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北京市水产品污染与感染病例中副溶血性弧菌血清型和毒力基因型的比较研究
目的 对北京市夏季市售水产品污染与感染病例中副溶血性弧菌血清型和毒力基因型进行比较研究,为评估食品安全风险监测的目的与意义提供思路,为北京市水产品副溶血性弧菌污染与临床感染病例的关联性研究提供技术支持.方法 对采集的水产品样品和哨点医院腹泻患者粪便样本进行副溶血性弧菌的分离鉴定,采用血清玻片凝集法对分离出的副溶血性弧菌进行血清分型,PCR方法检测菌株的tlh、tdh、trh基因.结果 2014年7～9月共采集水产品样品164份,检出副溶血性弧菌80份,总污染率为48.78％;其中淡水产品污染率为38.78％(19/49),平均菌量浓度为66.63 MPN/g;海水产品污染率为53.04％ (61/115),平均菌量浓度为38.14 MPN/g.80株副溶血性弧菌分属于9个血清群,其中O2群28株,占35.00％,O1群11株,占13.75％,O5群10株,占12.50％.80株菌tlh基因均为阳性,只有1株菌携带tdh毒力基因,所有菌株trh毒力基因均为阴性.哨点医院腹泻病人粪便样本中分离鉴定副溶血性弧菌21株,血清型O3∶ K6占61.90％(13/21),O4:K8占28.57％ (6/21);毒力基因型tdh(+) /trh(-)占95.24％ (20/21),tdh(-)/trh(-)占4.76％(1/21).结论 来源于食品样品的副溶血性弧菌绝大部分不具备致病性,而导致消费者腹泻的副溶血性弧菌绝大部分携带致病性毒力基因,表明目前的食品安全风险监测结果不能作为评估副溶血弧菌导致的食源性疾病暴发和散发的依据.
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2011-2013年广州市海珠区不同来源副溶血性弧菌分离株血清分型及耐药性研究
目的 了解近年来广州市海珠区副溶血性弧菌食物中毒分离株、散发腹泻病人监测分离株、外环境分离株的血清分型及耐药现状.方法 2011-2013年61株副溶血性弧菌,包括17株食物中毒菌株、27株散发腹泻病人菌株、17株外环境监测菌株,对其进行生化鉴定、血清分型及药敏试验.结果 17株食物中毒分离菌株,共分6个血清型,O3∶K6共12株(70.6％);27株散发腹泻病人分离菌株,共分10个血清型,O3∶K6共17株(63.0％);17株外环境分离菌株,共分11个血清型,其血清型分布分散.61株菌株出现两重耐药3株,三重耐药1株.结论 广州市海珠区食物中毒、腹泻病人中主要流行的血清型是O3∶ K6,不同来源的分离株存在不同程度的抗生素耐药.
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台州市食源性沙门菌耐药性、毒力因子及分子分型研究
目的 了解台州市食品中分离的沙门菌耐药性、毒力因子以及基因分型情况,建立食源性沙门菌的分子特征本底信息,为食源性疾病的防治提供技术支撑.方法 对近几年从食品中分离的22株沙门菌进行12种抗生素药敏试验、10种毒力基因PCR检测、脉冲电场凝胶电泳(PFGE)基因分型,用BioNumerics 5.0软件对分型数据进行聚类分析.结果 22株食源性沙门菌的总耐药率为59.1％,耐药率居前三位的抗生素分别是复方新诺明(36％)、四环素(27％)、萘啶酸(27％)；所有菌株均检出6种以上毒力因子,1株肠炎沙门菌存在毒力岛、质粒及噬菌体等多种毒力因子；PFGE分型共得到21个条带,可分为5个基因型别,包括18种指纹图谱,各基因型别间同源性小于70％.结论 台州市食源性沙门菌存在致病风险,建立的指纹图谱数据库可为食源性疾病的防治提供技术支持.
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食源性沙门菌毒力岛基因分布及特征研究
目的 研究食源性沙门菌毒力岛的分布特征及其与食物中毒的关系.方法 收集市售食品、市售生鸡肉、食物中毒标本沙门菌分离株,进行血清学分型,并应用聚合酶链式反应方法检测沙门菌毒力岛(Salmonella pathogenicity island,SPI)基因SPI1 ～ SPI5,进行统计学分析.结果 152株沙门菌菌株中,检出16种血清型,以肠炎沙门菌为优势血清型,不同来源的该血清型菌株的毒力岛谱型有差异.SPI1在食物中毒菌株中检出率高,市售生鸡肉SPI1的携带率高于市售食品.结论 沙门菌的毒力岛谱型分布与菌株的不同来源相关,其中SPI1与沙门菌食物中毒呈正相关,市售生鸡肉有引起沙门菌食物中毒的潜在风险.
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TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测克罗诺杆菌MMS基因方法的建立
目的 建立克罗诺杆菌的特异、灵敏的TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测方法.方法 根据GenBank公布的克罗诺杆菌MMS基因高保守序列,设计特异引物和TaqMan-MGB探针,建立和优化反应体系,用25种其他常见致病菌评价反应体系的特异性,用克罗诺杆菌MMS基因重组质粒构建实时荧光定量PCR标准曲线,对重组质粒、纯菌和人工模拟污染样本进行灵敏度试验,并与FDA推荐的TaqMan探针实时荧光PCR比较,配对t检验分析两种方法对Ct值和荧光强度的差异.结果 采用TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测克罗诺杆菌MMS基因仅需40 min,与25种非目标菌无交叉反应,仅对克罗诺杆菌有特异性扩增;所构建方法线性关系良好,相关系数r2=0.999,扩增效率为99.972％,对重组质粒、纯菌、人工模拟污染样品标本的灵敏度分别达10拷贝/反应、3.8和38 cfu/ml;与FDA推荐的TaqMan探针实时荧光PCR相比,TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR的Ct值更小、△Rn值更高,灵敏度和分辨率差异均有统计学意义(Ct:t=-14.406,P＜0.01;△Rn:t=14.230,P ＜0.01).结论 本研究建立的TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR反应体系能够快速、特异、灵敏地检测克罗诺杆菌MMS基因,可用于婴幼儿奶粉中克罗诺杆菌的快速筛查和鉴定,具有较大的的应用价值和推广价值.
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免疫磁珠富集联合荧光定量PCR快速检测牛肉馅中产志贺毒素大肠埃希菌O26∶H11
目的 建立肉制品中免疫磁珠富集(IMS)联合实时荧光定量PCR(qPCR)技术快速检测牛肉馅中产志贺毒素大肠埃希菌(STEC) O26∶ H11的方法.方法 建立针对编码O26抗原wzx基因实时荧光定量PCR方法,并验证其特异性和敏感性;人工污染不同浓度STEC O26∶H11的牛肉馅样品,在增菌不同时间后,将增菌液原液、增菌液经免疫磁珠特异性捕获分离物分别进行qPCR检测及平板分离.结果 qPCR检测O26∶ H11可产生特异性荧光信号,而23株其他血清型的大肠埃希菌及7株其他种属细菌均未见荧光信号;本方法对纯培养的检测限为5 × 102 cfu/ml.人工染菌试验中,当初始染菌浓度达到或高于3×102 cfu/25 g时,增菌培养6h后IMS捕获物可以检测到荧光信号.培养20 h后,初始染菌浓度为3×10-1 cfu/25 g以上,对增菌液直接检测和IMS捕获物检测都可以检测到荧光信号.初始污染浓度较低时,增菌6h后IMS-qPCR的检测灵敏度高于增菌液直接qPCR检测;IMS捕获物涂布显色培养基分离目标菌检测灵敏度高于增菌液直接涂布;CHROMagar STEC显色培养基分离STECO26∶H11的检测灵敏度高于山梨醇麦康凯培养基(SMAC).结论 IMS联合qPCR检测食品中的STEC O26∶ H11具有特异性强、敏感度高、快速、易操作等特点,可以提高样品中STEC O26∶ H11菌的检出率,适用于牛肉制品中STEC O26:H11的快速检测.
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金黄色葡萄球菌分型方法的建立及应用
目的 建立食源性金黄色葡萄球菌的分型与溯源方法.方法 以血浆凝固酶为目标基因,通过PCR方法对食源性金黄色葡萄球菌进行鉴定,同时借助全自动微生物基因指纹鉴定系统(RiboPrinter)对其进行分型和类聚状况分析.结果 PCR方法可特异性鉴定金黄色葡萄球菌,RiboPrinter方法可将金黄色葡萄球菌分为6个亚型,各亚型类聚状况平均分布.结论 上述方法的建立可准确地将金黄色葡萄球菌进行鉴定和分型,分析类聚分布与同源性关系,为食源性致病菌的快速鉴定与分型溯源提供技术手段.
关键词： 金黄色葡萄球菌 血浆凝固酶 全自动微生物基因指纹鉴定系统 基因分型 食源性致病菌 -
五种食源性致病菌多重PCR的条件优化和检出限分析
目的 对沙门菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157∶H7、单核增生李斯特菌和福氏志贺菌5种食源性致病菌的多重PCR反应条件进行优化并分析方法的DNA检测限.方法 根据沙门菌的invA基因、金黄色葡萄球菌的16S rDNA基因、大肠杆菌O157∶H7的eaeA基因、单核增生李斯特菌的hlyA基因和福氏志贺菌的ipaH基因设计5对特异性引物进行多重PCR,对反应条件包括镁离子浓度、引物浓度和退火温度进行优化试验,并确定该检测方法的检出限.结果 佳反应条件为金黄色葡萄球菌、沙门菌和福氏志贺菌引物浓度为0.25μmol/L,单核增生李斯特菌引物浓度为0.4 μmol/L,大肠杆菌O157∶H7引物浓度为0.3μmol/L,Mg2浓度为2.25 mmol/L,退火温度为60℃;在此条件下金黄色葡萄球菌、肠炎沙门菌、大肠杆菌O157∶H7、单核增生李斯特菌、福氏志贺菌的多重PCR的DNA检出限分别为6.4、32、32、800和160 pg.结论 通过对5种引物的PCR条件进行优化和检出限的分析,为食品中该5种致病菌的快速检测奠定基础,对实际应用具有指导意义.
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椰毒假单胞菌酵米面亚种选择性分离培养基的比较研究
目的 比较4种椰毒假单胞酵米面亚种选择性分离培养基(马铃薯葡萄糖琼脂,PDA;改良马铃薯葡萄糖琼脂,mPDA;椰毒假单胞菌酵米面亚种分离琼脂,PCFA;银耳卵黄氯霉素琼脂,TYCA)的分离效果,为修订GB/T4789.29-2003《食品卫生微生物学检验椰毒假单胞菌酵米面亚种检验》提供技术支持.方法 接种椰毒假单胞菌酵米面亚种于4种选择性分离培养基,观察各培养基上目标菌菌落形态,计算生长率;接种10种常见致病菌和环境中常见菌于4种选择性分离培养基,进行生长特异性试验;通过直接涂布和增菌划线的加标试验,验证这4种选择性分离培养基对粪便、食品和环境土壤等不同标本/样品中椰毒假单胞菌酵米面亚种的分离检出情况.结果 mPDA和PCFA能够分别抑制8种和6种致病菌的生长,且椰毒假单胞菌酵米面亚种的生长率都高于75％;在mPDA和PCFA上,目标菌与多数杂菌形态有明显区别,而在PDA和TYCA上,形态相近不易区分;在粪便、土壤和食品等不同标本/样品的直接涂布和增菌划线分离的加标试验中,mPDA和PCFA上的检出率均超过80％,明显高于PDA和TYCA.结论 mPDA和PCFA分离效果比原标准的PDA明显提高,建议在标准修订中增加此两种选择性分离培养基.
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实时荧光定量PCR法与分离培养法检测食品从业人员沙门菌和志贺菌的比较研究
目的 比较实时荧光定量PCR法(RT-PCR)与分离培养法对食品从业人员肠道致病菌沙门菌和志贺菌的检测效果.方法 ①RT-PCR法:用实时荧光定量PCR对体检肛拭子进行初筛;②分离培养法:按照国标方法GB/T 4789.4-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》和GB/T 4789.5-2003《食品卫生微生物学检验志贺氏菌检验》对所筛选出的菌株进行鉴定.结果 RT-PCR法对食品从业人员肠道沙门菌和志贺菌的检出率明显高于分离培养法.结论 RT-PCR法相对于分离培养法在从业人员体检沙门菌和志贺菌的检测中,无论从检出率、准确度,还是检测时效性上都有着明显的优势.因此,在从业人员体检中运用RT-PCR法具有很好的实际意义.
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多重荧光定量PCR法检测海产品中副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌
目的 建立检测海产品中副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌的多重荧光定量PCR体系.方法 针对副溶血性弧菌tlh基因,沙门菌Ompc基因和单增李斯特菌hly基因设计引物和TaqMan探针,建立多重荧光定量PCR体系,进行特异性与敏感性研究;利用该体系检测海产品中的副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌.结果 副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌可得到特异性扩增,而共存于海产品中的其他细菌均未见扩增曲线.敏感性试验显示,该体系对副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌的低检测限分别为72、40、80 cfu/ml.对舟山采集的150份样品进行检测,检出32份副溶血性弧菌、11份沙门菌、5份单增李斯特菌,与国标法检测结果一致.结论 本研究建立的基于TaqMan探针的多重荧光定量PCR检测方法可以特异、灵敏、简单快速地实现对海产品中副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌的检测.
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多重PCR-变性高效液相色谱快速检测单核细胞增生李斯特菌毒力基因方法的建立
目的 建立单增李斯特菌的多个靶基因快速检测手段,提高检测的准确性.方法 根据单增李斯特菌4个毒力基因(hly、prfA、inlA、inlB)设计引物,通过优化引物浓度和引物组合,进行多重PCR扩增,产物经变性高效液相色谱(DHPLC)进行快速检测.结果 出峰顺序依次为inlB、hly、inlA、prfA,扩增片段大小为146、210、255、388 bp,此方法具有良好的特异性,灵敏度可达到280 cfu/ml.结论 本方法可以满足实际工作中食品微生物检测的要求.
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饮用水中大肠埃希菌富集和DNA提取方法优化
目的 建立一种灵敏、可靠、快速对水中大肠埃希菌富集和DNA提取的佳方法组合,以便应用TaqMan探针实时荧光PCR技术进行定量检测.方法 膜过滤洗脱环节,采用3种不同的方法进行富集洗脱,通过平板计数法比较各方法富集洗脱效果;DNA提取环节,采用4种方法进行DNA提取.所得DNA进行实时荧光PCR扩增,定量检测DNA拷贝数,比较各方法的DNA提取效率;并采用优的方法组合,对模拟水样进行膜过滤和DNA提取,考察全过程的回收率和灵敏度.结果 采用加表皮葡萄球菌过滤+漩涡混合器+玻璃棒刮擦洗脱方法(C法),洗脱效率能达到75％～93％;TritonX-100法和磁珠法的线性范围达到6个数量级稀释度(100 ～ 10-5),r2分别为0.998和0.999,然而,TritonX-100法更省时,更简便,经济性更好.采用该优的方法组合,其全过程的回收率为79.7％ ～ 104.0％且灵敏度达到1 cfu/ml.结论 C法+Triton-100法组合可以快速、准确、经济地对饮用水中大肠埃希菌进行富集和DNA提取.
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双重PCR检测生鲜猪肉中大肠杆菌O157∶H7和沙门菌方法的建立与应用
目的 建立生鲜猪肉中大肠杆菌和沙门菌的双重PCR检测方法,并初步调查生鲜猪肉中大肠杆菌和沙门菌的污染情况.方法 以大肠杆菌0157∶H7 rfbE基因和沙门菌invA基因为靶基因设计引物.通过对单个基因PCR和多重基因PCR扩增进行特异性、敏感性试验以及优化反应体系,建立快速检测大肠杆菌和沙门菌的双重PCR法.在郑州市不同地区的综合性超市、冷鲜肉专卖店和农贸市场随机抽检144份生鲜猪肉样品,分别进行了PCR检测和常规微生物学检验.结果 建立的双重PCR方法特异性好,抗干扰能力强,灵敏度可达到10 pg/μl.在144份样品中检测出大肠杆菌的样品数为10份,检出率为6.94％;检出沙门菌的样品数为13份,检出率为9.03％;大肠杆菌和沙门菌同时检出的有2份,占总样品的1.39％.结论 初步建立了同步、简便、快速、灵敏地检测生鲜猪肉中大肠杆菌、沙门菌的双重PCR方法;生鲜猪肉中存在致病菌的污染问题,将威胁到食品安全和人体健康,不容忽视.
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RapidChek SELECT检测食品中沙门菌方法的评价
目的 评价RapidChek SELECT方法对食品中沙门菌的检测效果并验证.方法 用添加并回收沙门菌标准菌株方法验证RapidChek SELECT的检测限,添加非沙门菌标准菌株方法测定其特异性,以国标法为参比,通过检测实际样品,对RapidChek SELECT方法进行验证.结果 ①RapidChek SELECT沙门菌检测试纸条的检测限为1 cfu/25 g(或1 cfu/ml);②与10种非沙门菌无交叉反应特异性;③直接检测食品中沙门菌的低浓度为106 cfu/ml;④对实际样品中沙门菌的检测结果显示,RapidChek SELECT方法和国标方法阳性率分别为87.5％(35/40)和85％(34/40),两种方法终检测结果的符合率为97.5％ (39/40),RapidChek SELECT方法等同于国标方法.结论 与国标方法相比,RapidChek SELECT沙门菌检测试剂盒灵敏度高、特异性强、操作简便,有效减少非沙门菌的干扰、省时,适用于食品中沙门菌的快速检测.
关键词： RapidChek SELECT 沙门菌 检测方法 食品 食源性致病菌 -
阪崎肠杆菌zpx基因的分子信标-实时PCR技术研究
目的 建立分子信标-实时PCR技术检测婴幼儿乳粉中阪崎肠杆菌的快速方法.方法 在PCR反应体系中加入分子信标探针,探针的5′端标记FAM,3′端标记TAMRA,建立阪崎肠杆菌zpx基因分子信标-实时PCR技术快速检测方法.结果 检测方法特异性强,无非特异性扩增；分子信标-实时PCR反应体系DNA灵敏度为180fg/PCR反应体系,纯阪崎肠杆菌菌液的检出限为102 CFU/ml,无交叉反应；以此反应体系检测23份样品,其中2份为阳性,余未检出,与传统检测方法结果一致.结论 分子信标-实时PCR检测体系快速、灵敏度高、特异性强,可用于婴幼儿乳粉中阪崎肠杆菌的快速检测.
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水产品中创伤弧菌检测方法建立与应用
目的 建立一种水产品中创伤弧菌检测方法,并对北京市市售水产品中创伤弧菌污染情况进行监测.方法 分别使用18株创伤弧菌菌株和水产品中常污染的背景杂菌,定量接种于检测创伤孤菌的选择性增菌液和4种选择性平板,优化出适合创伤弧菌检测的选择性培养基.采用聚合酶链式反应(PCR)法和增菌培养法分别检测样品中的创伤孤菌后进行方法对比,建立PCR和增菌培养法相结合的检测方法,并应用此方法研究北京市市售水产品中创伤弧菌污染状况.结果 改良后的选择性增菌液适用于创伤弧菌的检测.北京市市售水产品中创伤弧菌检出率为15.7％ (18/115),其中贝类、蟹类、鱼类和虾类样品的检出率分别为23.4％ (15/64)、8.3％ (1/12)、5.3％(1/19)和5.0％ (1/20).结论 PCR法与传统增菌培养法相结合,可有效提高创伤弧菌检测效率.北京市市售贝类等水产品中创伤弧菌污染率较高,需引起食品安全风险监测重点关注.
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食品中大肠杆菌0157∶H7的几种检测方法的比较
目的 评估平板分离培养法、免疫磁珠分离(IMS)法、VIDAS全自动酶标免疫测试系统、BAX全自动病原菌检测系统及环介导等温扩增(LAMP)技术在食品中检验肠出血型大肠埃希菌0157:H7的特异性、敏感性.方法 使用平板分离培养法、免疫磁珠分离法、VIDAS法、BAX法及LAMP法对人工制备的染菌猪肉样本进行检测,并对这几种方法进行比较.结果 BAX法和LAMP法的检出率高,分别是89.1％和85.9％,免疫磁珠法和VIDAS法检出率次之,分别是75.0％和78.1％,传统分离培养法为43.8％.结论 BAX法和LAMP法具有快速、高效、特异性好、敏感性高的特点,可快速筛选食品中可能存在的肠出血型大肠埃希菌0157∶H7.
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环介导等温扩增方法在食品中沙门菌检测的应用和评价
目的 将环介导等温扩增检测方法应用于食品中沙门菌的检验,并在检测方法特异性、灵敏度等方面与实时荧光PCR和传统检测方法进行比较.方法 针对沙门菌属高度保守的fim Y基因设计环介导等温扩增检测引物并优化反应体系,在特异性、灵敏度和实际样品检测等方面与实时荧光PCR及传统检测方法比对.结果 本研究建立的LAMP方法检测沙门菌93株和非目标菌31株,具有良好的特异性.在纯培养、无需增菌情况下,其检测灵敏度为6.4×102 cfu/ml,与实时荧光PCR方法相当.食品基质添加试验中,环介导等温扩增方法检测低限为2 cfu/25 g样品;对45份实际食品样品检测结果表明,该方法实际样品检出率为11.1％,与实时荧光PCR及传统方法检测结果一致.结论 本研究建立的沙门菌环介导等温扩增检测方法具有良好的特异性,检测灵敏度与实时荧光PCR相当,适用于沙门菌的快速筛选.
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实时荧光定量PCR法快速检测食品中大肠埃希菌
目的 应用实时荧光定量PCR技术,结合3～5h的前增菌处理,建立食品中大肠埃希菌的快速、灵敏、定量的检测方法.方法 以大肠埃希菌(ATCC 25922)为参考菌株,对培养基和培养温度进行优化,选择佳的前增菌培养条件.将不同浓度的参考菌株和样品分别接种前增菌液中培养3～5h.采用Triton-X 100提取增菌后的DNA,实时荧光定量PCR扩增大肠埃希菌特异性片段.所得Ct与对应的原始(增菌前)参考菌株的浓度,建立标准曲线,计算样品中大肠埃希菌的数量.结果 纯培养模式下,经过3、4和5h的前增菌后,标准曲线具有很好的线性,r2分别为0.996、0.992和0.991,对应的检测限为136、14和1.4 cfu/100 ml;含杂菌培养模式下,NB和EC肉汤42.0℃增菌4h后,建立的标准曲线r2分别为0.972和0.978.在不同食品中该方法的加标回收率为74.0％～174.0％.结论 3～5h的前增菌实时荧光定量PCR方法可以快速、灵敏、定量地检测食品中活的大肠埃希菌.
