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丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6猴同源基因N的克隆化与序列分析
目的:利用酵母双杂交技术,业已成功克隆了人类丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白结合蛋白6(HCBP6)的编码基因.为了阐明不同生物类型中HCBP6基因序列的同源性,阐明HCBP6的生物学功能,我们应用生物信息学技术,克隆猴HCBP6同源基因序列,并对其结构进行分析.方法:应用我们克隆的人HCBP6基因序列作为参照,对美国国立卫生研究院(NIH)国立医学图书馆(NLM)国立生物工程信息中心(NCBI)建立的核苷酸数据库以及在线分析软件进行分析.对已经克隆的不同生物来源的HCBP6的同源基因序列进行比较.结果:猴HCBP6的同源基因开放读码框架长度为570 bp,编码产物HCBP6蛋白由189aa组成.猴HCBP6的同源基因编码产物与人、猪、牛的HCBP6同源基因编码产物的同源性分别是96.27％、89.95％、85.71％.结论:生物信息学技术是克隆不同生物类型的同源基因序列的可靠、快捷途径.猴HCBP6同源基因的克隆化为研究不同种属来源的HCBP6基因的结构域功能、表达与调控等研究奠定了基础.
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恶性肿瘤与Lumican的关系研究进展
基膜聚糖(Lumican)是一种蛋白聚糖,隶属于富含亮氨酸低分子蛋白聚糖(SLRP)家族[1],早在牛角膜基质中发现[2].和其他SLRP蛋白一样,Lumican在结构上主要由4个结构域组成:(1)16个氨基酸残基构成的信号肽;(2)N端结构域,包含硫化酪氨酸及二硫键;(3)用于蛋白质相互作用的亮氨酸高度重复的分子结构;(4)羧基端结构域,包含两个保守半胱氨酸残基.根据其聚糖修饰形式的不同,Lumican以核心蛋白共价连接未硫酸化的聚乙酰氨基乳糖的糖蛋白形式和核心蛋白共价连接硫酸化的硫酸角质素侧链的蛋白聚糖形式存在[3].
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土拨鼠肝炎病毒核心蛋白质粒的构建、原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定
目的 构建土拨鼠肝炎病毒核心蛋白质粒并进行原核表达、抗体制备.方法 应用基因工程技术将编码截短型土拨鼠肝炎病毒核心蛋白(WHcAg1～149aa)的基因片段装入原核表达载体pQE60上,在JM109菌内进行诱导表达,使用切胶回收及Ni-NTA柱两种方法纯化目的蛋白.将纯化蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并采用酶联免疫吸附实验、免疫组织化学及Western blot检测抗体的灵敏度和特异性.结果 成功地构建了含截短型土拨鼠肝炎病毒核心区基因的质粒并获得表达,经纯化得到了分子量约为16.5 kD的重组核心蛋白,免疫家兔获得了高效价的特异性多克隆抗体,而且与HBcAg有交叉反应.结论 获得的重组截短型土拨鼠肝炎病毒核心抗原(1～149aa)纯度高,免疫原性强.获得的兔抗-WHc效价高,特异性好,与HBcAg有交叉反应.
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丙型肝炎病毒核心蛋白对转录因子的调控
HCV核心蛋白能与胞内多种蛋白相互作用,影响细胞信号转导级联,从而调控NF-κB,AP-1,STAT,Elk-1和SRE等多种转录因子,影响一系列基因的表达.HCV核心蛋白在HCV所致病变的发生机制中起非常重要的枢纽作用.
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丙型肝炎病毒核心蛋白对核转录因子stat3活性的调控作用
目的:探讨丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白对核转录因子stat3活性的调控作用.方法:将表达HCV核心蛋白的真核细胞表达质粒pcDNA3.1-core转染人源肝细胞系QSG7701,建立稳定表达HCV核心蛋白的细胞株QSG7701-core,利用免疫细胞化学、Western blot及凝胶电泳迁移实验(EMSA)等方法检测stat3的磷酸化及DNA结合活性.结果:在表达HCV核心蛋白的QSG7701细胞中,stat3的磷酸化水平明显低于空白质粒转染组和未转染组,而总stat3的表达水平3组无明显差别;核内磷酸化的stat3阳性信号明显减弱;stat3的DNA的结合活性明显低于空白质粒转染组和未转染组.结论:在人源永生化肝细胞系中HCV核心蛋白的表达可能具有抑制stat3的磷酸化和DNA结合活性的作用,从而抑制JAK/ stat3信号转导通路活化,这可能是HCV干扰素治疗效果不佳的原因之一.
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HCVC区与HBc融合蛋白在大肠杆菌中表达及鉴定
目的 HCV C119与 HBc融合蛋白在大肠杆菌中的表达与鉴定.方法 PCR扩增 HCV C1～119编码序列并取代 HBc脊区基因,杂合 HBc基因定向克隆至 pET28b+ NheⅠ /XhoⅠ位点,经双酶切及核酸序列测定筛选、鉴定阳性克隆.工程菌 BL21(RIL)- pET28- BCc经 IPTG诱导后,10% SDS- PAGE电泳及 Western blot检测、鉴定目的蛋白.结果重组子经 NheⅠ /XhoⅠ双酶切获得约 880bp目的基因片段,DNA序列测定证实 HCV C119基因正确插入并取代 HBc脊区基因,杂合基因与 HBV adr亚型及 HCV日本株相应序列同源性超过 97%,工程菌 BL21(RIL)- pET28- BCc经 IPTG诱导后表达约 33kDa目的蛋白,并与 HCV血清呈阳性反应.结论正确克隆、表达了 HCV C119与 HBc融合蛋白 pBCc.
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HCV核心蛋白片段的表达、纯化及免疫原性检测
目的探讨HCV核心蛋白N端119aa片段表达产物的抗原性及用于抗-HCV抗体检测的可能性.方法把HCV C119-pET32a/BL21重组菌进行发酵表达,提取包涵体,并用阳离子柱进一步纯化目的蛋白.用Western blot及ELISA分析该融合蛋白的免疫特异性及敏感性.结果所表达的目的蛋白约占菌体总蛋白的20%,SDS-PAGE结果表明所纯化的目的蛋白纯度大于95%.Western blot及ELISA结果显示该融合蛋白具有良好的免疫特异性,所检测的47份临床HCV感染血清的阳性率为91.5%,而阴性对照及HBV感染血清则未见阳性结果.结论该HCV C119融合蛋白检测HCV感染患者血清具有良好的特异性和敏感性,可望用于HCV抗体检测试剂盒的研制.
关键词： 丙型肝炎病毒(HCV) 核心蛋白 抗体 纯化 -
HCBP1的细胞定位及与HCV核心蛋白在体内的相互作用
目的 探讨HCV核心蛋白与(HCBP1)HCV核心蛋白的相互作用蛋白在真核细胞内的相互作用.构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与HCBP1融合蛋白真核表达载体,分析其在COS-7细胞中的表达和亚细胞定位.方法 PCR分别扩增含HCV核心及HCBP1的cDNA片段,克隆入pGEMT载体,经测序正确后,分别克隆入哺乳双杂交的表达质粒pM和pVP16中,并转染入COS-7细胞,48 h后检测细胞中报告基因CAT的表达水平.将HCBP1的cDNA片段克隆入绿色荧光表达载体pEGFP-C1中,构建HCBP1-EGFP融合蛋白的表达载体,转染COS-7细胞,以Western blot和荧光显微镜分析融合蛋白的表达及其细胞定位.结果 CAT-ELISA检测显示pM-核心蛋白与pVP16-HCBP1实验孔吸光度值高于其他阴性对照,但低于阳性对照组.成功构建HCBP1-EGFP融合蛋白的表达载体,Western blot证实融合蛋白在转染细胞中的表达,荧光显微镜示HCBP1-EGFP融合蛋白分布于细胞浆,而转染空载体的细胞内EGFP的分布无明显改变.结论 成功构建HCBP1-EGFP融合蛋白表达载体,并在COS-7细胞中得到表达.哺乳双杂交系统证实HCV核心蛋白与新基因HCBP1确有一定的相互作用.
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HCV核心基因转染对QBC939细胞凋亡及细胞周期的影响
[目的]研究丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV-C)对肝门部胆管癌细胞(QBC939)细胞凋亡及细胞周期的影响.[方法]将包含HCV-C基因的真核表达质粒pcDNA HCV-C和空载体,利用脂质体介导将其转染QBC939,经G418筛选获得稳定转染HCV-C的QBC939细胞(QBC939 HCV-C+),RT-PCR和免疫荧光法检测HCV-C蛋白表达,MTT法检测QBC939 HCV-C+细胞、空白质粒转染QBC939(QBC939pcDNA)细胞和未转染QBC939细胞生长增生率;流式细胞术(FACS)检测3组细胞凋亡率和细胞周期,以及QBC939 HCV-C+细胞经Fas抗体诱导凋亡后的细胞周期变化.[结果]①QBC939 HCV-C+细胞增殖率显著高于空白质粒转染QBC939和未转染QBC939细胞增殖率;②细胞未经Fas抗体诱导凋亡时,QBC939 HCV-C+细胞S期(20.1%±1.8%)高于未转染QBC939细胞S期(14.2%±3.6%),QBC939 HCV-C+细胞凋亡率(5.0%±0.7%)低于无HCV-C转染QBC939细胞凋亡率(9.2%±0.7%);③QBC939 HCV-C+细胞经Fas抗体诱导凋亡时,细胞S期低于未经诱导凋亡细胞S期.[结论]HCV-C蛋白具有抑制QBC939细胞凋亡和促进细胞增殖作用.
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丙型肝炎病毒致病性研究新进展
丙型肝炎病毒(HCV)慢性感染可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化,部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌(HCC),对患者的健康和生命危害极大,本文就丙型肝炎病毒致病性研究新进展进行简要综述.
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HBV核心蛋白与A3C融合蛋白HBV载体质粒的构建
目的:构建HBV核心蛋白与人类载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽3C(A3C)融合蛋白HBV载体质粒.方法:构建表达HBV核心蛋白的乙肝病毒载体质粒PdssX;以质粒PC-A3C为模板扩增A3C,将扩增的A3C及PdssX分别用Aor13H Ⅰ和BSEⅡ酶切双酶切,以T4连接酶连接转化TOP10感受态细胞,然后PCR和双酶切鉴定及测序鉴定.结果:酶切所获载体片段和目的基因片段的大小均与预期的相一致,经测序证实为pCH-CoreA3c基因,表明CoreA3c基因HBV载体质粒pCH-CoreA3c构建成功.结论:成功构建HBV核心蛋白与A3C融合蛋白HBV载体质粒pCH-CoreA3c,为下一步CoreA3c融合蛋白的原核表达及其抗病毒作用研究奠定了基础.
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HCV核心蛋白与截短型HBV表面抗原中蛋白的协同反式激活功能
目的探讨HCV核心蛋白与截短型HBV 表面抗原中蛋白的协同反式激活作用. 方法构建表达HCV核心蛋白的重组质粒pcDNA3.1(-)-core和表达截短型HBV表面抗原中蛋白的重组质粒pcDNA3.1(-)-Mt;转染HepG2细胞,从转录和翻译水平鉴定病毒基因的瞬时表达;与报告质粒pSV-lacZ共转染HepG2细胞,检测β-半乳糖苷酶(β-gal)表达活性,酶的活性反映了表达的肝炎病毒蛋白对SV40病毒早期启动子(增强子)功能的影响. 结果构建成HCV核心蛋白及截短型HBV 表面抗原中蛋白的重组表达载体pcDNA3.1(-)-core、pcDNA3.1(-)-Mt;在HepG2细胞均能瞬时表达相应的病毒蛋白;单独的共转染实验中pcDNA3.1(-)-core、pcDNA3.1(-)-Mt组的β-gal的表达分别是对照的4.6和3.2倍,两种质粒共同转染时酶的表达是对照组的8.4倍;表达质粒对β-gal表达的激活作用呈剂量依赖性. 结论 HepG2细胞中表达的HCV核心蛋白和截短型HBV 表面抗原中蛋白均具有反式激活SV40早期启动子(增强子)的功能,并且两种蛋白的反式激活功能具有协同特性.本实验有助于解释HCV、HBV感染,尤其是共同感染的致病(癌)机制.
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非复制型腺病毒介导抗-HBc单链抗体的细胞内表达
目的 探讨非复制型腺病毒介导抗-HBc单链抗体(ScFv)细胞内表达效率,并确定是否具有特异性抗原结合活性.方法 将经细菌内同源重组并在293细胞中包装产生的携带抗-HBc ScFv基因的非复制型重组腺病毒,按感染复数为10体外转染HepG2细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达;取培养上清液和细胞裂解上清液进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot法检测HBc ScFv表达.结果 重组腺病毒Ad-ScFv感染HepG2细胞后,荧光显微镜下观察到HepG2细胞中绿色荧光蛋白;十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳显示培养上清液和细胞裂解物中可见2.7×104左右的蛋白条带;Western blot显示有乙型肝炎核心抗原特异性结合活性阳性反应条带出现.结论 携带抗-HBc ScFv基因的非复制型重组腺病毒能在真核细胞中有效表达抗-HBc ScFv,并具有特异性抗原结合活性.
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丙型肝炎病毒核心区蛋白和细胞凋亡对细胞端粒酶活性的影响
丙型肝炎病毒(HCV)核心区编码的HCV-C蛋白维持病毒外形,还有较强的免疫调节功能,是细胞免疫的主要识别位点,在HCV致病过程中起着重要作用.端粒酶活性上调被认为是肿瘤发生的一种机制,HCV引发肝细胞癌(HCC)是否与上调肝细胞端粒酶活性有关?本实验拟对上述问题进行初步探讨,以部分阐明HCV导致HCC发生的机制.
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HCV核心蛋白氨基酸替换与干扰素应答的关系
目的 研究慢性丙型肝炎病毒核心蛋白氨基酸替换与干扰素疗效的关系.方法 纳入HCV RNA阳性的慢性丙型肝炎患者108例,依据干扰素治疗结局分为持续病毒学应答组(76例)、非持续病毒学应答组(32例).逆转录巢式PCR (RT-nested-PCR)扩增核心蛋白区,分析其氨基酸替换模式及其与干扰素疗效的关系.结果 高频替换(频率＞10％)发生于Core蛋白第70、75、91、106、110、147、187位氨基酸残基,各位点之间存在广泛的连锁替换；两组间Core蛋白第70位的Q/non-Q替换(P=0.004)、91位的M/non-M替换(P=0.039)、110位的T/non-T替换(P =0.025)具有显著差异；70Q、91M、110T替换更倾向于发生不应答治疗结局,OR值及95％ CI分别为0.288 (0.120～0.693)、0.413 (0.177 ～0.966)、0.346 (0.133 ～0.896)；同时携有上述2个以上的“抵抗型”替换者,治疗4周时HCV RNA水平下降更缓慢(P=0.001).结论 HCV Core区第70、91、110三个位点可作为Core区预测干扰素疗效的优选氨基酸位点.
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丙型肝炎病毒核心蛋白对Dicer切割功能的影响
目的 探讨核心蛋白与Dicer的相互作用及其对Dicer功能的影响.方法 构建丙型肝炎病毒核心蛋白真核表达质粒,采用免疫荧光染色和Western blot检测核心蛋白的表达,Western blot检测核心蛋白对细胞内Dicer表达的影响,免疫共沉淀技术检测真核细胞内核心蛋白与Dicer的相互作用.体外转录合成dsRNA,检测核心蛋白对Dicer切割dsRNA作用的影响.结果 在细胞内,核心蛋白能够明显恢复被shRNA抑制的虫荧光素酶基因的表达(P＜0.05),而对siRNA引发的RNAi无拮抗作用.在真核细胞内,加入核心蛋白后,Dicer的表达量无明显改变,并能检测到两者相互结合.在体外抑制实验中,重组表达的Dicer能切割dsRNA产生siRNA；核心蛋白加入后,dsRNA的切割受到抑制.结论 核心蛋白在真核细胞内可以结合Dicer,并通过抑制Dicer对dsRNA的切割作用,抑制RNA干扰作用.
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丙型肝炎病毒核心蛋白抑制shRNA介导的RNA干扰作用
目的 研究丙型肝炎病毒编码的蛋白对RNA干扰的抑制作用,筛选出有作用的RNA干扰抑制因子.方法 构建丙型肝炎病毒不同蛋白质的真核表达质粒,加入萤火虫荧光素酶基因的RNA干扰体系,共转染HeLa细胞,检测萤火虫荧光素酶活性以观察RNA干扰效果的变化,筛选出有作用的RNA干扰抑制因子.在针对内源性GFP的RNA干扰体系中进一步确证该种抑制作用.利用共转染方法观察该蛋白抑制RNA干扰的剂量效应关系、在不同细胞系中的作用以及对siRNA介导的RNA干扰是否有相同的拮抗作用.结果 加入核心蛋白后,萤火虫荧光素酶活性恢复到80％,与空白对照比较有显著性差异(P＜0.05).在绿色荧光蛋白RNA干扰体系中,核心蛋白使绿色荧光蛋白的表达强度明显增加.该种对抗RNA干扰的作用在HepG2、HEK293和HeLa细胞中均存在,且呈剂量依赖关系.在siRNA介导的RNA干扰体系中,加入核心蛋白后萤火虫荧光素酶活性无显著性变化(P＞0.05).结论 核心蛋白能够对抗shRNA介导的RNA 干扰作用,但不能对抗siRNA介导的RNA干扰作用,这种作用具有普遍性.核心蛋白对抗RNA干扰的作用可能有利于提高丙型肝炎病毒在宿主细胞内的生存能力并导致持续感染,亦可能在丙型肝炎病毒致病机制中发挥重要作用.
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丙型肝炎病毒核心蛋白对Wnt信号抑制因子SFRPs甲基化修饰的影响
目的 探讨丙型肝炎病毒核心蛋白是否通过对Wnt信号抑制因子SFRPs的甲基化修饰,从而活化Wnt信号通路.方法 将编码HCV核心蛋白的腺病毒(AdCore)或GFP对照腺病毒(AdGFP)感染SMMC-7721细胞,采用逆转录PCR(RT-PCR)方法检测SFRPs基因mRNA的表达；用5-氮杂-2′-脱氧胞苷(DAC)对AdCore或AdGFP腺病毒感染的SMMC-7721细胞进行去甲基化处理,进一步采用甲基化特异性PCR (MSP)和DNA甲基化测序,检测SFRPs基因启动子区CpG岛的甲基化程度,Western blot检测甲基化转移酶Dnmts的表达.结果 在HCV核心蛋白过表达的SMMC-7721细胞系中,SFRP2和SFRP5基因mRNA的表达量与对照组相比明显降低(P＜0.05)；甲基化分析结果表明:SFRP5基因启动子区CpG岛呈现高甲基化修饰；甲基化转移酶Dnmt1、Dnmt3a表达量增加(P＜0.05).结论 HCV核心蛋白可以促进SFRP5基因启动子区CpG岛的甲基化修饰,参与HCV相关疾病的发生.
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丙型肝炎病毒核心蛋白DNA免疫初步研究
目的观察HCV核心蛋白基因的DNA免疫效果.方法将HCV核心蛋白基因插入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建重组质粒pcDNA3.1/c.在证明该重组质粒可在哺乳动物COS7细胞中表达的基础上,用重组质粒100 μg免疫小鼠,同时设立空白质粒组和PBS组两组对照,初次免疫后4周、8周各进行一次加强免疫.小鼠体液免疫反应和T淋巴细胞增殖检测分别采用间接免疫荧光法和MTT法.结果pcDNA3.1/c可在COS7细胞内表达HCV核心抗原,接种于Balb/c小鼠能有效诱导体液和细胞免疫应答.结论重组质粒pcDNA3.1/c对于丙型肝炎防治具有潜在价值.
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丙型肝炎病毒核心蛋白对转录因子ETF和TxRE活性的调控作用
目的 探讨丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白对转录因子ETF和TxRE活性的调控作用.方法 对于瞬时转染pIRES-Core/Neo载体的L02细胞采用双荧光素酶报告基因系统检测核心蛋白对转录因子ETF和TxRE活性影响,并提取2株细胞的核蛋白和RNA,分别以Western blot试验和实时荧光定量PCR检测2种转录因子的表达量.结果 双荧光素酶报告基因检测在L02-Core和L02-Neo细胞中转录因子ETF和TxRE的活性比值分别为2.981和3.063.Western blot试验灰度值分析2株细胞的核蛋白提取物中这2种蛋白表达量的比值分别为1.510和2.717.实时荧光定量PCR检测这2株细胞中ETF和TxRE的核酸水平比值分别为4.123和3.703.结论 在表达HGV核心蛋白的L02细胞中,转录因子ETF和TxRE转录表达水平及转录活性均较高,HCV核心蛋白可能具有增强转录因子ETF和TxRE转录活性的作用.
