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DHRS7对人乳腺癌细胞MCF-7细胞周期的影响及其在乳腺癌组织中的表达
目的:探究DHRS7基因过表达和DHRS7特异性短发夹RNA (shRNA)重组质粒对人乳腺癌细胞MCF-7细胞周期的影响及DHRS7与乳腺癌浸润癌的关系,阐明DHRS7在乳腺癌发生、发展中的作用.方法:利用RT-PCR技术将DHRS7基因全长克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)质粒中,构建pcDNA3.1-DHRS7重组真核表达质粒.实验分为pcDNA3.1-DHRS7组、阴性对照组(pcDNA3.1组)、空白对照组和DHRS7-shRNA-pGenesil组,用Fugene HD转染试剂将各种质粒转染MCF-7细胞,采用RT-PCR和Westernblotting法检测各组MCF-7细胞中DHRS7的表达情况,流式细胞术分析细胞周期变化,免疫组织化学SP法检测乳腺原位癌和乳腺浸润癌组织中DHRS7蛋白的表达情况.结果:成功构建pcDNA3.1-DHRS7重组表达质粒.PCR和Western blotting结果显示,pcRNA-DHRS7组蛋白的表达量高于空白对照组(P＜0.05),DHRS7-shRNA-pGenesil组蛋白的表达量低于空白对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05).流式细胞术显示,DHRS7表达上调使MCF-7细胞S期细胞增多(P＜0.05),DHRS7的表达下调使处于G2期的细胞增多(P＜0.05).免疫组织化学染色显示,DHRS7蛋白在原位癌中高表达,阳性表达率为100％(37/37);在乳腺浸润癌的表达明显降低,阳性率为18.9％(7/37),两者比较差异有统计学意义(P＜0.01).结论:DHRS7基因参与了MCF-7细胞细胞周期的调控过程,可以抑制细胞增殖,DHRS7蛋白的表达丢失可能促进乳腺癌浸润.
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人TPX2基因过表达慢病毒质粒的构建及其人宫颈癌细胞稳定表达株的筛选
目的 构建人TPX2基因过表达慢病毒质粒,并筛选该基因的人宫颈癌HeLa细胞稳定表达株.方法 经PCR法扩增人TPX2基因序列,克隆至线性化的慢病毒载体LV11中,构建重组慢病毒质粒,进行酶切及测序鉴定.将鉴定正确的重组慢病毒及空载体LV11(LV 11-NC)分别与辅助质粒共转染293T细胞进行病毒包装,并检测病毒滴度.用重组慢病毒感染HeLa细胞,经不同浓度G418(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.O、1.2、1.5、2.0 mg/ml)筛选TPX2基因过表达稳转细胞株,同时设阴性对照(感染LV 11-NC慢病毒)及空白对照(未感染病毒).采用实时荧光定量PCR和Western blot法分别检测各组HeLa细胞中TPX2基因mRNA转录及蛋白的表达水平.结果 经酶切及测序鉴定证明重组慢病毒质粒构建成功.经293T细胞包装后,获得重组慢病毒的滴度为3×108 TU/ml.采用0.6 mg/ml G418成功筛选出TPX2过表达细胞株.与阴性对照及空白对照比较,感染重组慢病毒的HeLa细胞中,TPX2基因mRNA转录及蛋白表达水平均明显升高(P＜0.05).结论 成功构建了人TPX2过表达慢病毒质粒,并筛选出TPX2稳定表达的HeLa细胞株,为进一步研究TPX2基因在宫颈癌中的作用奠定了基础.
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海兰褐鸡卵泡颗粒细胞微管去稳蛋白2过表达对Ras-MAPK信号通路的影响
目的 探讨微管去稳蛋白2(stathmin-2-like protein,STMN2)过表达对海兰褐鸡卵泡颗粒细胞中Ras-MAPK(mitogen-activated protein kinase)信号通路的影响.方法 将STMN2腺病毒过表达载体以MOI为350 pfu/cell转染原代培养的蛋鸡卵泡颗粒细胞模型,设培养液组和腺病毒空载体组为对照组,转染48 h后,收集细胞总RNA和总蛋白,荧光定量PCR法检测各组细胞STMN2 mRNA水平及STMN2过表达对颗粒细胞分泌的细胞外调节蛋白激酶1(extracellular regulated protein kinases1,erk1)、erk2、大鼠肉瘤蛋白(rat sarcoma,ras)和转录激活因子ETS样蛋白1(ets-like protein l,elk-1)的影响,Western blot法检测各组STMN2蛋白水平及STMN2过表达对颗粒细胞分泌的erk 1、erk2、磷酸化erk1(p-erk1)、p-erk2 、ras和elk-1的影响.结果 与培养液组和腺病毒空载体组比较,STMN2过表达载体组STMN2 mRNA及蛋白表达水平均明显升高(P＜0.01);除elk-1蛋白表达水平差异无统计学意义(P＞0.05)和elk-1 mRNA水平显著增加(P＜0.05)外,STMN2过表达使颗粒细胞分泌的目的基因mRNA与蛋白表达水平均极显著增加(P＜0.01).结论 STMN2可通过Ras-MAPK信号通路影响蛋鸡卵泡颗粒细胞周期.
关键词： 微管去稳蛋白2 Ras-MAPK信号通路 海兰褐鸡 卵泡颗粒细胞 过表达 -
腺苷酸激酶4慢病毒过表达质粒的构建及鉴定
目的 构建腺苷酸激酶4(adenylate kinase 4,AK4)慢病毒过表达质粒,并进行鉴定.方法 从HepG2细胞中扩增AK4基因,将其克隆至载体LV5,构建重组质粒LV5-AK4,经测序鉴定后,将鉴定正确的LV5-AK4和包装质粒pGag/Pol、pRev、pVSV-G共转染HEK293T细胞,包装慢病毒;将慢病毒原液进行10倍系列稀释(10-1～10-4),感染HEK293T细胞,检测病毒滴度;慢病毒感染HepG2细胞,Western blot法检测AK4蛋白的表达水平.结果 重组质粒LV5-AK4经测序鉴定证明构建正确,并成功包装成慢病毒,病毒滴度为5×108 TU/ml.试验组HepG2细胞中AK4蛋白的表达水平显著高于空白对照组及阴性对照组(P＜0.01).结论 成功构建了携带AK4基因的重组慢病毒过表达质粒,为进一步研究低氧应激细胞中AK4的功能及其分子作用机制奠定了基础.
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bcl-2基因过表达的中国仓鼠卵巢细胞株的建立
目的 建立bcl-2基因过表达的中国仓鼠卵巢细胞株.方法 从CHO细胞中提取总RNA,以其为模板,采用RT-PCR方法扩增bcl-2基因,克隆入pcDNA3.1载体中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-bcl-2.利用脂质体转染法转染CHO-dhfr-细胞,用硫酸新霉素筛选阳性克隆,命名为CHO-G6细胞.通过流式细胞术检测bcl-2基因的表达及细胞凋亡水平,MTT法检测细胞的增殖活力.结果 CHO-G6细胞bcl-2基因表达阳性率(92.46%)明显高于CHO-dhfr-细胞(76.08%);CHO-G6细胞的凋亡率(1%)明显低于CHO-dhfr-细胞(19%);在无血清培养基中培养1～5 d,CHO-G6细胞的增殖活力均明显高于CHO-dhfr-细胞.结论 已成功构建了表达bcl-2基因并具有一定抗凋亡能力的重组CHO细胞株,为进一步应用该细胞株生产重组蛋白奠定了基础.
关键词： Bcl-2基因 过表达 CHO-dhfr-细胞 细胞凋亡 -
GINS2基因过表达对K562细胞增殖的影响
目的 检测GINS2基因过表达对K562细胞增殖的影响.方法 将Ad-GINS2感染K562细胞,扩增腺病毒,同时设空载体转染的空载组和未感染病毒的未处理组,PCR及Western blot法检测细胞中GINS2的转录及表达水平,MTT法检测细胞增殖水平.结果 与空载组和未处理组相比,Ad-GINS2感染组细胞GINS2基因转录水平及蛋白表达水平显著升高(P＜0.05),Ad-GINS2能明显促进细胞增殖(P＜0.05).结论 GINS2基因的重组腺病毒载体成功感染K562细胞并可促进K562细胞增殖,为进一步明确GINS2基因在白血病中的作用奠定了基础.
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过氧化氢酶过表达对α粒子致肺癌细胞模型DNA氧化损伤和表型的影响
目的 探讨过氧化氢酶(catalase,CAT)过表达对α粒子辐射致肺癌细胞模型BERP35T1内DNA氧化损伤水平和恶性表型的影响.方法 构建pEGFP-CAT真核表达质粒,经PCR、双酶切和测序鉴定后,采用脂质体法将该重组表达质粒及空载体转染至BERP35T1细胞中,经G418筛选出具有抗性的细胞株.Real-time PCR和Western blot法检测BERP35T1细胞中CAT基因mRNA转录和CAT蛋白表达水平;免疫细胞化学法、MTT法、细胞划痕愈合试验和锚着独立生长试验分别检测CAT过表达对BERP35T1细胞DNA氧化损伤水平(8-OHdG水平)、增殖(细胞存活率)、迁移能力(细胞迁移距离)和锚着独立性(软琼脂克隆形成率)的影响.结果 重组表达质粒pEGFP-CA T经PCR、酶切鉴定和DNA测序证实构建正确,获得了CAT稳定表达的BERP35T1细胞株BERP35T1-CA T-7.空白对照BERP35T1、BERP35T1-pEGFP和BERP35T1-CA T-7细胞中CAT基因mRNA转录水平分别为0.90±0.23、1.00±0.12和2.91±0.41,CAT蛋白相对表达水平分别为0.97±0.11、1.00±0.00和5.72±1.28,8-OHdG表达水平分别为1.65×10-2、1.60×10-2和8.95×10-3,细胞存活率分别为(95.33±4.26)％、(100.00±8.29)％和(61.63±3.08)％,细胞迁移距离分别为(150.68±9.98) μm、(115.02±30.73) μm和(44.25±10.53) μm,细胞软琼脂克隆形成率分别为(2.50±0.02)‰、(2.10±0.02)‰和(0.70±0.02)‰.结论 CAT过表达可能通过降低DNA氧化损伤水平,抑制BERP35T1细胞的增殖、转移和锚着独立生长能力等恶性表型.
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Survivin基因干扰和过表达对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响
目的 观察凋亡抑制蛋白Survivin基因干扰和过表达对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响.方法 将Survivin基因shRNA干扰质粒和过表达质粒pcDNA3.1-GFP-Survivin在脂质体介导下转染MCF-7细胞,并设空白对照组和脂质体对照组,转染后48 h,荧光显微镜下观察转染效率；荧光定量RT-PCR法检测转染细胞中Survivin基因mRNA的转录水平；MTT法检测转染细胞的凋亡率.结果 转染MCF-7细胞后48 h,Survivin基因RNAi质粒和过表达质粒的转染效率为50％ ～ 60％；shRNA质粒转染组MCF-7细胞中Survivin基因mRNA的转录水平明显低于空白对照组和脂质体对照组,而过表达质粒转染组明显高于空白对照组和脂质体对照组(P＜0.05)；shRNA质粒转染组MCF-7细胞的凋亡率明显高于空白对照组和脂质体对照组,而过表达质粒转染组明显低于空白对照组和脂质体对照组(P＜0.05).结论 Survivin基因对人乳腺癌MCF-7细胞的凋亡具有一定的抑制作用,可作为人乳腺癌生物治疗的候选基因.
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整合素β1表达上调对肺癌细胞迁移和粘附能力的影响
目的:构建整合素β1的全基因表达载体,并探讨上调整合素β1蛋白表达对肺癌细胞生物学行为的影响.方法:根据GenBank数据库提供的整合素β1基因核苷酸序列,构建整合素β1的全基因表达载体,同时将空载体pCDNA3.1作为阴性对照.将载体转入感受态大肠杆菌,挑选阳性克隆,抽取重组栽体.2种重组栽体转染非小细胞肺癌细胞株PC-9细胞,用G418筛选后挑选单克隆并扩增获得稳定株.荧光显微镜、Real-time RT-PCR、Western blot检测整合素β1的基因及蛋白水平的表达情况.细胞划痕试验和粘附试验比较整合素β1对细胞迁移、粘附能力的影响.结果:G418筛选出稳定转染整合素β1全基因表达栽体和空载体的细胞,分别命名为PC-9/D6和PC-9/PCD.荧光显微镜见满视野带绿色荧光的细胞,PC-9/D6细胞整合素β1的mRNA、蛋白表达明显高于对照的PC-9/PCD细胞及母细胞PC-9.划痕试验和粘附试验表明整合素β1过表达的细胞株的迁移和粘附能力明显提高.结论:成功转染并筛选出整合素β1过表达细胞株,整合素β1过表达的细胞株的迁移和粘附能力明显升高.
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Homer1b/c在缺氧复氧损伤神经元中的保护作用研究
目的:探讨Homer1 b/c在缺氧复氧损伤神经元中的作用.方法:构建pcDNA3.1-Homer1 b/c质粒和Homer1b/c siRNA,过表达及siRNA干扰Neuro-2a细胞中Homer1b/c的水平,western blot分析观察上调及下调Homer1 b/c后Homer1 b/c的蛋白表达变化,再予细胞缺氧复氧损伤处理,观察细胞生存率、乳酸脱氢酶(Lactic dehydrogenase,LDH)释放量及caspase-3活性的变化.结果:过表达及siRNA干扰Homer1 b/c后,Homer1b/c的蛋白水平分别较正常组明显增高及降低(P值分别＜0.01),提示过表达及干扰Homer1b/c的效果均明显,分别能明显提高及降低Homer1b/c的水平.在缺氧复氧损伤条件下,Homer1 b/c过表达组较空质粒转染组,其细胞生存率明显增加,LDH释放量、caspase-3活性明显降低(P值分别＜0.05);相反,下调Homer1b/c的水平后,与controlsiRNA转染组相比,细胞生存率明显降低,而LDH释放量和caspase-3活性明显增加(P值分别＜0.05).结论:Homer1b/c在缺氧复氧损伤神经元中具有神经保护作用.
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人脆性组氨酸三联体(FHIT)基因的克隆及在HeLa细胞中表达的研究
目的:构建人脆性组氨酸三联体(fragile histidine triad gene,fhit)基因与报告基因egfp的双顺反子表达载体及融合表达载体,研究fhit基因过表达对HeLa细胞生长及凋亡的影响.方法:根据已知fhit基因的mRNA序列,RT-PCR得到493bp的cDNA序列,将其构建到pMD18-T中,筛选目的片段插入正确的重组质粒,经限制性内切酶切割,回收目的片段分别插入双顺反子表达载体pIRES2-EGFP和融合表达载体pEGFP-C1的多克隆位点中.再以脂质体介导转染HeLa细胞,G418筛选稳定转染的克隆,分别通过基因组PCR、RT-PCR、免疫细胞化学及TUNEL法在DNA、RNA和蛋白质水平检测其表达情况.结果:转基因细胞基因组PCR获得493bp片段.证明目的基因已整合到细胞基因组中;RT-PCR检测其在RNA水平得到表达;免疫细胞化学及TUNEL法分析表明fhit基因在HeLa细胞内实现了稳定遗传与表达.结论:实验证明fhit基因过表达可有效促进HeLa细胞的凋亡.
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USP22在恶性肿瘤中的研究进展
去泛素化酶从不同底物上移除泛素，起到调控蛋白质活性和维持细胞内环境稳态的作用。去泛素化酶在细胞的转录后修饰过程中发挥重要作用，当去泛素化酶调控机制出现异常则会引起不同类型疾病的发生。而异常表达特异性去泛素化酶22（ USP22）常与癌症预后不良有关。本文就USP22在肿瘤中的研究现状进行综述。
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恶性肿瘤中 SOX2基因的研究进展
Sox2是Sox家族中的重要成员之一，在调控早期胚胎及正常组织的发育，维持干细胞的多功能性、祖细胞的自我更新能力和决定细胞命运等方面发挥重要作用。 Sox2基因的突变或缺失有可能导致发育异常或先天性疾病。既往研究表明，Sox2在多种恶性肿瘤组织中表达，并且与恶性肿瘤的发生、淋巴结的转移、病理分级及临床分期有关。所以，Sox2被认为是一种潜在的致癌因子，其过表达可能是导致不同种类恶性肿瘤发生和发展的作用机制之一。
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Rab7真核表达载体的构建及其在小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞中的表达
目的 构建Rab7的真核表达载体,研究其在小鼠巨噬细胞RAW264.7中的表达.方法 RT-PCR方法分析Rab7在组织和细胞中的表达.以RAW264.7细胞的cDNA为模板,根据GenBank公布的小鼠Rab7全长序列设计引物,扩增Rab7基因的开放阅读框.将其与真核表达载体pcDNA3.1(-)连接,构建pcDNA-Rab7重组质粒.用脂质体将Rab7真核表达载体瞬时转染RAW264.7细胞,RT-PCR和Western blot法鉴定Rab7的过表达.结果 Rab7重组载体测序结果与GenBank中报道的Rab7序列的同源性为100％.RT-PCR和Western blot结果显示Rab7真核表达载体瞬时转染RAW264.7细胞后,Rab7表达显著增高.结论 成功构建了Rab7真核表达载体.为今后研究Rab7在巨噬细胞中的功能奠定了基础.
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鲍曼不动杆菌中外排泵介导耐药机制的研究进展
外排泵的过表达是目前导致鲍曼不动杆菌多重耐药的重要机制之一，详细了解这一复杂机制有助于尽快找到有效的防治策略。目前，鲍曼不动杆菌中已被报道的外排泵家族包括耐药结节细胞分化（resistance‐nodulation‐cell division ，RND）家族、主要协同转运蛋白超家族（major facilitator superfamily ， MFS）、多药及毒性化合物外排（multidrug and toxic compound extrusion ，MATE）家族、小多重耐药（small multidrug resistance ，SMR）家族。它们之中既有通过染色体介导的外排泵，也有通过质粒等遗传元件介导的外排泵。外排底物可呈现多样性，也可呈现专一性。本文就上述外排泵的种类、功能和调控机制进行综述。
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过表达Olig2和Nkx2.2人胚胎干细胞系的建立
目的:建立过表达Olig2和Nkx2.2的人胚胎干细胞(hESCs)系.方法:利用RT-PCR从鼠N2A细胞克隆出Olig2和Nkx2.2的ORF片段,将Olig2和Nkx2.2基因编码序列分别和带有HA及Flag的载体连接,构建Olig2-HA和Nkx2.2-Flag重组载体.将构建的载体分别与2种病毒辅助包装原件载体质粒共转染293T细胞,制备并浓缩Olig2-HA和Nkx2.2-Flag慢病毒颗粒,感染hESCs,嘌呤霉素筛选的阳性克隆传代培养10代后鉴定细胞内Olig2和Nkx2.2的表达.结果:PCR扩增得到含Olig2和Nkx2.2基因编码序列的特异性条带;携带有Olig2和Nkx2.2基因的慢病毒能够同时感染hESCs,表达Olig2-HA和Nkx2.2-Flag融合蛋白,并稳定遗传.结论:成功构建了同时过表达Olig2和Nkx2.2的人胚胎干细胞系.
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鸡胚发育过程中金属硫蛋白水解酶17在视顶盖中的过表达与血管生成的关系
目的:探索金属硫蛋白水解酶17(ADAM17)在胚胎发育过程中过表达与血管形成的关系.方法:鸡胚正常培养到第3天(E3 d),采用鸡胚带壳开窗培养方法,取出3～4 ml蛋清,密封开口继续培养至E5d,将pCAGGS-ADAM17和pCAGGS-GFP质粒通过活体电转基因导入视顶盖,电转后继续培养到胚胎发育的E12 d,取材、4％多聚甲醛固定、OCT包埋、切片后采用原位杂交检测ADAM17表达水平,免疫荧光组织化学分析ADAM17过表达对微血管形成的影响.结果:鸡胚发育过程,采用活体电转基因实现了ADAM17在视顶盖中的过表达,ADAM17过表达对微血管的形成具有一定的影响.结论:ADAM17过表达促进微血管数量的增加.
关键词： 金属硫蛋白水解酶17 视顶盖 微血管 过表达 -
miR-145对卵巢癌SKOV3细胞增殖和侵袭的影响
目的:研究miR-145对卵巢癌SKOV3细胞增殖和侵袭的影响.方法:通过慢病毒转染将含miR-145的质粒转入SKOV3细胞中,经嘌呤霉素筛选建立稳定表达miR-145的SKOV3细胞株.通过实时荧光定量PCR验证miR-145的表达情况,MTT、流式细胞和transwell检测过表达miR-145后对SKOV3细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响.结果:过表达miR-145后,MTT实验显示SKOV3细胞增殖能力较对照组明显降低;流式检测显示过表达miR-145的SKOV3细胞凋亡率增加;Transwell实验显示过表达miR-145的SKOV3细胞侵袭能力明显低于对照组.结论:SKOV3细胞miR-145过表达可能通过增加SKOV3细胞凋亡率从而降低细胞增殖和侵袭能力.
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miR-125a-5p对卵巢癌SKOV3细胞增殖和侵袭的影响
目的:研究miR-125a-5p对卵巢癌SKOV3细胞增殖和侵袭的影响.方法:通过慢病毒转染技术将含miR-125a-5p的质粒转入SKOV3细胞中,经嘌呤霉素筛选建立稳定表达mi-125a-5p的SKOV3细胞株.通过实时定量荧光RT-PCR验证miR-125a-5p的表达情况,MTT、流式技术、Transwell、划痕实验检测过表达miR-125a-5p后对SKOV3细胞增殖、凋亡、侵袭及转移能力的影响.结果:过表达miR-125a-5p后,SKOV3细胞增殖能力较对照组有显著提高;流式细胞检测显示过表达miR-125a-5p的SKOV3细胞S期细胞增多,G0/G1期细胞及细胞凋亡率减少;Transwell和划痕实验显示过表达miR-125a-5p的SKOV3细胞侵袭和迁移能力明显高于对照组.结论:SKOV3细胞miR-125a-5p过表达可能通过减少G0/G1期细胞及细胞凋亡率从而促进细胞增殖、侵袭和迁移能力.
关键词： miR-125a-5p 过表达 卵巢癌SKOV3 增殖 侵袭 -
α-synuclein在体外培养SH-SY5Y细胞中过表达致自体吞噬
目的:观察α-synuclein转基因细胞内α-synuclein过表达对细胞超微结构的影响.方法:Lipofectamine法转染SH-SY5Y细胞,用G418对转基因细胞进行筛选,免疫荧光细胞化学检测α-synuclein表达,电子显微镜观察转基因细胞超微结构的改变.结果:转基因细胞内出现大小不等、边界明显的自体吞噬体并伴有线粒体结构紊乱.结论:α-synuclein过表达可致细胞出现自体吞噬现象.
关键词： α-synuclein 过表达 SH-SY5Y细胞 体外研究 自体吞噬
