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硒蛋白S过表达载体的构建及其在肝癌细胞SMMC7721中的表达鉴定
目的：构建硒蛋白S基因（SELS）真核表达载体pCMV-SELS，转染肝癌SMMC7721细胞，实现 SELS 在 SMMC7721中的成功过表达。方法通过基因克隆技术将 SELS 基因的完整ORF插入真核表达载体pCMV-3tag-3a（+），得到阳性真核表达质粒pCMV-SELS，将其瞬时转染到肝癌SMMC7721细胞中，利用RT-PCR与Western blot方法验证SELS的过表达水平。结果成功构建了真核表达质粒pCMV-SELS，将其瞬时转染SMMC7721细胞后24 h，收集细胞进行RT-PCR和Western blot检测，结果显示：与阴性对照组pCMV-3tag-3a（+）转染组相比，实验组pCMV-SELS细胞中SELS的mRNA和蛋白表达水平均有显著升高，两组比较具有统计学差异（P＜0.05）。结论成功构建真核表达载体pCMV-SELS，并实现了SELS基因在SMMC7721细胞中的过表达。
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过表达CD44v6基因对人大肠癌SW480细胞侵袭迁移能力的影响
目的:研究CD44v6基因过表达对SW480细胞侵袭和迁移能力的影响.方法:慢病毒介导的CD44v6过表达细胞(CD44v6组)和空载体对照细胞(NC组)由前期实验构建,采用荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)表达、实时荧光定量PCR检测CD44v6 mRNA表达水平、免疫荧光检测Flag标签蛋白三种方法重新鉴定过表达细胞模型;CCK-8法检测细胞增殖活性;划痕试验和Transwell试验检测细胞侵袭和迁移能力.结果:绿色荧光蛋白观察显示细胞转染效率近100％;实时荧光定量PCR显示CD44v6组细胞CD44v6 mRNA表达水平较对照组显著升高(P＜0.001);Flag标签蛋白免疫荧光染色显示过表达C D44v6蛋白主要定位于细胞膜.CCK-8结果显示2组细胞增殖无明显差异;划痕试验结果显示CD44v6组细胞划痕愈合指数较对照组显著增高(P＜0.05);Transwell试验结果显示CD44v6组细胞迁移和侵袭相关指数均较对照组显著增高(均P＜0.05),且CD44v6抗体处理后,CD44v6组细胞迁移和侵袭相关指数均较前显著减低(均P＜0.05).结论:CD44v基因过表达能显著增强SW480细胞侵袭和迁移能力.
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c-Met蛋白在消化系肿瘤中表达的研究进展
肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)/c-Met与人类许多恶性肿瘤的生长、侵袭及转移密切相关,乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肺癌及消化系肿瘤中均可见HGF/c-Met的激活与过表达.在肿瘤的生长和转移过程中,c-Met担当了重要的角色,针对HGF/c-Met通路的抗肿瘤研究也成为当今研究的热点.c-Met在消化系肿瘤中的表达有较多的报道,本文将相关的新研究做一系统的阐述,以使临床工作者对目前的研究现状有系统的了解.
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非小细胞肺癌肺组织Cripto-1蛋白表达及其临床意义
Cripto-1是一个癌胚基因,主要表达于胚胎早期发育阶段,当细胞发生转化或恶变时又重新表达[1].研究表明Cripto-1过表达于人多种恶性肿瘤,且其表达水平与肿瘤浸润深度及淋巴结转移相关[2-6].本研究通过测定Cripto-1在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达,探讨其在NSCLC发生发展及其转移中的作用.
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XIAP在急性髓系白血病患者及其细胞株中的表达及意义
急性髓系白血病(AML)为第一位的恶性血液系统肿瘤。近年来，通过化疗此类患者的生存率已明显提高，但随之而来的是化疗所导致的耐药。凋亡抑制基因的过度表达是肿瘤发生耐药的主要机制之一，其中XIAP(X-linked inhibitor of apoptosis protein)在包括AML在内的许多恶性肿瘤中的过表达预示预后较差[1-2]。本研究以初治、复发AML患者及正常人为研究对象，同时选用HL-60、K562及HL-60/ADR、K562/ADR(阿霉素诱导)耐药细胞株，通过检测XIAP 的表达，来观察正常人与AML患者之间、耐药与非耐药细胞株之间XIAP表达的差异及意义。
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Chemerin过表达致3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗减少
目的 应用重组慢病毒构建3T3-L1脂肪细胞chemerin过表达模型并进一步探讨其对糖代谢的影响及可能机制.方法 构建鼠chemerin过表达重组慢病毒,并设对照慢病毒,感染3T3-L1细胞,实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)法检测转染后chemerin表达水平;应用胰岛素、3-异丁基1-甲基黄嘌呤、地塞米松诱导3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞,油红O染色鉴定;诱导分化第8天加入慢病毒重组体,继续培养5d,葡萄糖氧化酶法检测各组葡萄糖消耗;RT-PCR法检测各组胰岛素受体底物1(IRS1)、胰岛素受体底物2(IRS2)、蛋白激酶B1 (Akt1)、叉头状转录因子O1 (FoxO1)基因表达水平;Western-blotting检测chemerin、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Akt)、磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(pAkt)、FoxO1、磷酸化叉头状转录因子O1 (pFoxO1)蛋白水平.两组数据比较应用t检验.结果 Chemerin过表达慢病毒感染3T3-L1细胞72 h后细胞中可见红色荧光,RT-PCR结果显示:过表达组与空载对照组相比chemerin基因表达明显增加(分别为3.04±0.19比1.01±0.11,t=15.65,P＜0.05);chemerin过表达组葡萄糖消耗减少[分别为(3.30± 1.44)比(6.07±1.15) mmol/L,t=-0.35,P＜0.05];RT-PCR结果显示:IRS1、IRS2基因水平无明显变化(均P＞0.05),Akt1基因表达下降(分别为0.76±0.08比1.07±0.15,t=-3.11,P＜0.05),FoxO1基因表达上调(分别为1.53±0.30与1.03±0.21,t=2.34,P＜0.05).Western-blotting结果显示:Chemerin过表达后chemerin蛋白水平增加(相对表达量分别为1.08±0.06比0.72±0.03,t=-10.12;P＜0.05);Akt、pAkt蛋白水平均降低(分别为0.74±0.21比1.23±0.20,0.58±0.17比0.92±0.07;t=2.81、3.17,均P＜0.05),FoxO1蛋白水平升高(分别为1.04±0.09比0.76±0.14,t=-2.91,P＜0.05)、pFoxO1蛋白水平降低(分别为0.61±0.13比0.89±0.10,t=2.93,P＜0.05).结论 Chemerin可能通过下调Akt1 mRNA使3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗减少.
关键词： 慢病毒 Chemerin 过表达 3T3-L1脂肪细胞 葡萄糖消耗 -
Six1基因在乳腺癌中的研究进展
同源盒基因Six1是一种转录因子,在多种恶性肿瘤的发生发展中发挥作用,与乳腺癌的发生、发展过程也密切相关.目前对Six1的研究较多,结果显示,其过表达可诱导乳腺干细胞的活化、激活TGF- Bate通路和Wnt/β- catenin通路,促使乳腺上皮细胞发生上皮间质转变,进而恶变形成肿瘤.本文对Six1在乳腺癌发生、发展中的作用及分子机制研究进展进行总结.
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葛根素对成骨细胞中miRNA-204的调控及其与Runx2基因表达的关系
目的 研究葛根素作用于成骨细胞MC3T3-E1后miRNA表达的变化以及与Runx2基因表达的关系.方法 RT-PCR和western blot法检测Runx2的mRNA表达水平和蛋白表达水平;miRNA表达谱检测葛根素作用于成骨细胞后可能靶向Runx2的miRNA;Target Scan、PicTar等靶点预测软件预测靶向Runx2的miRNA;RT-PCR测定miRNA-204表达量;构建Runx23' UTR/突变型Runx2 3'UTR重组质粒、合成miRNA-204mimics和miRNA-204NC共转染MC3T3-E1细胞,双荧光素酶报告基因系统验证靶基因;miRNA-204mimics和miRNA-204inhibitor转染MC3T3-E1细胞,RT-PCR和western blot检测转染前后Runx2的mRNA表达量和蛋白表达量的变化.结果 与空白组比较葛根素作用后Runx2的miRNA和蛋白表达均上升;miRNA-204表达水平下降;表达谱和靶点预测软件预测靶向Runx2的miRNA共同有miR-204、miR-3072-3p等;过表达miRNA-204后Runx2的蛋白表达水平下降,干扰miRNA-204表达后Runx2的蛋白水平上升.结论 葛根素在成骨细胞中可通过调节靶向Runx2基因的miRNA-204来促进细胞增值分化.
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联合曲妥珠单抗新辅助化疗对HER-2过表达乳腺癌的疗效
表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）过表达的乳腺癌患者其生物学行为恶性度高，无瘤生存期和总生存期较短[1]。深圳市第二人民医院乳房疾病诊疗中心2008年1月至2010年6月收治的34例HER-2过表达乳腺癌患者，采用曲妥珠单抗联合多西他赛及卡泊新辅助化疗，治疗6个周期后手术，疗效良好，现报道如下。
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PI3K/AKT/MTOR信号通路关键信号分子在胃癌组织中的表达及与临床特征的关系
目的 探讨磷脂肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/雷帕霉素靶蛋白(MTOR)信号通路关键信号分子在胃癌组织、癌旁组织及正常胃黏膜组织中的表达情况.方法 收集120例同一患者胃癌组织、癌旁组织及正常胃黏膜组织标本,采用免疫组化法及Western blot法检测PI3K/AKT/MTOR信号通路的关键信号分子p-AKT及p-MTOR在3组标本中的表达情况,并分析120例胃癌患者p-AKT及p-MTOR表达与临床特征的关系.结果 胃癌组织中p-AKT阳性表达率为71.67％,分别高于癌旁组织(30.00％)及正常胃黏膜组织(24.17％),差异均有统计学意义(P﹤0.05);癌旁组织及正常胃黏膜组织中p-AKT阳性表达率比较,差异无统计学意义(P﹥0.05).胃癌组织、癌旁组织中p-MTOR阳性表达率分别为76.67％和64.00％,均高于正常胃黏膜组织(19.17％),差异均有统计学意义(P﹤0.05);胃癌组织、癌旁组织中p-MTOR阳性表达率比较,差异无统计学意义(P﹥0.05).p-AKT、p-MTOR在低分化、TNM分期为Ⅲ+Ⅳ期的胃癌组织中阳性表达率及蛋白相对表达量均高于高中分化、TNM分期为Ⅰ+Ⅱ期的胃癌组织,差异均有统计学意义(P﹤0.05);而不同年龄、肿瘤直径、浸润深度、淋巴结转移情况胃癌患者的胃癌组织中p-AKT、p-MTOR阳性表达率及蛋白相对表达量比较,差异均无统计学意义(P﹥0.05).结论 PI3K/AKT/MTOR信号通路的关键信号分子异常活化与过度表达,对胃癌的发生、发展可能起着促进作用,在开辟生物治疗途径上具有重要临床应用价值.
关键词： PI3K/AKT/mTOR信号通路 P-AKT p-mTOR 胃癌 过表达 -
EZH2基因在消化系统肿瘤中的研究进展
多梳抑制复合物2(PRC2)是一种作用于组蛋白H3赖氨酸位点K27的高度保守的组蛋白甲基转移酶,是PcG蛋白家族的一员.而PRC2的催化亚基是果蝇Zeste基因增强子同源物2(EZH2).大量研究证明,EZH2在多种肿瘤组织中高表达,例如乳腺癌、非小细胞肺癌、胃癌等.本文总结了EZH2基因的起源、结构、生物学功能及其在消化系统肿瘤中的研究进展,并对EZH2的靶向治疗进行展望.
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阻断胰岛素样生长因子-1受体信号传导路径对人乳腺癌细胞放射增敏作用机制研究
胰岛素样生长因子-1受体(insulin-like growth factor-1 receptor,IGF-1R)在多种肿瘤中存在过表达,并与肿瘤细胞增殖、存活、侵袭及转移密切相关[1-2].近研究表明IGF-1R的表达与肿瘤放射抗拒相关[3],但其对肿瘤放射敏感性的调节机制尚不清楚,故采用IGF-1R小分子抑制剂AG1024研究其对乳腺癌细胞的放射增敏机制.
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受体活性修饰蛋白1过表达对降钙素基因相关肽促MG-63增殖作用的影响
目的 探讨受体活性修饰蛋白1( receptor activity modifying protein 1,RAMP-1)过表达对降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)促进MG-63细胞增殖作用的影响,以期阐明神经多肽系统在口腔颌面部创伤修复中的机制.方法 传代培养MG-63细胞并按完全随机法分为3组:RAMP-1过表达组、空载体组、空白对照组.构建人RAMP-1真核表达载体并稳定转染至MG-63细胞中.实时聚合酶链反应、蛋白质印迹法和免疫荧光法分别检测降钙素受体样受体( calcitonin receptor-like receptor,CRLR)在细胞中的表达及在膜上的分布；在0、24、48、72、96 h时使用细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8,CCK-8)分别检测3组细胞增殖情况；分别在0、8、16、24 h时使用流式细胞仪收集并分析细胞周期.对蛋白质印迹法和实时聚合酶链反应结果进行单因素方差分析和多重比较检验,对细胞增殖和细胞S期百分率的结果采用双因素方差分析并对处理因素进行多重比较检验.结果 RAMP-1过表达组MG-63细胞的CRLR蛋白及mRNA表达水平明显高于其他两组(P＜0.05)；RAMP-1过表达组在24、48、72及96 h时的A值分别为0.628±0.175、0.896±0.592、1.055±0.004、1.179±0.618,均显著高于相同时间点其他两组A值(P＜0.05),在72 h时与空白对照组(0.786±0.048)差距明显.RAMP-1过表达组在0、8、16及24 h时S期百分率分别为(1.25±0.13)％、(68.79±0.56)％、(64.49±1.59)％、( 57.82±0.75)％,均显著高于其他两组(P＜0.01),在8h时与空白对照组[(41.235±1.773)％]差距显著.结论 RAMP-1过表达能促进MG-63细胞膜上的CRLR分布,增强CGRP对MG-63细胞的促增殖作用.
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鼠疫耶尔森菌中长度在100nt以内的小RNA缺失株及过表达菌株的构建
目的 构建鼠疫耶尔森菌中长度在100 nt以内的小RNA缺失株及过表达菌株的方法.方法 在高拷贝质粒pBAD/HisA的基础上利用定点突变试剂盒制备一个可诱导的转录融合载体作为小RNA的过表达质粒.通过转录组测序、引物延伸并参考已有文献,预测了目的小RNA的存在、大小以及转录起始位点等,将目的小RNA的全长导入到改造后的质粒中并构建小RNA的过表达菌株.结果与结论 成功构建了小RNA sR01、sR02、sR03、HmsA 4株缺失株以及小RNA MicF、HmsA、CpxQ 3株过表达菌株. 建立了基于λ-Red同源重组、100 nt以内短片段小RNA敲除方法和基于定点突变试剂盒改造质粒的小RNA过表达菌株构建方法.
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CDT1基因过表达对辐射诱发基因组不稳定肝细胞HL-7702凋亡及细胞周期的影响
目的 研究CDT1基因过表达对辐射诱发基因组不稳定肝细胞凋亡及细胞周期的影响.方法 选择基因组不稳定肝细胞HL-7702,利用慢病毒介导的过表达技术,上调辐射诱发基因组不稳定肝细胞中CDT1基因的表达,通过流式细胞术研究CDT1基因过表达对细胞周期及细胞凋亡的影响;利用实时荧光定量PCR方法,检测CDT1基因上调后p53、ATM、ATR、Bcl-2、Caspase-3基因的表达变化.结果 慢病毒介导的过表达能有效上调HL-7702细胞中CDT1基因的表达(t=15.56,P＜0.05),与阴性对照组相比,CDT1基因的上调能够导致基因组不稳定肝细胞HL-7702凋亡率升高(t=4.19,P＜0.05);CDT1基因的过表达能诱发基因组不稳定肝细胞p53、Bcl-2基因的表达显著下调(t=-4.21、-2.06,P＜0.05),同时,ATM基因上调,ATR和Caspase-3基因下调,但差异均无统计学意义.结论 CDT1基因的过表达通过参与非p53依赖的凋亡途径以及细胞周期检查点适应性对基因组不稳定性进行调控.
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醛缩酶A基因促进肝癌细胞增殖
目的：初步探索醛缩酶A基因敲除与过表达对肿瘤细胞生长的影响，确定无氧代谢过程中醛缩酶与肿瘤生长代谢之间的关系。方法通过表达载体质粒构建与慢病毒感染构建稳定表达的醛缩酶A过表达与基因敲除细胞，在基因和蛋白水平验证重组细胞，观察细胞增殖速度改变。结果实时定量PCR结果显示，过表达细胞系中目的基因的表达约为正常细胞的2倍；根据醛缩酶A RNA序列设计5个干扰靶点，其中醛缩酶A4对于目的基因的干扰效果为显著，重组后的细胞醛缩酶A mRNA表达水平为正常细胞的1/50。与正常对照组相比，醛缩酶A过表达细胞在48 h增殖率增加40%，增殖率与对照组相比有显著性差异（P＜0.05）；醛缩酶A RNA干扰表达细胞在24 h增殖率降低86%，与对照组相比有显著性差异（P＜0.05）。结论醛缩酶A的表达差异对肝癌肿瘤细胞生长有明显影响。
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黄花蒿羟甲基丁烯基-4-磷酸还原酶基因克隆与功能研究
青蒿素是治疗疟疾的首选药物,定位于质体的MEP途径可为青蒿素在内的萜类物质的合成提供基本前体.羟甲基丁烯基-4-磷酸还原酶[hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl 4-diphosphate reductase,HDR]是MEP途径后一个酶,催化HMBPP生成IPP和IPP的同分异构体DMAPP.本文克隆了黄花蒿HDR基因(AaHDR2)并进行了相关功能研究.通过对AaHDR2基因(GenBank:KX058541)和已报道的AaHDR1基因(GenBank:ADC84348.1)表达分析结果表明:AaHDR1和AaHDR2在黄花蒿腺体中表达量均远高于在根、茎、叶和花中的表达量,而且AaHDR2在花中的表达量要明显高于叶中;MeJA和ABA能够大幅度上调AaHDR1和AaHDR2的表达,而GA3仅能大幅度上调AaHDR2的表达.据AaHDR1和AaHDR2的表达分析表明,AaHDR2对青蒿素在内的萜类物质的生物合成贡献更大,因此用AaHDR2进行后续的实验研究.生物信息学分析表明,AaHDR2属于HDR家族,进一步采用功能互补在E.coli突变体MG 1655ara＜＞HDR中证明AaHDR2编码蛋白质的确具有HDR的功能.AaHDR2亚细胞定位结果显示:AaHDR2融合GFP蛋白特异性定位于叶绿体中,符合MEP途径定位于质体的事实.采用转基因技术在拟南芥中过表达AaHDR2能显著性提高叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量.因此,本文所克隆的AaHDR2是利用代谢工程技术提高萜类物质生物合成能力的一个候选基因.
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TwHMGR过表达对雷公藤甲素和雷公藤红素生物合成的影响
雷公藤3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(Tripterygium wilfordii 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme-A reductase,TwHMGR,GenBank:ALU11310.1 3)是MVA途径中的第一个限速酶,是细胞质中萜类代谢途径中的重要调控位点.为探讨TwHMGR对雷公藤甲素和雷公藤红素生物合成的影响,对其进行了过表达研究.利用Gateway技术将TwHMGR的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)构建到过表达载体中,通过基因枪介导过表达载体转入雷公藤悬浮细胞.qRT-PCR结果显示TwHMGR的基因相对表达量在过表达组显著提高,是空载体组基因相对表达量的1.75倍;UPLC结果显示雷公藤甲素及雷公藤红素含量在过表达组中分别提高为空载组的163.93％和190.04％.本实验中TwHMGR在雷公藤悬浮细胞中成功过表达,表现为基因相对表达量的上升和雷公藤甲素及雷公藤红素含量的上调,证明了TwHMGR在雷公藤萜类成分生物合成途径上的正向调节作用,为雷公藤重要活性萜类成分的合成生物学研究奠定了基础.
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过表达α2,3-唾液酸转移酶基因对乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响
目的 研究过表达α 2,3-唾液酸转移酶(ST3GalⅢ)基因对乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响.方法 构建ST3 GalⅢ慢病毒表达载体,转染MDA-MB-231细胞.将转染细胞分为空白组(未转染,Mock cells,M)、对照组(转染对照慢病毒,Parent cells,P)和实验组(转染慢病毒载体,ST3 GalⅢ,ST3).用实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)和免疫印迹法检测转染后ST3 GalⅢmRNA及蛋白表达,流式细胞术分析转染后ST3GalⅢ催化形成下游产物唾液酸化Lewis抗原(SLeX)变化;用细胞黏附实验、Transwell小室检测MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响.结果 RT-PCR与Western bolt显示对照组和实验组中ST3GalⅢmRNA相对表达量分别为0.91 ±0.04,1.85 ±0.08;蛋白相对表达量分别为0.94±0.04,1.96±0.10;实验组mRNA和蛋白表达分别为对照组1.84倍和1.76倍(P＜0.05);实验组细胞表面SLeX含量为92.86±4.41,为对照组的1.61倍,含量明显升高(P＜0.05).细胞黏附检测结果表明,空白组、对照组和实验组的OD570nm分别为0.32 ±0.02,0.29±0.01和0.46±0.03;细胞侵袭能力结果表明,空白组、对照组和实验组的OD570 nm分别为0.93±0.02,0.81±0.01和1.46±0.13,实验组与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 过表达ST3 GalⅢ基因可提高MDA-MB-231细胞侵袭能力.
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益心解毒方对Nox2和Nox4亚基过表达的心肌细胞NADPH氧化酶活性的影响
目的：通过观察益心解毒方含药血清对Nox2、Nox4亚基过表达的H9 c2心肌细胞NADPH氧化酶活性的影响，揭示其作用环节是否与干预相应亚型的 NADPH 氧化酶调控环节有关。方法采用PCR方法扩增Nox2、Nox4基因全长序列，经双酶切、连接载体和转化后提取重组质粒，经酶切鉴定的阳性质粒进行DNA测序，测序正确后按照lipofectamine 2000试剂的说明书瞬时转染H9 c2细胞，转染后的心肌细胞分组给予不同的药物干预，24 h 后检测 NADPH 氧化酶活性。结果①含有Nox2／Nox4亚基的重组质粒载体通过测序鉴定，结果与GenBank报道的完全一致。②通过荧光显微镜下观察转染72 h后的H9 c2细胞，可见大量发绿色荧光的细胞，流式细胞术计数结果显示转染率均在60％左右，符合实验要求。③空质粒载体组、模型组、益心解毒方组的NAD－PH氧化酶活性表达明显高于正常组（ P＜0．01，P＜0．05）；模型组和益心解毒方组的NADPH氧化酶活性表达高于空载体组（ P＜0．01）；模型组NADPH氧化酶活性表达均明显高于其他各组，而益心解毒方各组的NADPH氧化酶活性表达均明显低于模型组（ P＜0．01， P＜0．05）。结论成功构建大鼠心肌细胞Nox2、Nox4亚基的重组质粒载体，该重组质粒载体可以在心肌细胞中过表达，益心解毒方可以有效地降低NADPH氧化酶活性的表达。提示此复方治疗心衰的机制可能是抑制了Nox2和Nox4型NADPH氧化酶的表达。
关键词： 益心解毒方 H9C2心肌细胞 过表达 NADPH 氧化酶活性
