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胃癌细胞中miRNA-204过表达的作用
目的 观察过表达miR-204对胃癌细胞生长、凋亡的影响.方法 实时荧光定量PCR检测胃癌细胞系中miR-204的表达,将其转染入胃癌细胞系,采用MTS及流式细胞术测定肿瘤细胞的生长、凋亡状况.结果 miR-204在不同胃癌细胞系中均是低表达,与组织中情况一致；过表达miR-204,未出现胃癌细胞生长减慢、凋亡增加的情况.结论 过表达miR-204对胃癌细胞系的生长、凋亡无明显影响.
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6-OHDA诱导过表达nurr1基因的SK-N-SH细胞凋亡
比较自身不表达核相关受体因子（nuclear receptor related factor1,Nurr1）基因的人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH和过表达外源性nurr1基因的SK-N-SH/Nurr1细胞对6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)的损伤反应,探讨nurr1基因在6-OHDA致细胞损害（死亡或凋亡）中的作用.方法用免疫细胞化学方法和RT-PCR检测基因转染细胞SK-N-SH/NURR1的nurr1蛋白及NURR1 mRNA的表达.细胞经不同浓度6-OHDA(50 ～100 μmol/L)作用不同时间(6、12 h),经AnnexinV/PI双染后流式细胞术( flow cytometry,FCM)测定早期细胞凋亡比例.细胞经75 μmol/L 6-OHDA作用12 h,通过透射电镜(transmission electron microscopy,TEM)观察细胞超微结构变化.用Western blotting方法检测75 μmol/L 6-OHDA作用6、12h,细胞凋亡因子Caspase-3活性前体蛋白的表达水平.结果免疫细胞化学染色结果显示,基因转染细胞SK-N-SH/Nurr1表达NURR1蛋白；经RT-PCR检测,基因转染细胞表达NURR1 mRNA,说明外源性nurr1基因在转染细胞内过表达.FCM检测结果显示,75 μmol/L 6-OHDA作用12 h,SK-N-SH/Nurr1细胞凋亡比例明显高于SK-N-SH细胞(P =0.000),而100 μmol/L 6-OHDA作用6、12 h后,2株细胞均表现为毒性损伤.TEM显示,75 μmol/L 6-OHDA作用12 h后,部分SK-N-SH/Nurr1细胞出现了典型凋亡改变,而SK-N-SH细胞主要表现为毒性损伤.4.75 μmol/L 6-OHDA作用6、12 h,SK-N-SH/Nurr1细胞Caspase-3活性前体蛋白表达显著下降(P =0.000),而SK-N-SH细胞Caspase-3活性前体蛋白表达变化不明显.结论外源性nurr1基因过表达促进6-OHDA诱导的SK-N-SH/Nurr1细胞凋亡,在低剂量(≤75 μmol/L)时,凋亡比例与剂量呈正相关,高剂量时6-OHDA主要诱导细胞毒性损伤.
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EGFR在三阴乳腺癌中的过表达与扩增情况分析
目的 探讨EGFR在三阴乳腺癌(TNBC)中的过表达及扩增情况,以及两种情况之间的联系.方法 通过免疫组化(IHC)和荧光原位杂交(FISH)实验方法,对54例三阴乳腺癌患者的癌组织切片进行分析,得出EGFR的过表达及扩增情况.结果 EGFR过表达者29例(53.7％),EGFR基因扩增者5例(9.8％)；EGFR基因扩增病例皆为过表达病例.结论 EGFR在TNBC中存在明显的过表达现象,可以成为TNBC综合评价的一个重要标志物；尽管扩增的样本都为过表达的样本,但笔者认为不足以证明EGFR的过表达完全是由其扩增引起.
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乳腺癌HER2阳性的分子靶向治疗研究进展
乳腺癌是一个严重危害妇女健康的恶性肿瘤,全世界每年约有135万妇女患乳腺癌,约有33万妇女死于乳腺癌[1].手术、化疗、放疗及内分泌治疗可以使许多患者得到较好的疗效,但仍有25％～30％的乳腺癌患者发生远处转移[2].目前研究发现HER2基因在20％～ 30％的乳腺癌患者中扩增,其过表达与乳腺癌的发生、发展密切相关,并且这部分患者病情重、预后差[3].近年来,随着肿瘤分子生物学研究的日趋深入,乳腺癌的分子靶向治疗越来越被广泛应用,尤其是针对乳腺癌HER2阳性的分子靶向治疗更是越来越受到重视.
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过表达mimecan对人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的作用初探
目的 应用反转录病毒载体技术构建稳定过表达mimecan的人脐静脉内皮细胞株(HUVEC),并观察过表达mime-can后HUVEC增殖及凋亡的变化.方法 应用反转录病毒载体构建稳定过表达mimecan的HUVEC细胞株,real-time PCR和Western blot法检测mRNA和蛋白水平的表达.应用CCK-8方法检测过表达mimecan后HUVEC增殖的变化,应用Annexin V-PE染色观察过表达mimecan后HUVEC凋亡的变化.结果 构建了稳定过表达mimecan的HUVEC细胞株.过表达mimecan后,HUVEC增殖能力降低,凋亡率增加.结论 过表达mimecan抑制HUVEC的增殖,促进其凋亡.
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大鼠免疫球蛋白样转录物3过表达腺病毒载体的构建及鉴定
目的 构建免疫球蛋白样转录物3(immunoglobulin-like transcript 3,ILT3)过表达腺病毒载体,以期进一步研究ILT3基因功能及其在心血管疾病中的作用.方法 针对大鼠ILT3设计引物,通过PCR扩增获取目的基因,以琼脂糖凝胶电泳鉴定,行胶回收与PCR产物纯化.使用限制性内切酶BamH Ⅰ与Age Ⅰ对载体质粒以及纯化后的PCR产物进行双酶切,将酶切后的PCR产物与载体连接,连接产物加入至感受态细胞培养后挑取菌落进行PCR鉴定、测序、比对及质粒抽提.将ILT3重组质粒与腺病毒辅助包装质粒共转染至HEK293细胞,获取病毒粗提液并进行扩增、纯化,终点稀释法进行病毒效价检测,在荧光显微镜下观察腺病毒转染效率.结果 PCR与测序鉴定表明GV314-ILT3重组质粒构建成功.终点稀释法测得病毒效价为1×109PFU/ml,荧光显微镜下观察显示病毒转染效率较高.结论 携带ILT3基因的腺病毒载体构建成功,获取的腺病毒具有较高的效价与转染效率.
关键词： 免疫球蛋白样转录物3 质粒 腺病毒 过表达 基因重组 -
MDM2和MDM4对P53调控研究进展
P53蛋白是DNA损伤的关键调节因子,对P53的严格调控是哺乳动物细胞存活所必须的,P53过多表达或不当的激活使细胞死亡,而表达减少或失活则导致肿瘤的发生.编码P53的基因在肿瘤中常发生突变或缺失,分别在1980年和1990年发现的鼠双微基因MDM2和MDM4在许多肿瘤中扩增和过表达,并可导致P53蛋白的失活[1].通过与P53相互作用对其发挥调节作用的蛋白超过160种,几乎每月都会发现一种新的P53调节蛋白.而MDM2和MDM4不仅在肿瘤中表达经常发生变化,在胚胎发育过程中也对P53发挥特异性的抑制作用[2].因此进行MDM2和MDM4对P53调控的研究,具有重要的病理生理意义.
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TCAB1慢病毒表达载体的构建及其在人子宫内膜间质细胞中的表达
目的 构建TCAB1基因的慢病毒过表达载体并验证在人子宫内膜间质细胞株(St-T1b)过表达效果.方法 通过PCR获取TCAB1全长基因,进行TA克隆,进一步亚克隆构建TCAB1慢病毒表达载体,包被慢病毒后感染StT1b细胞,通过观察荧光表达和实时定量PCR验证其表达.结果 成功构建PLVX-TCAB1-IRES-ZsGreen1慢病毒表达载体并获得相应的慢病毒.荧光显微镜、实时定量PCR结果表明,TCABl基因可在St-T1b细胞中实现过表达效果.结论 成功构建人TCAB1基因特异性的重组慢病毒过表达载体,且证实包被的慢病毒可实现TCAB1基因在St-T1b细胞中的过表达,为后续人TCAB1在人子宫内膜间质细胞的功能研究奠定了基础.
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慢病毒介导的稳定过表达人谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚基基因的WRL68细胞株构建
目的 利用慢病毒载体构建稳定过表达人谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)的WRL68细胞株.方法 采用PCR方法合成GCLC基因全长,经NotⅠ、NsiⅠ酶切后克隆到慢病毒载体LV6上;采用PCR、酶切、测序鉴定重组质粒LV6-GCLC;将重组质粒转染293T细胞,收集培养上清并感染WRL68细胞,经嘌呤霉素筛选出稳定过表达细胞株.采用增强型绿色荧光蛋白检测转染情况,采用Real-time PCR及Western blotting鉴定所构建的细胞株;MTT法检测细胞活性;采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测细胞谷胱甘肽(GSHl)含量.结果 PCR、酶切及测序结果表明重组慢病毒载体构建成功;重组慢病毒转染293T细胞后可观察到荧光及蛋白表达,包装过表达慢病毒并检测其浓缩滴度为1.0× 109 TU/ml;用1μg/ml嘌呤霉素成功筛选出稳定过表达细胞株;GCLC过表达组中GCLC的mRNA和蛋白的表达量高于空载体转染组及对照组(P＜0.05);GCLC过表达组、空载体转染组及对照组的细胞活性间比较,差异无统计学意义(P＞0.05);GCLC过表达组GSH含量明显高于空载体转染组及对照组(P＜0.05).结论 成功构建了稳定过表达人GCLC的WRL68细胞株.
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应用Gateway技术构建过表达β-catenin基因的慢病毒载体
目的 应用Gateway技术构建靶向过表达β-catenin基因的慢病毒载体,验证该载体的功能.方法 利用多位点Gateway克隆技术,通过BP重组反应,构建穿梭载体pDown-Ctnnb1；再通过LR重组反应,将pUp-EF1A、pDown-Ctnnb1、pTail-IRES/DsRed-Express2和母载体pLV.Des3d.P/puro 4个质粒构建成表达载体pLV.EX3d.P/puro-EF1A＞Ctnnb1 ＞IRES/DsRed-Express2;再转化到感受态细胞stbl3,经PCR筛选菌落阳性克隆测序鉴定.将成功构建的慢病毒表达载体转染293T细胞,用实时荧光定量PCR法验证重组载体对β-catenin基因mRNA水平的影响.结果 菌落PCR筛选和DNA测序鉴定显示入门克隆和表达载体插入片段序列正确,实时荧光定量PCR证实β-catenin基因mRNA水平显著上调(P＜0.01).结论 成功构建能显著上调β-catenin基因mRNA表达的慢病毒载体.
关键词： 多位点Gateway技术 β-catenin 过表达 慢病毒载体 293T细胞 -
冷应激条件下猪睾丸细胞中RNA结合基序蛋白3过表达对Caspase3表达的影响
目的:探讨冷应激(32℃)条件下,猪睾丸(ST)细胞系中RNA结合基序蛋白3(RBM3)过表达时凋亡蛋白半胱天冬酶3(Caspase 3)表达量变化情况.方法:利用本实验室成功构建的携带绿色荧光蛋白(GFP)的RBM3过表达慢病毒载体pLenti6/V5-GW/EmGFP-RBM3和空病毒载体pLenti6/V5-GW/EmGFP-DEST分别感染ST细胞,作为过表达病毒(OEV)组和空载体病毒-(EVV)组,此外还设立野生型细胞(WTC)组作对照,利用实时荧光定量RCR(qPCR)法和Western blot分析法检测各组中RBM3 mRNA和蛋白的表达情况.然后对各组细胞进行37℃以及32℃(2 h、4h,8h)的冷应激处理,利用酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测各组Caspase 3表达量的变化.结果:OEV组RBM3基因和蛋白相对表达量高于EVV组和WTC组.在37℃以及32C冷应激实验(2h、4h,8h)中,OEV组Caspase 3表达量显著低于EVV组和WTC组.结论:冷应激ST细胞中RBM3过表达能够显著地降低Caspase 3的表达程度,为RBM3基因具有抵抗低温诱导ST细胞凋亡作用提供实验依据.
关键词： RNA结合基序蛋白3 冷应激 过表达 猪睾丸细胞系 半胱天冬酶3 -
雷帕霉素治疗伊马替尼耐药的难治性慢性髓系白血病急髓变
伊马替尼是治疗慢性髓系白血病(CML)有效的药物,但其耐药性的产生以及微量残留病的存在严重影响了伊马替尼的疗效.耐药性的产生与几种不同的机制有关,其中包括Abl激酶区域的突变,BCR-ABL的过表达,代偿性的PI3K/Akt/mTOR通路的激活[1-2].
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PPO在MAPK通路中一个新癌基因
目的:在1p36区寻找新的癌基因,用于癌症的诊断和治疗.方法:通过克隆筛选与癌症相关的基因.定量PCR检测该基因在各种肿瘤组织和细胞株中的表达量.利用基因重组的方法构建该基因的表达质粒,并研究该基因在细胞水平和活体水平对细胞增殖及磷酸化功能的影响.结果:在人类第1号染色体上发现了一个新的癌基因PPO.人类多种肿瘤组织中,该基因均呈高表达,从细胞水平到活体水平均证实,该基因与增殖和磷酸化有关.结论:我们在1p36区克隆出了一个新的基因,该基因与细胞增殖及磷酸化功能有关.并命名为PPO(Proliferation and Phosphorylation Oncogene).PPO能使MAPK通路中ERK2和MEK1/2磷酸化,推测PPO可能是在MAPK通路中一个新的癌基因.
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表皮生长因子受体在人头颈部鳞状细胞癌中的作用研究进展
头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)是常见的恶性肿瘤,恶性程度较高,患者常出现复发和转移.表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是重要的癌基因,在头颈鳞癌中广泛过表达,且与HNSCC患者的预后呈负相关,是重要的治疗靶点.但HNSCC中的EGFR靶向治疗效果却不如在非小细胞肺癌治疗中那么有效.近几年的研究发现,EGFR促进肿瘤细胞对治疗耐受的机制可能与其过表达、突变、单核苷酸多态性、入核和自噬有关.本文将就这几个方面进行综述,并探讨如何在HNSCC的治疗中更有效地利用EGFR这一靶点,为探索HNSCC的治疗策略提供新的方向.
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FOXQ1稳定表达乳腺癌细胞系的建立及鉴定
目的：建立稳定过表达FOXQ1乳腺癌细胞系，为进一步研究FOXQ1在体内乳腺癌转移、血管生成、抗凋亡机制，以及以FOXQ1为靶点开发抗肿瘤药物提供细胞研究模型。方法：采用脂质体转染的方法将真核表达质粒FOXQ1转染至MDA-MB-231-luc细胞，经G418筛选及克隆化培养，获得稳定过表达FOXQ1蛋白的细胞系。通过RT-qPCR、Western blot对细胞系中FOXQ1的表达进行鉴定。通过Transwell迁移侵袭等实验，观察过表达FOXQ1后对231-luc细胞EMT相关蛋白表达、231-luc细胞迁移侵袭等生物学特性的影响。结果：获得过表达FOXQ1的稳定细胞系，迁移侵袭实验表明该细胞系恶性化程度明显高于野生型。结论：成功建立稳定过表达FOXQ1的乳腺癌细胞系，FOXQ1在细胞核中高表达，进而增加EMT间质标志物Fn1、Vim的表达，增强231-luc的迁移侵袭能力。
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膜联蛋白A5过表达对宫颈癌细胞系SiHa形态的影响
膜联蛋白(ANXA)是一个Ca2+依赖的磷脂结合蛋白家族,结构上,它们都有C端保守的核心区域,N端序列中有磷脂酶A2(PLA2)和蛋白激酶C(PKC)的结合位点.功能上,在Ca2+存在的条件下,它们可与细胞膜上的磷脂酰丝氨酸(PS)可逆性地结合.PKC是胞外细胞信号转导通路的重要成分,若过度激活会造成细胞增殖失调,佛波脂(PMC)是PKC的激动剂,可持续激活PKC而引起肿瘤的发生.
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生长激素抑制素基因过表达慢病毒载体的构建及鉴定
目的 探讨构建人生长激素抑制素(Somatostatin,SST)基因过表达慢病毒载体的技术方法 ,为后续构建SST过表达子宫内膜癌细胞系提供基础.②方法 通过设计SST基因引物,使用聚合酶链反应(PCR)的方法 ,扩增SST基因片段;使用EcoR I和BamHI两种限制性内切酶进行双酶切pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro慢病毒载体和目的 基因SST片段,将两者酶切后的片段使用T4 DNA连接酶进行连接,从而使将SST基因插入pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro慢病毒载体上,构建pLVX-SST-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro重组载体;运用双酶切后PCR方法 鉴定阳性克隆的pLVX-SST-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro载体;将重组载体转染293T细胞(人胚肾细胞),进行慢病毒包装并且观察其感染效率及测定病毒滴度.③结果 通过PCR成功扩增SST基因并连接到pLVX-mCMV-Zs-Green-PGK-Puro慢病毒载体上,通过DNA测序鉴定,并与GenBank上的SST基因标准序列进行对比,证明pLVX-SST-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro过表达慢病毒载体构建成功,将其转染293T细胞后可观察到绿色荧光的表达.成功包装SST过表达慢病毒载体然后测其滴度为1.0×108 TU/mL.④结论 成功构建pLVX-SST-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro慢病毒载体,为SST基因的后续研究提供了实验基础.
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过表达SOX11基因对人视网膜母细胞瘤Y79细胞增殖凋亡影响的研究
目的:探讨过表达SOX11(Sex determination region of Y chromosome 11)基因对人视网膜母细胞瘤Y79细胞增殖、凋亡的影响及参与该过程的细胞信号传到途径.方法:将用重组pcDNA3.1-SOX11质粒转染的Y79细胞作为实验组,以空载体pc-DNA3.1-mock转染的细胞作为对照组.细胞增殖通过Edu细胞荧光染色法检测,细胞凋亡通过Hoechst 33342细胞染色法检测.PTEN、AKT及p-AKT的表达采用westernblot法检测.结果:实验组中SOX11 mRNA的相对表达量显著高于对照组[(354±26.2)％vs(100±1.3)％,P<0.05].实验组细胞在450nm吸光(OD)值低于对照组(2.8±0.3 vs 4.5±0.3,P<0.05).Edu免疫荧光染色结果证实,实验组细胞增殖比例较对照组低[(12.4±4.3)％vs(32.3±3.3)％,P<0.05].Hoechst 33342细胞凋亡荧光染色结果表明,实验组细胞凋亡比例较对照组高[(10.3±2.3)％vs(5.3±1.4)％,P<0.05].Western blot实验结果表明,实验组PTEN蛋白的相对表达量高于对照组(0.6±0.03 vs 0.3±0.03,P<0.05),磷酸化Akt的相对表达量低于对照组(0.4±0.02 vs 0.7±0.02,P<0.05).结论:过表达SOX11基因显著抑制人视网膜母细胞Y79的增殖并促使细胞凋亡.PTEN/Akt信号通路的激活可能参与该过程.
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GINS2过表达对NB4细胞和K562细胞凋亡的影响
目的:利用Ad-GINS2感染白血病细胞NB4细胞和K562细胞,观察其对白血病细胞凋亡的影响.方法:通过Ad-GINS2感染NB4细胞和K562细胞,荧光显微镜观察荧光表达情况,流式细胞术检测K562细胞和NB4细胞的凋亡和细胞周期分布情况,利用Western blotting技术检测凋亡蛋白bax和抗凋亡蛋白bcl-2的表达水平.结果:Ad-GINS2感染NB4细胞和K562细胞,72h后观察荧光表达情况;流式细胞术检测NB4细胞和K562细胞的凋亡率下降,与空载组和未处理组相比,差别有统计学意义(P<0.05);细胞周期分布结果显示,NB4细胞S期比例升高,G1细胞比例下降,与未处理组及空载组相比,差别有统计学意义(P<0.05);K562细胞S期和G2期细胞比例升高,G1细胞比例下降,与未处理组及空载组相比,差别有统计学意义(P<0.05);Western blotting技术检测凋亡蛋白bax下降,抗凋亡蛋白bcl-2表达升高.结论:GINS2基因的重组腺病毒载体成功感染NB4细胞和K562细胞并且抑制细胞凋亡,进而发现细胞凋亡可能与细胞周期进程相关,为进一步明确GINS2基因在白血病中的作用奠定了一定基础.
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单核细胞趋化蛋白-1与糖尿病动脉粥样硬化的关系
在人和动物动脉粥样硬化损伤处80%的白细胞是单核/巨噬细胞.单核细胞趋化蛋白(MCP)-1是调节单核细胞/巨噬细胞迁移与渗透的重要的趋化因子.形成粥样斑的细胞(包括内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞等)通过表达MCP-1和趋化因子受体2途径增加动脉粥样硬化损伤.长期高血糖形成的高级糖基化终末产物(AGE)及糖尿病状态时一氧化氮(NO)合成减少或活性下降均可使MCP-1的表达增加.MCP-1可导致血管内皮系统功能的损害和诱导血管平滑肌细胞的增殖和迁移等而引起或加重动脉粥样硬化病变.
