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RNA干扰对过表达Hlrg的Hep G2细胞的影响
为观察RNA干扰对过表达Hlrg蛋白的Hep G2细胞的影响,构建了封闭Hlrg基因表达的shRNA表达载体pAVU6+27-Hlrg,将pAVU6+27-Hlrg稳定转染到过表达Hlrg蛋白的Hep G2细胞中;分别用相差倒置显微镜、FCM、SABC-FITC、RT-PCR、Western blot等观察细胞改变.测序结果表明pAVU6+27-Hlrg构建成功;针对Hlrg的RNA干扰已完成;相差倒置显微镜发现细胞突起增加;FCM显示干扰组G1期明显缩短.针对Hlrg的RNA干扰能促进过表达Hlrg蛋白的Hep G2细胞的生长.
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缺氧诱导因子-1α在结直肠癌中的表达及其与肿瘤血管生成及细胞增殖的关系
肿瘤组织缺氧是常见现象,缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)是介导肿瘤缺氧适应性反应的转录因子,目前已在多种恶性肿瘤及癌前病变中检测到HIF-1α过表达.
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p73基因在食管癌中的转录表达及其意义
目的:检测p73 mRNA在食管癌中的表达情况,探讨p73基因在食管癌发生、发展中的角色和作用机制.方法:采用逆转录多聚酶链反应技术(RT-PCR)检测37例食管鳞状细胞癌肿瘤组织、癌旁组织、区域淋巴结和相应正常食管组织中p73 mRNA的转录表达,并探明其与食管癌临床病理特征的关系.结果:37例食管肿瘤组织中有21例(51.8%)p73 mRNA过度表达,其过度表达率显著高于相应的癌旁组织、区域淋巴结和正常组织(P<0.05),但与食管癌TNM分期、细胞分化程度和病理类型均无明显关系(P>0.05). 结论:食管肿瘤组织中存在p73基因的过度转录表达,可能参与了调控食管癌的发生过程,它的存在并没有阻止食管癌的进展,在食管癌中可能没有担当起主要的抑癌作用.
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疾病严重性-诊治意识模糊-经济压力——Her2阳性乳腺癌针对性治疗需医保助力
乳腺癌是目前我国女性癌症发病率高的一种癌症,严重威胁女性的生命健康.在所有乳腺癌患者中,有20%～25%的人属于Her2基因过表达.与其它乳腺癌患者相比,Her2基因过表达型乳腺癌更容易出现复发和转移,平均生存期较短,且对一些常规治疗药物不敏感.然而,在我国现阶段,困扰此类患者的还不仅仅是疾病本身的严重性.
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过表达FGFR2重组HEK293细胞株的构建和鉴定
构建含有成纤维细胞生长因子受体蛋白2 (FGFR2)基因序列的重组慢病毒表达载体,与慢病毒包装质粒共转染包装细胞293T,获得过表达FGFR2的重组病毒颗粒;用重组病毒颗粒感染人胚肾细胞(HEK) 293细胞,并用嘌呤霉素(20 μg/ml)进行筛选,终获得过表达FGFR2的重组细胞株.蛋白质免疫印迹(Western Blot)试验结果显示,该重组细胞株与空白对照HEK293细胞相比能高表达FGFR2,实时荧光定量核苷酸扩增试验(QPCR)和酶联免疫反应(ELISA)检测结果表明FGFR2蛋白下游相关通路的uPA等分子的转录和分泌水平上调,克隆形成试验也证实重组HEK293细胞促增殖能力增强.结果表明,该重组过表达FGFR2的细胞模型可用于下一步的功能研究以及靶向FGFR2药物的筛选.
关键词： 成纤维细胞生长因子受体2 慢病毒包装 过表达 重组细胞株 -
利用MEP途径过表达提高β-胡萝卜素产量
构建上游甲基赤藓糖-4-磷酸(MEP)途径,获得两种重组质粒pET32a(+)-dxs-idi-ispDF和pTrcHis2B-dxs-idiispDF,然后与下游β-胡萝卜素合成途径的质粒pACYC 184-M-crt一起转化进入大肠杆菌中,获得相应的重组菌株.结果表明含有MEP途径的重组菌株β-胡萝卜素产量有显著提高.
关键词： 甲基赤藓糖-4-磷酸(MEP)途径 β-胡萝卜素 过表达 -
新基因mgt-16反转录病毒载体的构建及其在小鼠间充质干细胞中的表达
目的 构建表达小鼠新基因mgt-16的反转录病毒载体,并观察其在小鼠胚胎间充质干细胞C3H/10T1/2(简称10T1/2细胞)中的表达.方法 以含小鼠新基因mgt-16的DNA序列为模板PCR扩增得到mgt-16编码序列,T-A克隆后测序获得pMD18T-16质粒,与真核表达载体pEGFP-N1酶切、连接、转化,通过PCR、酶切鉴定和测序获得正确的pEGFP-N1-16载体.将pEGFP-N1-16载体中含mgt-16的片段克隆至反转录病毒载体pLEGFP-N1,通过酶切鉴定和测序获得正确的pLEGFP-N 1-16反转录病毒载体.将pLEGFP-N1-16转染反转录病毒包装细胞Phoenix,制备携带mgt-16与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的反转录病毒,感染小鼠间充质干细胞10T1/2后,400 μg/mL G418筛选获得稳定表达mgt-16与EGFP融合蛋白的10T1/2细胞克隆.荧光显微镜观察MGT-16蛋白的表达及亚细胞定位.结果 PCR扩增得到大小约300 bp的mgt-16条带,T-A克隆后测序显示获得的mgt-16序列与Genbank数据库序列相同.构建的pEGFP-N1-16载体经PCR、酶切鉴定和测序验证构建成功,构建的反转录病毒载体pLEGFP-N1-16经酶切鉴定和测序验证构建成功.荧光显微镜观察MGT-16主要在Phoenix细胞和小鼠间充质干细胞的细胞质表达,核周表达水平较高.结论 成功构建了小鼠新基因mgt-16的反转录病毒载体,并在间充质干细胞中表达,为进一步研究新基因mgt-16在间充质干细胞中的功能奠定了基础.
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小鼠水通道蛋白1基因慢病毒载体构建及其在神经膜细胞中的表达
目的 构建表达小鼠水通道蛋白1(AQP1)基因的慢病毒载体,体外感染原代培养的C57BL/6小鼠神经膜细胞,观察是否提高AQP1的表达,为进一步研究AQP1与周围神经系统损伤后水肿的关系奠定基础.方法 将小鼠AQP1基因克隆到慢病毒pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体,通过PCR和测序鉴定获得连接正确的克隆.将鉴定后的重组表达质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-AQp1与包装质粒psPAX2、pMD共转染293T细胞,制备携带AQP1基因的慢病毒lentivirus-AQP1.体外培养C57BL/6小鼠的神经膜细胞,将lentivirus-AQP1感染神经膜细胞,RT-PCR和蛋白质印迹法检测感染后神经膜细胞AQP1 mRNA和蛋白的表达情况.结果 构建的慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-AQP1经PCR鉴定和测序正确.慢病毒lentivirus-AQP1感染神经膜细胞后AQP1表达增加(P＜0.05).结论 成功构建了小鼠AQP1基因的慢病毒表达载体,该载体能有效感染神经膜细胞,使AQP1 mRNA和蛋白表达水平增高.
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CRELD1基因过表达对心脏瓣膜相关基质蛋白的影响
目的 探讨CRELD1基因过表达对心脏瓣膜相关基质蛋白的影响.方法 采用PCR技术获得CRELD1基因,利用质粒pcDNA3.1(一)构建目的基因的真核表达载体,酶切及DNA测序鉴定.利用脂质体Lipofectamine 2000介导重组质粒转染人胚肺成纤维细胞株(HFL-I)(重组质粒组),以空载体转染细胞和未转染细胞分别作为转染对照组和空白对照组.采用Real-TimePCR技术和Western blotting方法检测细胞中心脏瓣膜基质蛋白Tenascin-C和Aggrecan的mRNA和蛋白相对表达量.结果 重组质粒测序鉴定结果与GenBank数据库比对序列一致.重组质粒组HFL-I中Aggrecan的mRNA和蛋白相对表达量均显著低于转染对照组和空白对照组(P＜0.05);各组HFL-I中Tenascin-C的mRNA和蛋白相对表达量比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 CRELD1基因过表达时可以下调人胚肺成纤维细胞中心脏瓣膜基质蛋白Aggrecan的表达量,为阐明CRELD1基因在房室间隔缺损中的作用提供了一定的理论基础.
关键词： CRELD1基因 过表达 Tenascin-C Aggrecan 房室间隔缺损 -
P-糖蛋白抑制剂的研究进展
多药耐药是由于一系列没有相关性且结构及功能不同的肿瘤化疗药物的频繁临床使用而产生的,它是临床上肿瘤化疗失败的主要原因之一[1-2].多药耐药的产生机制很多,其中研究为广泛的机制就是多药耐药基因1(MDR1)基因编码,依赖于三磷酸腺苷(ATP)供能,且具有药物外排功能的P-糖蛋白的过表达[3].
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基于基因表达谱的肝细胞癌过表达基因筛选
目的 利用基因表达谱芯片技术筛选肝细胞癌(HCC)中表达上调为明显的基因.方法 利用AffymetrixU133 Plus2.0表达芯片检测93例HCC及配对癌旁肝组织的全基因表达谱.HCC与配对癌旁肝组织中基因表达的比较采用配对t检验,筛选表达上调为明显的10个基因.各基因表达与临床病理参数的关系采用x2检验.结果 与癌旁肝组织相比,HCC中表达上调倍数多的10个基因分别为:CDKN3、CCL20、PTTG1、MELK、PRMT1、TOP2A、TPX2、SMYD3、TMEM106C和UCK2,上调25.2～44.6倍(均P≤2.0×10-22).CCL20、PRMT1和UCK2基因表达与血清AFP有关,CCL20、PTTG1、PRMT1、TOP2A和UCK2基因表达与组织学Edmondson-Steiner分级有关,CCL20基因表达与TNM分期有关(均P＜0.05).结论 筛选出HCC中表达上调为明显的10个基因,将为HCC分子靶向治疗研究提供潜在靶点.
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Livin和Smac在尖锐湿疣组织中的表达
目的探讨凋亡抑制蛋白Livin和促凋亡因子Smac在尖锐湿疣组织中的表达及意义.方法 采用免疫组化SP法检测58例尖锐湿疣组织中Livin和Smac的表达.结果尖锐湿疣组织中Livin和Smac阳性表达率分别为81.03%(47,58)、77.59%(45,58),正常人对照组Livin和Smac阳性表达率分别为25.00%(5/20)、35.00%(7/20);尖锐湿疣组织中Livin和Smac阳性表达强度多为(++)～(+++),正常人对照组多在(-)～(++).两组Livin和Smac阳性表达率及表达强度差异均具有统计学意义(P<0.05).尖锐湿疣组织中Livin和Smac表达呈正相关(r=0.373,P<0.01).结论尖锐湿疣组织中存在Livin和Smac过表达,Livin和Smac的过表达可能对尖锐湿疣的发生发展有一定作用.
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HDAC8过表达慢病毒载体构建、转染及表达的研究
目的:构建大鼠组蛋白去乙酰基转移酶(histone deacetylase 8,HDAC8)基因过表达的慢病毒载体,转染大鼠骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)后观察HDAC8的表达.方法:采用DNA重组技术将HDAC8基因插入到慢病毒表达载体质粒pGC-FU中,重组获得慢病毒载体pGC-FU-HDAC8.重组慢病毒载体经过测序鉴定后,转染293T细胞生产病毒液,用得到的病毒液转染大鼠BMSCs,实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹法分析转染前后HDAC8表达情况.结果:测序结果证实HDAC8基因正确插入载体中,成功构建大鼠HDAC8基因过表达载体.大鼠BMSCs转染后HDAC8 mRNA及蛋白表达显著上调.结论:针对大鼠HDAC8基因过表达慢病毒载体构建成功,并能有效增强BMSCs中HDAC8基因的表达.
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雌激素受体α高表达慢病毒载体对根尖牙乳头干细胞成牙／成骨分化的影响
目的：雌激素受体α（ estrogen receptor α， ERα）高表达慢病毒载体感染根尖牙乳头干细胞（ stem cells from apical pa?pilla， SCAPs），探讨其在SCAPs体外成牙／成骨分化中的作用。方法 ERα高表达慢病毒载体感染SCAPs，Western blot检测ERα的表达，茜素红染色和Western blot检测其对SCAPs成牙／成骨分化的影响。结果体外实验表明，实验组（ ERα） ERα的蛋白表达水平较对照组（GFP）明显升高，实验组成牙／成骨向分化标志蛋白（碱性磷酸酶（alkaline phosphatase， ALP）、成骨细胞特异性转录因子（osterix， OSX）、牙本质涎蛋白（dentin sialoprotein， DSP）和骨钙素（osteocalcin， OCN））表达水平在3d 或7d的表达均有不同程度上调，与对照组相比具有显著性差异（ P＜0．05）。在成骨诱导条件下，实验组（ ERα）的矿化结节形成量较对照组（GFP）多，差异具有统计学意义（P＜0．05）。结论慢病毒介导的ERα高表达载体成功在体外上调了目的基因的表达，并促进根尖牙乳头干细胞的成牙／成骨分化。
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生长分化因子15基因过表达慢病毒载体的构建
目的：构建生长分化因子15（growth differentiation factor 15，GDF15）基因过表达慢病毒载体。方法根据GDF15 mRNA 的基因序列，合成GDF15基因，构建至过表达载体并转化至感受态细胞，再进行测序验证。重组慢病毒载体经过测序鉴定后，转染293T 细胞，包装生产慢病毒。用慢病毒转染293T 细胞，再用Western blot 检测GDF15的表达情况。结果测序结果证实GDF15基因正确插入载体中。慢病毒转染293T 细胞后，GDF15基因在蛋白质水平上表达显著增加。结论 GDF15基因过表达慢病毒载体构建成功，并有效增强GDF15基因在293T 细胞中的表达。
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整合蛋白β1亚基过表达上调p27抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖
目的:研究整合蛋白β1亚基过表达对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响及机制.方法:采用MTT及细胞流式测定观察整合蛋白β1亚基过表达对肝癌细胞SMMC-7721增殖及细胞周期的影响.蛋白质印迹及RT-PCR检测细胞中p27的蛋白及mRNA的表达,并构建p27的RNA干扰质粒,转染整合蛋白β1亚基过表达细胞,再观察p27的表达变化对细胞增殖的影响.结果:整合蛋白β1亚基过表达可以抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖,并将细胞阻滞在细胞周期的G1期.整合蛋白β1亚基过表达可以在蛋白水平上调p27的表达,但并不影响p27的mRNA水平.p27的RNA干扰质粒可明显抑制p27的表达,而且p27表达的下调可以阻止整合蛋白β1亚基过表达所引起的细胞增殖抑制.结论:整合蛋白β1亚基过表达通过上调p27抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖.
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调节因子X5在消化系统肿瘤中高表达
目的:观察调节因子X5(regulatory factor X5,RFX5)在消化系统肿瘤组织中的表达水平.方法:通过分析美国癌症和肿瘤基因图谱计划(the Cancer Genome Atlas,TCGA)中常见消化系统肿瘤的RNA测序数据,获得RFX5 mRNA在癌组织和癌旁组织的表达水平.利用免疫组织化学方法检测25例癌组织和配对的癌旁多肿瘤组织芯片中食管鳞状细胞癌、胃腺癌、结肠腺癌、直肠腺癌、肝细胞肝癌和胰腺腺癌的RFX5蛋白表达水平.结果:初步研究显示,上述6种消化系统肿瘤中RFX5 mRNA和蛋白水均明显高于癌旁组织,且在胃腺癌和肝细胞肝癌中的表达上调为显著.结论:RFX5 mRNA和蛋白在常见消化系统癌组织中均呈过表达.
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外源性sall4基因在胃癌HGC27细胞株中的表达及鉴定
目的:建立sall4稳定转染的HGC27细胞株,为sall4基因在胃癌发生发展中的作用研究奠定基础.方法:采用脂质体介导法将pCMV6-entry-sall4及pCMV6-entry质粒转染至HGC27细胞,48 h后加入终质量浓度600mg/L的G418抗生素进行药物加压筛选,获得阳性单克隆细胞株,通过RT-PCR和蛋白质印迹检测细胞中sall4的表达情况.结果:成功构建了稳定过表达sall4的HGC27细胞株,稳定转染细胞株中sall4的mRNA和蛋白水平明显高于未转染组及转染空载体组.结论:本实验成功筛选出sall4基因过表达的稳定转染胃癌细胞系.
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人TRB3过表达载体的构建及检测
目的:构建TRB3真核表达重组质粒,并用肝癌细胞MHCC-97H检测其表达.方法:从肝癌组织中提取并扩增TRB3基因的编码区,将其克隆到真核表达载体pcdh-CMV-MCS-GFP中,酶切并检定,将克隆成功的质粒转染至MHCC-97H细胞中,用qPCR和Western Blot检测TRB3的表达水平.结果与结论:成功扩增了TRB3的编码区,并克隆至真核表达载体中;转染后72、96 h,MHCC-97H细胞的TRB3 mRNA和蛋白表达显著增高;成功构建的TRB3过表达载体可用于后续实验.
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过表达miR-7对卵巢癌SKOV3细胞增殖及侵袭的影响
目的:探讨miRNA-7(miR-7)过表达对上皮性卵巢癌SKOV3细胞增殖及侵袭能力的影响.方法:从人类基因组中扩增出带有酶切位点的miR-7目的基因,将其连接到pIRES质粒构成重组质粒并予以鉴定.将pIRES-miR-7重组质粒及空质粒转染到SKOV3细胞,用qRT-PCR检测转染的SKOV3细胞miR-7的表达.极限稀释法筛选稳定转染的pIRES-miR-7 SKOV3及pIRES SKOV3细胞克隆.利用CCK8法测定过表达miR-7 SKOV3的增殖能力,Transwell小室法测定过表达miR-7 SKOV3的侵袭能力.结果与结论:成功构建了pIRES-miR-7重组质粒,将其转染SKOV3细胞后筛选出稳定转染pIRES-miR-7的SKOV3细胞克隆,其表达的miR-7水平显著高于pIRES SKOV3组(P＜0.01)及野生型SKOV3组(P ＜0.001),且细胞增殖及侵袭能力pIRES-miR-7 SKOV3组比pIRES SKOV3组下降.
