响.方法 HepG2细胞或表达HCV核心蛋白的HepG2细胞与肝星状细胞(LX-2细胞)共培养.应用液体闪烁计数仪、实时荧光定量-PCR、Western印迹检测LX-2细胞SIRT1活性、mRNA及蛋白的表达.Western印迹检测LX-2细胞磷酸化AMP激活的蛋白激酶(p-AMPK)、脂联素受体2(AdipoR2)、转化生长因子-β1 (TGF-β1)蛋白的表达.ELISA法检测共培养上清液中人Ⅳ胶原(ColⅣ)、Ⅲ型前胶原肽(PⅢNP)、透明质酸(HA)和人层黏连蛋白(LN)的水平.计量资料采用t检验.结果 与LX-2细胞和HepG2细胞共培养组相比,LX-2细胞和表达HCV核心蛋白HepG2细胞共培养组SIRT1活性(0.4±0.1比1.0±0.2,t=6.573,P<0.01)、mRNA(0.3±0.1比1.0±0.3,t=5.422,P<0.01)和蛋白(0.4±0.1比0.8±0.2,t=4.382,P<0.01)水平下降;p-AMPK(0.3±0.1比0.8±0.2,t=5.477,P<0.01)和AdipoR2(0.4±0.1比0.8±0.2,t=4.382,P<0.01)表达下降;TGF-β1(2.3±0.5比0.8±0.2,t=6.823,P<0.01)表达增加;共培养上清液中ColⅣ、PⅢNP、HA和LN的水平增加.SIRT1激动剂白藜芦醇降低TGF-β1的表达.结论 HCV核心蛋白下调肝星状细胞SIRT1活性及表达,下调AdipoR2表达,上调TGF-βl表达,活化肝星状细胞.
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脂滴自噬在丙型肝炎病毒核心蛋白下调沉默信息调节因子1诱导小鼠肝脂肪变性中的作用
目的 研究脂滴自噬在HCV核心蛋白下调沉默信息调节因子1(SIRT1)诱导小鼠肝脂肪变性中的作用.方法 小鼠随机分为两组,每组10只.实验组小鼠尾静脉注射HCV core重组表达载体.对照组小鼠尾静脉注射磷酸盐缓冲溶液.1个月后处死小鼠.检测肝功能、脂联素、血清和肝内甘油三酰(TG)、肝脏组织病理学检查肝脂肪变性程度.蛋白质免疫法检测肝脏SIRT1蛋白、脂联素受体(AdipoR)蛋白以及脂滴自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)、脂肪分化相关蛋白(ADRP)、尾部作用蛋白(TIP 47)和P62蛋白的表达.计量资料采用t检验.结果 与对照组相比,HCV组小鼠出现肝脂肪变性;肝脏TG含量明显增加[(80.9±20.1)比(45.8±10.5) μg/mg,t=4.964,P＜0.01];血清脂联素[(1.05±0.25)比(1.41±0.45) ng/mL,t=2.211,P＜o.05]水平下降;SIRT1蛋白水平(o.4±o.1比0.9±0.2,t=7.071,P＜0.01)和AdipoR2蛋白水平(0.4±0.1比0.8±0.2,t=5.656,P＜0.01)下降;LC3-Ⅱ蛋白(0.8±0.2比0.4±0.1,t=5.656,P＜0.01)、TIP-47蛋白(0.9±0.3比0.4±0.1,t=5.000,P＜0.01)和ADRP蛋白(0.8±0.3比0.4±0.1,t=4.000,P＜0.01)表达增加;而p62蛋白(0.7±0.2比0.8±0.3,t=0.877,P＞0.05)表达水平差异无统计学意义.结论 HCV核心蛋白下调SIRT1表达,下调脂联素及受体表达,引起不完全脂滴自噬导致肝脂肪变性.
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丙型肝炎病毒核心蛋白下调AMP激活蛋白激酶导致肝细胞糖代谢紊乱
目的 探讨HCV核心蛋白对AMP激活蛋白激酶(AMPK)表达及肝细胞葡萄糖代谢的影响.方法 表达HCV核心蛋白的质粒转染L02人肝细胞.分别应用液体闪烁计数仪、实时荧光定量-PCR、Western印迹检测AMPK活性、mRNA及蛋白的表达.应用放射同位素法和葡萄糖氧化酶法测定肝细胞葡萄糖摄取率和糖异生.采用6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶联比色法和乳酸脱氢酶偶联比色法测定葡萄糖激酶(GK)和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)活性.RT-PCR检测AMPK下游调节糖代谢的基因的葡萄糖转运蛋白(GLUT)1、GLUT2、PEPCK、葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)和GK mRNA水平.结果 与转染空载体的L02人肝细胞相比,表达HCV核心蛋白L02人肝细胞AMPK α2活性[(0.2±0.05)比(1.0±0.3),t=6.443,P＜0.01]、AMPK α2 mRNA[(0.3±0.05)比(1.0±0.3),t=5.638,P＜0.01]及磷酸化-AMPK蛋白的表达水平[(0.2±0.05)比(0.6±0.2),t=4.753,P＜0.01]明显下降,PEPCK活性[mIU/min/mg蛋白:(35.80±8.70)比(25.50±5.80),t=2.413,P＜0.05]明显升高,而GK活性[mIU/min/mg蛋白:(1.70±0.35)比(3.55±0.84),t =4.929,P＜0.01]明显降低,葡萄糖摄取率[cpm:(5000±800)比(20000±5000),t=7.256,P＜0.01]及其调节基因GLUT2 mRNA水平[(0.5±0.1)比(1±0.3),t=3.873,P＜0.01]明显下降；糖异生[(2.5±0.5)比(1.0±0.2),t =6.823,P＜0.01]及其调节基因PEPCK[(2.8±0.7)比(1.0±0.3),t=5.789,P＜0.01]、G6Pase mRNA水平[(2.5±0.5)比(1.0±0.2),t=6.822,P＜0.01]明显升高；GK mRNA水平[(0.6±0.1)比(0.9±0.3),t=2.324,P＜0.05]明显下降.结论 HCV核心蛋白下调AMPK活性及表达,改变其下游调节糖代谢相关基因表达,降低葡萄糖摄取能力,增加糖异生,导致肝细胞葡萄糖代谢紊乱.
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丙型肝炎病毒核心蛋白下调AMP激活蛋白激酶对肝细胞脂类代谢的影响
目的 探讨HCV核心蛋白对AMP激活蛋白激酶(AMPK)表达及肝细胞脂类代谢的影响.方法 表达HCV核心蛋白的质粒转染HepG2细胞.分别应用液体闪烁计数仪、实时荧光定量-PCR(RT-PCR)、Western印迹检测AMPK活性、mRNA及蛋白的表达.试剂盒检测三酰甘油、总胆固醇(TC)的含量,液闪计数仪检测脂肪酸β氧化速度,流式细胞仪、硫代巴比妥酸比色法、黄嘌呤氧化酶法分别测定活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性.RT-PCR检测AMPK下游调节脂类代谢的基因固醇调节元件结合蛋白(SREBP)-1c、脂肪酸合成酶(FAS)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、SREBP-2、羟甲基戊二酸单酰CoA还原酶(HMGR)、羟甲基戊二酸单酰CoA合成酶(HMGS)、过氧化物酶体增殖活化受体(PPAR)α、PPAR y、肉碱脂酰转移酶1(CPT1) mRNA水平.结果 与转染空载体的HepG2细胞相比,表达HCV核心蛋白HepG2细胞AMPKα2活性(0.2±0.05比1.0±0.2,t=9.505,P＜0.01)、AMPK α2 mRNA(0.3±0.1比1.0±0.3,t=5.422,P＜0.01)及磷酸化-AMPK蛋白的表达水平(0.25±0.05比0.6±0.2,t=4.159,P＜0.01)明显下降,细胞内三酰甘油含量[(78.5±20.5)μg /mg比(40.5±11.0)μg /mg,t=4.078,P＜0.01]和TC含量[(52.5±13.0)μg /mg比(32.0±8.5)μg /mg,t=3.233,P＜0.01]明显升高,脂肪酸β氧化速度[(1.80±0.40) nmol·mg-1·h-1比(3.10±0.60)nmol· mg-1·h-1,t=4.416,P＜0.01]明显减慢,ROS水平(3.8±0.7比1.0±0.2,t=9.421,P＜0.01)明显升高,MDA含量[(8.50±2.40) nmoI/mL比(3.00±0.60) nmol/mL,t=5.446,P＜0.01]明显升高；SOD活性[(9.60±2.50) U/mL比(15.50±3.00)U/mL,t=3.764,P＜0.01]明显降低.脂肪酸、胆固醇合成的相关基因SREBP-1cmRNA水平(1.9±0.4比1.0±0.3,t=4.409,P＜0.01)、FAS mRNA水平(3.0±0.6比1.0±0.3,t=7.303,P＜0.01)、ACC mRNA水平(2.6±0.5比1.0±0.3,t=6.721,P＜0.01)、SREBP-2 mRNA水平(2.3±0.5比1.0±0.2,t=5.913,P＜0.01)、HMGR mRNA水平(1.9±0.4比1.0±0.2,t=4.929,P＜0.01)和HMGS mRNA水平(2.6±0.7比1.0±0.2,t＝ 5.383,P＜0.01)明显升高,脂肪酸β氧化的相关基因PPARα mRNA水平(0.3±0.1比1.0±0.3,t=6.971,P＜0.01)和CPT1A mRNA水平(0.4±0.1比1.0±0.2,t=6.573,P＜0.01)明显下降.结论 HCV核心蛋白下调AMPK活性及表达,改变其下游调节脂类代谢相关基因表达,增加三酰甘油和TC合成,减少脂肪酸β氧化,增加脂质过氧化,导致肝细胞脂类代谢紊乱.
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丙型肝炎病毒核心蛋白对肝细胞葡萄糖摄取能力的影响
目的 探讨丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白对肝细胞葡萄糖摄取能力的影响.方法 表达HCV核心蛋白的真核表达质粒pcDNA3.1-core通过Lipofecta- mineTM基因转染法转染HepG2细胞,经G418筛选获得稳定转染HepG2细胞,经Western blot证实有HCV核心蛋白表达.应用放射同位素法检测表达HCV核心蛋白的HepG2细胞对[3H]标记的D-葡萄糖的摄取,观察胰岛素、TNF-α、c-Jun氨基端激酶(JNK)抑制剂和磷脂酰肌醇-3激酶(PI-3K)抑制剂对肝细胞葡萄糖摄取能力的影响.结果 表达HCV核心蛋白HepG2细胞葡萄糖摄取率每分钟计数值(cpm:4 500±500)明显低于HepG2细胞的(20 000±4 600,P＜0.05).加入胰岛素后,HepG2细胞的cpm值上升到27 000±6 100;表达HCV核心蛋白HepG2细胞葡萄糖摄取率cpm值为4 700±600.加入外源性TNF-α后,HepG2细胞的cpm值为22 000±5 700；表达HCV核心蛋白HepG2细胞葡萄糖摄取率cpm值为4 600±570.加入JNK抑制剂后,表达HCV核心蛋白HepG2细胞葡萄糖摄取率cpm值为23 000±6 770；而加入PI-3K抑制剂后,其cpm值为6 000±700.结论 HCV核心蛋白通过JNK途径导致肝细胞葡萄糖摄取能力下降.
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丙型肝炎病毒核心蛋白、Bcl-2、P21Waf1在丙型肝炎中的表达及相互关系
目的调查丙型肝炎、肝硬化病人组织中的丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白、P21cl-2的表达以及相互间关系,探讨HCV核心蛋白是否抑制P21和促进Bcl-2表达.方法收集23例HCV表达阳性的肝炎、肝硬化组织,采用免疫组化Envision法检测核心蛋白、P21、Bcl-2表达,并用统计学方法分析三者间的表达关系.结果HCV核心蛋白和突变P21的阳性表达主要位于细胞核中,Bcl-2的阳性表达主要位于细胞质;HCV核心蛋白表达阳性组织中,P21阳性表达率仅13%,Bcl-2阳性表达率则达95.7%,三组间比较差异有显著性(P=0.012).HCV核心蛋白和Bcl-2二组间比较差异无显著性(P=0.561);HCV核心蛋白与Bcl-2、p21阳性强度两者间P值分别为0.012和0.2.结论三种蛋白的表达有相关性,HCV核心蛋白可能促进Bcl-2蛋白的表达,抑制P21蛋白表达.
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HCV核心和截短的包膜蛋白E2基因在昆虫细胞中的表达及其抗原性
目的:构建含HCV全长核心基因和截短的包膜蛋白E2基因的重组杆状病毒表达载体,研究其表达和抗原性.方法:以含HCV全长cDNA克隆的pGEM-HCJ4质粒为模板,PCR扩增全长的HCV核心抗原基因和截短的E2基因片段,插入转座载体pFastBacHTa构建重组转座质粒pFB-CE2t,转化DH10Bac大肠杆菌,获得重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-CE2t,以之转染昆虫Sf 9细胞进行外源基因的表达,并对其抗原性进行ELISA检测.结果:SDS-PAGE和Western blot分析表明Bacmid-CE2t在Sf 9细胞表达了HCV C-E2蛋白,并能利用细胞内蛋白酶将其裂解为单独的C蛋白和截短的E2蛋白.纯化后的蛋白能分别与HCV C蛋白、E2蛋白单抗以及慢性丙型肝炎患者血清反应.结论:HCV核心蛋白和截短的E2蛋白在昆虫细胞中成功表达并具有抗原性.
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HCV核心蛋白噬菌体随机展示肽库的构建
目的:为了探讨噬菌体展示技术在筛选和鉴定病毒抗原表位研究中的应用前景.方法:利用随机引物P CR法以HCV核心基因为模板合成随机DNA片段,再经特定引物二次扩增后获得高丰度的HCV核心蛋白随机DNA片段,将该片段插入噬菌粒载体pCANTAB5X的XbaⅠ位点,转化大肠杆菌TG1, 辅助噬菌体拯救,建立噬菌体随机肽展示文库.结果:所构建的随机文库含1.23×105个不同克隆,库容噬菌体滴度为2×1012 TU/ml(转导单位/ ml) ,PCR法检测插入阳性为28.1%,核酸杂交证实40%的克隆为HCV核心基因阳性克隆. 结论:所建的随机文库有足够大的库容和较好的多样性,可以满足HCV C抗原表位的筛选.
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丙型肝炎病毒截短型核心基因表达载体的构建与表达
目的 构建重组丙型肝炎病毒核心基因表达载体pVec-core,并进行原核表达.方法 人工合成丙型肝炎病毒截短型核心基因至pUC57载体上,经双酶切后,将其克隆至原核表达质粒pVec中,测序正确后将重组质粒pVec-core转化入表达宿主菌BL21,经IPTG诱导表达核心蛋白,SDS-PAGE检测目的 蛋白的表达情况.采用GST亲和层析方法纯化融合蛋白并进行Western印迹法验证.结果 丙型肝炎病毒核心基因表达载体构建成功,重组菌表达出相对分子质量约为40.6 kD重组融合蛋白,并以可溶形式存在于菌体中.蛋白经谷胱甘肽琼脂糖凝胶纯化,得到纯度较高的目的蛋白.经Western印迹分析,该蛋白可与HCV患者阳性血清发生特异性结合反应,具有良好的抗原活性.结论 核心抗原表达载体在原核表达系统中高效表达,为利用其作为诊断抗原及研究核心蛋白的其他生物学功能奠定了基础.
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丙型肝炎病毒核心蛋白与NS4B融合蛋白的构建和表达
目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白(core)与NS4B融合表达克隆,并在大肠埃希菌中表达.方法:应用PCR方法从抗HCV阳性血清中扩增出HCV核心蛋白基因和NS4B基因的cDNA片段,将两部分基因片段拼接成一条完整cDNA,连接到表达载体pET28a上,菌落PCR和测序方法选择阳性核心蛋白-NS4B-pET28a重组质粒.将阳性重组质粒转化到大肠埃希菌BI21中进行表达,分别用SDS-PAGE和蛋白质印迹分析表达的重组融合蛋白.结果:琼脂糖凝胶电泳结果显示,成功获得核心蛋白基因和NS4B基因,并成功拼接成一条完整cDNA;菌落PCR和测序结果表明重组融合克隆核心蛋白-NS4B-pET28a构建成功.SDS-PAGE结果表明重组融合质粒在大肠埃希菌BL21中成功表达,蛋白质印迹结果显示表达的重组蛋白与抗HCV阳性血清具有反应性.结论:成功构建了HCV核心蛋白与NS4B的重组融合克隆,并成功在大肠埃希菌中表达.
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基因1b型HCV及其不同准种核心蛋白对TRAIL诱导凋亡通路中FADD及Bid表达的影响
目的 研究基因1b型丙肝病毒(HCV)标准株C191(HCV-J6)及其不同准种病毒株:癌中心组织株(tumor tissue,T)、癌旁组织株(non-tumor tissue,NT)编码的核心蛋白(core protein,CP)对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导Huh-7细胞凋亡的影响,比较凋亡通路中关键分子FADD、Bid表达水平的差异.方法 用质粒pEGFP-N1及含HCV CP基因的真核表达质粒pEGFP-N1-C191、pEGFP-N1-NT、pEGFP-N1-T瞬时转染Huh-7细胞24 h,Western blot检测CP的表达.质粒转染24 h后,100 μg/L TRAIL处理细胞24h,CCK8检测细胞增殖率;Annexin V-FITC/PI双染,流式细胞术检测细胞凋亡;RT-PCR检测FADD、Bid mRNA表达水平;Western blot检测FADD、Bid蛋白表达水平.结果 HCV CP在细胞中高效表达.TRAIL诱导下各组细胞增殖率如下:T组(34.75±3.16)％、NT组(60.24±6.63)％、C191组(66.88±3.77)％、pEGFP-N1组(96.77±2.83)％,其中T、NT、C191组增殖率均低于pEGFP-N1组(P＜0.05),T组低于NT、C191组(P＜0.05).T、NT、C191组细胞凋亡率均高于pEGFP-N1组(P＜0.05),T组高于NT、C191组(P＜0.05),NT和C191组间差异无统计学意义(P＞0.05),pEGFP-N1和Huh-7组间差异无统计学意义(P＞0.05).FADD mRNA和蛋白表达水平:T组＞ NT、C191组＞pEGFP-N1、Huh-7组(P＜0.05).Bid mRNA和蛋白表达水平:T组＞NT、C191组＞pEGFP-N1、Huh-7组(P＜0.05).结论 HCV CP能从mRNA和蛋白水平提高细胞FADD和Bid表达,增强TRAIL诱导Huh-7细胞的凋亡.与准种NT和HCV标准株相比,准种T编码的CP能更明显上调FADD和Bid的表达水平,显著增强Huh-7细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性.
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基因1b型不同准种株HCV核心蛋白真核表达质粒的构建及表达
目的 构建基因1b型丙型肝炎病毒(HCV)不同准种株截短片段核心蛋白(CP)绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白表达质粒.方法 用聚合酶链反应(PCR)扩增获得等长度片段的CP基因:氨基酸(aa)长度为癌中心株(T)∶T∶1-172 aa、癌旁株(NT)∶1-172 aa及C191(HCV-J6)∶1-172 aa,扩增产物用Nhe I及EcoR I双酶切后将其插入到真核表达质粒pEGFP-N1中,转染不同细胞系,用荧光显微镜及流式细胞仪观察GFP的表达.结果 PCR扩增、序列分析验证,T、NT及C191截短片段CP基因均成功克隆到pEGFP-N1中,在转染HepG2、chang-liver 48h后,用荧光显微镜及流式细胞仪均观察到GFP的表达.结论 构建基因1b型HCV不同准种株截短片段CP的真核表达质粒获得成功,可用于不同准种株CP的功能研究.
