大鼠神经干细胞与小鼠雪旺细胞混合培养的研究

目的观察小鼠雪旺细胞体外培养时对大鼠神经干细胞存活及分化的影响.方法获取Wistar鼠坐骨神经并采用组织块法分离和纯化雪旺细胞;体外分离新生乳鼠脑神经干细胞,将雪旺细胞和神经干细胞分别培养扩增后进行共培养.共分5组进行:实验组1(NSC悬浮+SC悬浮+DMEM/F12);实验组2(NSC悬浮+SC贴壁+DMEM/F12);试验对照组1(SC培养基+NSC+DMEM/F12);试验对照组2(EGF/bFGF+NSC+DMEM/F12);试验对照组3(NSC+DMEM/F12).倒置相差显微镜对各组培养细胞每天观察形态和计数,免疫组织化学检测混合培养细胞特异性标记物的表达:SC采用P0和S100,NS采用nestin标记,神经干细胞分化神经元分别采用GFAP、GalC、Tubulin-β染色.结果共培养组NF染色阳性神经元样细胞的百分率明显高干其他各组;实验组1克隆球直径明显高于其他各组,其平均直径为8 μm;实验组神经元样细胞突起的长度比对照组的长,3周长度差为26.5～67.3μm.结论大鼠神经干细胞与小鼠雪旺细胞共培养使两者不仅能够共生,而且雪旺细胞能显著促进体神经干细胞分化为神经元样细胞;神经干细胞分化神经元突起增长并且有序排列成轴索样结构.

雪旺细胞对共培养不同发育阶段纹状体生长的影响

目的观察雪旺细胞(SCs)在体外对纹状体生长的影响.方法将SCs分别与胎鼠、新生鼠及成年鼠的纹状体在体外进行共培养,分别在3 d,1、2、3、4周进行观察纹状体周围神经突起的生长及细胞的迁移情况.结果共培养组中,胎鼠纹状体周围在第3天就出现了神经突起的生长,第3周达到高峰;新生鼠纹状体周围在第1周出现了神经突起;成年鼠纹状体在第2周出现神经突起的生长.共培养组中,胎鼠纹状体周围第1周出现细胞的迁移,随后逐步增多;新生鼠纹状体周围第2周出现细胞的迁移;成年鼠纹状体在第3周出现少量的细胞迁移,但与对照组比较差异亦有统计学意义(P<0.05).结论 SCs在体外能促进共培养不同发育阶段纹状体神经突起的生长及细胞的迁移,可用于神经退行性疾病的移植治疗.

转基因雪旺细胞与壳聚糖的相容性

大量动物实验证实:将体外培养的雪旺细胞(SC)移植入脊髓损伤区能促进神经元再生,但SC在体外培养和移植过程中,缺乏有效载体[1].本实验拟建立SC体外分离培养的方法,将神经生长因子(NGF)基因转入SC,使用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测NGF在转染前后的分泌情况;使用壳聚糖作为载体,种植转基因SC,并对两者的相容性进行观察,探讨转基因和壳聚糖在脊髓损伤治疗中的作用.

感觉和运动神经源性雪旺细胞与神经元共培养神经生长因子mRNA的表达

临床上修复神经缺损使用自体神经移植体时，神经感觉功能恢复较运动功能好，这可能与移植神经取自感觉神经有关，这种神经特异性再生的机制目前认为有多种机制参与［1］，而神经损伤后初雪旺细胞是远段神经的唯一成分，而且雪旺细胞被证实可以分泌包括神经生长因子(NGF)在内的多种神经营养因子［2］，因此我们以感觉和运动神经来源的雪旺细胞为研究对象，以NGF为指标，研究两种雪旺细胞与神经元共培养后NGF mRNA的表达是否有差异，探讨这种差异对神经特异性再生的作用。　　一、材料和方法　　1.雪旺细胞和神经元的体外培养：感觉性和运动性雪旺细胞、感觉和运动神经元的体外共培养参考文献［3，4］的方法。简要步骤如下：无菌条件下，分别取5　d龄SD乳鼠的背根神经(感觉性雪旺细胞)和股神经肌支(运动性雪旺细胞)，14　d龄SD胚鼠背根神经节(感觉神经元)和脊髓前角(运动神经元)，剪碎成糊状；分别置入离心管中，加入0.125%胰蛋白酶+0.03%Ⅳ型胶原酶(Sigma公司)，消化30～40　min；1 　500 r/min离心5　min；用DMEM/F12(Gibco公司)培养基将沉淀混悬成悬液，接种到培养皿中；37 ℃，体积分数为5%CO2细胞培养箱中孵育；雪旺细胞在48 h添加阿糖胞苷(5×10 -8　μg/L)，抑制成纤维细胞，第4天按1×109个/L的密度传代接种到6孔培养板盖玻片上，2　d后接种原代培养神经元细胞，这样就获得感觉性雪旺细胞和感觉神经元、运动性雪旺细胞和运动神经元的共培养。　　2.共培养细胞NGF mRNA的表达：NGF mRNA表达的检测采用武汉博士德公司原位杂交检测试剂盒(MK1032型)提供的方法进行。简要步骤如下(以下溶液中均含有0.1%焦炭酸二乙酯)： 4%多聚甲醛固定液30　min；磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤3次；甲醇(含体积分数为0.03%过氧化氢)30　min；PBS洗涤3次；灭菌水洗涤3次；蛋白酶K，37 ℃，10　min；灭菌水洗涤3次；地高辛标记的cDNA探针和无关序列在杂交液内首先经过100 ℃，8　min的变性处理，然后置于碎冰中3　min，滴加到盖玻片上，上面覆以专用盖片(Sigma公司)；37 ℃孵育20　h；2 5 ℃的2×SSC(氯化钠17.4　g，柠檬酸钠8.8　g溶于1　000　ml水中)洗涤2次；37 ℃的0.1 ×SSC洗涤1次；加入封闭液，不洗；加入抗地高辛抗体，34 ℃孵育30　min；TBS(氯化钠30 g，三羟甲基氨基甲烷1.2　g，纯乙酸0.5　ml溶于1　000　ml水中)洗涤；加入酶标二抗， 34 ℃孵育20　min；TBS洗涤；加入显色液，34 ℃显色30　min；灭菌水洗涤，中止反应。显微镜下观察、比较。　　二、结果　　感觉和运动雪旺细胞与相应神经元混合培养后，第3天分别进行NGF mRNA原位杂交，图1为运动性雪旺细胞NGF mRNA表达染色，图2为感觉性雪旺细胞的表达，图3为空白对照，图中黑褐色染色颗粒的多寡即代表NGF mRNA表达量的多少。由图中可见，感觉性雪旺细胞NG F mRNA的表达颗粒明显较运动性雪旺细胞密集，而运动性雪旺细胞的表达接近于空白对照。

吡咯喹啉醌对体外培养雪旺细胞增殖及Cyclin E基因表达的影响

目的 观察吡咯喹啉醌(PQQ)对体外培养的大鼠坐骨神经雪旺细胞(Sc)增殖的影响,寻找PQQ促进Sc体外高效扩增的佳效应浓度,并探讨其促进Sc增殖的作用机制.方法 取SD鼠婴坐骨神经体外培养Sc,应用免疫荧光技术鉴定Sc的纯度,采用噻唑蓝(MTT)比色分析法选择PQQ促进Sc增殖的佳效应浓度,设6个浓度梯度(1、10、102、103、104、105nmol/L),用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测PQQ对雪旺细胞Cyclin E基因表达的影响.结果 PQQ浓度为1、10、1×102、1×103nmol/L时能促进雪旺细胞的增殖,以浓度为1×102nmol/L时促进作用明显,PQQ浓度为1×104nmol/L时与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),而PQQ浓度为1×105nmol/L对SC具有一定的抑制作用;RT-PCR法显示与对照组比较PQQ浓度为1×102nmol/L时能促进雪旺细胞Cyclin E基因的表达.结论 适宜浓度的PQQ能促进Sc的增殖,其机制可能与其促进Sc中Cyclin E基因的表达有关.

不同活化状态的巨噬细胞对雪旺细胞增殖、分泌神经生长因子功能的影响

目的 观察不同活化状态的巨噬细胞对雪旺细胞(SCs)生理功能的影响.方法 分离、培养成年SD大鼠巨噬细胞,利用髓鞘组织(20μg/well)使其激活;从新生1d SD大鼠坐骨神经内分离SCs(1×106个/ml)并培养于Transwell下室.共培养组:激活状态的巨噬细胞加入到Transwell上室;对照组1:Transwell上室内加入未激活的巨噬细胞;对照组2:Transwell上室内加入不含细胞的培养基.通过细胞计数、3H-TdR掺入法检测SCs增殖情况,Western blot检测SCs表达神经生长因子(NGF)水平.结果 共培养组从新生大鼠内获取4.16×106个SCs,明显高于对照组1(3.83×106)和对照组2(3.19×106)(P<0.05);3H-TdR结果显示细胞增殖水平(0.2766±0.0079)明显强于对照组1(0.2268±0.0084)和对照组2(0.1929±0.0031)(P<0.05);WB结果显示NGF表达水平明显高于对照组(P<0.05). 结论巨噬细胞对SCs的影响受其活化状态的影响,激活状态的巨噬细胞可以明显促进SCs增殖,增强其表达NGF的能力.

猴自体雪旺细胞和人胚神经干细胞共移植治疗恒河猴帕金森病

目的 观察雪旺细胞(SCs)和人胚神经干细胞(NSCs)共移植治疗帕金森病(PD)猴模型的疗效.方法 采用恒河猴自体SCs和人胚NSCs共同移植治疗PD猴,3只成年恒河猴偏侧部分损伤性PD模型采用3种不同的移植物,对照猴移植磷酸缓冲液(PBS),干细胞猴移植人胚NSCs,共移植猴移植SCs+NSCs.结果 猴行为学评分:在移植术后1个月,共移植猴中的各项指标有不同程度的恢复,而干细胞猴及对照猴无明显变化;2个月后,干细胞猴及共移植猴,恢复程度都在2分以上,术后4个月,共移植猴和干细胞猴已接近正常.PET示DAT的显像剂18F-FP-β-CIT在移植后2个月,共移植猴在正常侧(左侧)纹状体区呈明显的放射性浓聚,而在毁损侧(右侧)纹状体区放射性摄取也出现明显浓聚,干细胞猴毁损侧(右侧)纹状体区放射性摄取仍不明显;在移植后6个月,共移植猴和干细胞猴,DAT的显像剂在毁损侧(右侧)纹状体区放射性摄取都出现明显的浓聚,而对照猴仍无明显变化.移植区脑组织TH染色显示,对照猴中未见到TH阳性细胞,干细胞可见到有TH染色阳性细胞从移植区向周围迁移;而共移植猴可见到TH染色阳性细胞从移植区向周围迁移的数量明显增多,且细胞体积也较饱满.结论 SCs和NSCs共移植能有效的治疗PD猴模型,SCs可来源于患者自体的周围神经,能避免排异反应及伦理问题,可望在临床上推广应用.

脊髓组织工程支架材料的研究现状与展望

脊髓组织工程是利用支架材料、种子细胞与生物分子等通过工程学技术构建组织工程化脊髓来重建脊髓功能,具体方法是将一定数量的种子细胞(神经干细胞、雪旺细胞、嗅鞘细胞等)种植到一定结构的三维支架材料上,形成细胞-支架材料复合物,再种植到体内脊髓损伤处,终形成具有一定结构和功能的脊髓组织,达到修复损伤脊髓的目的.寻找理想的脊髓组织工程支架材料是当前国内外研究的热点之一.现就脊髓组织工程支架材料的研究现状及展望作一述评.

多聚乳酸/乙醇酸多管道支架的构建及其三维结构与雪旺细胞生物相容性研究

目的 将雪旺细胞(SCs)移植到聚乳酸羟基乙酸(PLGA)多通道支架材料中,观察SCs在支架中的黏附、增殖和迁移,探讨细胞和支架的生物相容性.方法 将SCs种植在PLGA多通道支架中,继续培养7d和14 d,利用钙黄绿素-AM (Calcein-AM)4 μl和胡米胺二聚体(EthD-Ⅲ)试剂盒检测细胞在支架中的活性,活细胞被Calcein-AM染成绿色,死细胞被EthD-Ⅲ染成红色.细胞死亡率由计算EthD-1阳性细胞百分比获得.每组每张切片至少5个区域被照相.终的细胞死亡率取于3组的平均值.扫描电镜及光镜观察细胞形态和S-100蛋白免疫鉴定细胞的迁移状况.结果 倒置显微镜下显示SCs在多管道支架中于7d表现出良好的黏附能力,增殖14 d达到高峰.Viability/Cytotoxicity Assay Kit检测细胞活性发现7d后支架中细胞死亡率为(1.39±0.46)％.14d后支架中细胞死亡率为(1.43±0.51)％.免疫荧光切片及扫描电镜均显示,SCs不仅在管道壁贴附并生长,并且能在14d迁移到通道之间的空泡结构中.结论 SCs和PLGA多管道支架的三维结构之间具有良好的生物相容性.

多管道支架联合雪旺细胞移植修复脊髓损伤

目的 观察聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)多通道支架联合雪旺细胞(SCs)移植对SD大鼠脊髓损伤的修复作用.方法 原代培养新生SD大鼠SCs并建立脊髓损伤动物模型,将24只动物模型分成3组,实验组包括单独PLGA多通道支架组(n=8)和PLGA多通道支架±SCs组(n=8),对照组不放支架(n=8).术后以脊髓损伤运动功能(BBB)评分法每周评估大鼠后肢运动功能恢复情况,分别于8周取材进行组织学观察.结果 术后2周后,2个实验组的大鼠的BBB评分明显高于对照组,分别为A组(0.45 ±0.69)分和B组(0.65±0.74)分,PLGA多通道支架+SCs组BBB评分优于单独PLGA多通道支架组,并且在术后第8周实验组BBB平均得分分别为(9.05±0.99)、(11.8±0.62)分,两者差异有统计学意义(P=0.004).免疫组织学结果显示三维支架限制了星型胶质细胞的侵入,再生轴突能够长入管道内并与管道长轴方向一致的线性排列,与单纯支架植入组不同,携带SCs的支架植入组,管腔内可以发现与再生轴突相伴行的星形胶质细胞.结论 新型PLGA多管道支架能够为轴突再生提供依托,联合SCs移植后具有促进脊髓损伤后神经再生和运动功能恢复的修复作用.

感觉和运动神经来源的雪旺细胞p75受体表达的研究

目的 研究感觉神经和运动神经来源的雪旺细胞(Sc)表达低亲和力受体(p75)的情况.方法 结合酶消化、阿糖胞苷处理和S-100免疫荧光鉴定,从5d龄SD乳鼠背根神经和股神经得到感觉和运动神经来源的Sc.2种细胞分别进行普通培养基和添加高浓度白细胞介素(IL)-1培养基的培养,检测不同时间Sc表面神经生长因子p75的表达情况.结果 感觉和运动Sc普通培养基组p75受体表达方式明显不同,前者在第5d迅速达到峰值(1086.39±535.16),而后者在同期呈低水平(410.50±326.55,P＜0.05);而添加IL-1组2种细胞的表达基本一致,均在第5d达到峰值(891.50±406.10、922.32±520.25,P＞0.05)后均迅速下降.结论 2种神经来源的Sc表达p75受体存在差异,提示Sc在再生过程中存在感觉性和运动性的差异.

脑实质内神经鞘瘤三例

颅内神经鞘瘤可以起源于除视神经以外的任何脑神经,但通常发生于脑神经的感觉支,常见于听神经和三叉神经.脑实质内通常无雪旺细胞存在,因此脑实质内神经鞘瘤极其罕见.我们自1980年10月～1996年7月共收治脑实质内神经鞘瘤3例,现报告如下.

背根神经节来源的雪旺细胞的离体培养

目的:优化小鼠雪旺细胞(SCs)的离体培养方法.方法:取新生小鼠的背根神经节,采用酶消化分散法,加入不同的培养液,第1组(NB组)用NB(neuronbasal medium),第2组(FBS组)用含10%FBS的DMEM,继用O4、S-100免疫荧光法染色鉴定SCs阳性细胞,并镜下计数,计算SCs纯度.结果:NB组SCs纯度于第1周为90%,第2周为86.6%;FBS组相应SCs纯度都低于30%.结论:无血清的NB培养液更有利于SCs的增殖和生长.

神经干细胞与雪旺细胞联合应用于神经损伤修复的研究进展

雪旺细胞与聚乳酸/聚羟基乙酸丝相容性的研究

目的:研究雪旺细胞与聚乳酸/聚羟基乙酸(PLGA)丝的生物相容性.方法:应用乳鼠坐骨神经和臂从神经取材进行雪旺细胞培养,经阿糖胞苷抑制成纤维细胞及差数贴壁纯化,传代增殖至一定数量,将雪旺细胞与PLGA丝复合培养,经扫描电镜观察细胞的生长情况.结果:雪旺细胞可以在PLGA丝上贴壁生长,随着时间延长,细胞可分裂增殖.结论:雪旺细胞与PLGA丝生物相容性好,可进一步应用于神经修复.

复活草提取物调控雪旺细胞损伤后水通道蛋白1的表达作用的研究

目的:探讨缺氧诱导雪旺细胞膜水通道蛋白1(AQP1)表达机制及复活草提取物对缺氧损伤细胞的修复作用.方法:以不同浓度的CoCl2(2、4、6、8、10 μl/ml)培养细胞贴壁24 h后,显微镜下观察细胞形态变化拍照并以Western Blot检测AQP1变化,确定适浓度的CoCl2进行后续试验.以不同浓度的复活草提取物(0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 μl/ml)培养贴壁细胞,24 h后进行CCK-8检测.选取适浓度的CoCl2及复活草提取物进行后续试验,分为空白对照组、缺氧模型组、复活草提取物修复组观察7d,Western Blot检测7d的细胞AQP1及HIF-1α变化.结果:选取6μl/ml CoCl2为适浓度缺氧模型,细胞形态变化明显但对细胞生长未见明显抑制作用,AQP1表达含量高.选取2.5 μl/ml复活草提取物为适浓度,能够明显促进细胞增殖.HIF-1α诱导雪旺细胞AQP1表达增加,复活草提取物能下调AQP1及HIF-1a的表达.结论:周围神经水肿与雪旺细胞AQP1的表达有明显相关性,细胞缺氧后HIF-1α诱导AQP1表达增加;复活草提取物能够明显下调缺氧的雪旺细胞中AQP1的变化从而减轻水肿.

乳鼠面神经雪旺细胞的体外培养及其纯化

目的:体外培养雪旺细胞(SCs)时,在去除成纤维细胞(FCs)后,应用人参皂甙Rb1促进SCs的增殖以获得大量纯净的SCs,为周围神经组织工程学的发展奠定良好的基础.方法:本实验采用高浓度混合酶从乳鼠面神经中消化分离SCs,结合差速粘贴和阿糖胞苷处理进行纯化后,再用人参皂甙Rb1促进其分裂增殖.结果:S-100蛋白免疫荧光染色呈阳性反应的比例约占98%.结论:本方法快速、简便,能为SCs作为移植材料提供足够的来源,是纯化和促进SCs增殖较为理想的方法,具有潜在的临床应用前景.

四脑室区神经鞘瘤一例

神经鞘瘤是起源于周围神经雪旺细胞的良性肿瘤,颅内神经鞘瘤多数起源于听神经的前庭部分,位于桥小脑角区多见,起源于轴索位于脑内罕见,而位于脑室内则更为罕见[1].现报1例位于四脑室区的神经鞘瘤.

少见部位神经鞘瘤的临床特点及CT表现

神经鞘瘤起源于神经鞘膜雪旺细胞,可发生于任何有神经纤维的组织和器官,以四肢、椎管、颈部、纵隔、腹膜后等部位多见.现回顾性分析我院收治的15例少见部位神经鞘瘤的临床特点及CT表现,以提高对该病的认识.

吡咯喹啉醌对大鼠雪旺细胞形态及增殖细胞核抗原表达的影响

目的:观察吡咯喹啉醌(PQQ)对体外培养雪旺细胞的形态、细胞数量及雪旺细胞内增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响.方法:从出生3-5 d SD大鼠坐骨神经分离培养雪旺细胞,纯化并经S-100免疫荧光标记鉴定;设立对照组和实验组,分别加入100 nmol/L PQQ和等量PBS培养48 h后倒置显微镜下观察细胞形态并进行细胞计数;将不同浓度的PQQ(0,10,50,100,500 nmol/L)加入雪旺细胞培养基中,培养48 h后提取总mRNA及总蛋白进行PCNA的RT-PCR和Western blotting检测.结果:100 nmol/L PQQ干预雪旺细胞48 h可以使细胞的形态发生变化并使细胞数量增加,细胞数量较对照组增加13.6%;RT-PCR及Western blotting检测结果表明:PQQ浓度在10-500 nmol/L浓度范围内可增加雪旺细胞内PCNA的表达,且当PQQ浓度为100 nmol/L时该上调效应明显,分别是对照组的2.0倍和3.4倍.结论:PQQ可增加体外培养雪旺细胞的数量;并可使体外培养雪旺细胞内PCNA表达上调.