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用多引物聚合酶链反应检测鼠疫耶尔森菌
目的建立多引物检测鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)的PCR(M-PCR)方法.方法合成4对引物,分别来源于质粒和染色体DNA上F1、pla、Hms、Inv基因,对164株鼠疫菌进行扩增.结果在164株鼠疫菌中,有152株菌4种基因扩增均阳性,仅云南省12株Hms基因扩增为阴性.结论采用M-PCR方法检测鼠疫菌DNA具有较好的敏感性、特异性和稳定性,其可作为检测与鉴别鼠疫菌和疫情监测方面快速诊断的方法.
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O:3和O:9小肠结肠炎耶尔森菌主要毒力基因分布调查
目的了解我国常见致病性血清型毒力基因的分布情况.方法参照国外发展成熟的聚合酶链反应(PCR)技术进行毒力基因检测.结果实验证实在我国分离到的主要流行血清型O:3和O:9小肠结肠炎耶尔森菌毒力基因分布特征为:ail+、ystA+、ystB-、yadA+、virF+占56.2%;ail+、ystA+、ystB-、yadA-、virF-占25.6%;其他型占18.2%.结论通过实验证实在我国引起感染暴发和流行的血清型O:3和O:9小肠结肠炎耶尔森菌毒力基因的分布主要为:ail+、ystA+、yadA+、ystB-、virF+型,很少部分的ail+、ystA+、ystB-、yadA-、virF-根据以前的资料被认为是毒力质粒丢失的结果,其他型很有可能是非致病的菌株.
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O157∶H7宿主动物及传染源3年监测研究
目的:探明家禽家畜的O157∶H7感染与饲养情况.方法:用细菌学与PCR等技术检测O157∶H7及其毒力基因.结果:从牛、羊、猪、鸡的粪便中检出O157∶H7及其毒力基因VT2、eaeA和hly,带菌率的高低依次为牛＞羊＞鸡＞猪,腹泻病流行前期禽畜的带菌率高于流行期;该地农村禽畜饲养密度高,户饲养数10.2只(头),人均2.4只(头),饲养方式以散养为主,散养率87.76%.结论:牛、羊、猪、鸡是该地O157∶H7的主要宿主动物和传染源,加强对其实行良好的饲养方式与粪便无害化管理及注重个人与环境卫生是防治O157∶H7引起感染性腹泻的关键.
关键词： O157∶H7大肠杆菌 毒力基因 家禽家畜 监测 -
登封市2013年小肠结肠炎耶尔森菌生物学特性研究
目的 了解登封市2013年小肠结肠炎耶尔森菌生物学特性及宿主分布特征.方法 用传统培养方法分离小肠结肠炎耶尔森菌,并进行生化鉴定、血清分型和毒力基因PCR检测.结果 2013年采集标本共1138份,分离出小肠结肠炎耶尔森菌169株,总检出率为14.85％;其中猪标本检出率高达36.55％(114/394);生物型3型占86.39％(146/169),均为O∶3血清型;毒力基因ail+、stA+、adA+、virF+占81.06％(137/169),ail+、ystA+占5.33％(9/169),ystB+占12.43％(21/169),ail-、ystA-、stB-、adA-、virF-占1.18％(2/169).结论 猪是小肠结肠炎耶尔森菌的优势宿主;小肠结肠炎耶尔森菌的血清型以O∶3型为主.
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登封市屠宰场生猪小肠结肠炎耶尔森菌病原学研究
目的 了解登封市屠宰场生猪小肠结肠炎耶尔森菌带菌率、血清分型、毒力基因分布等情况,为制定预防措施提供参考依据.方法 从屠宰场生猪扁桃体及回盲部内容物中分离小肠结肠炎耶尔森菌,并进行生化鉴定、血清分型、毒力基因PCR检测.结果 从196份生猪咽拭子中分离出107株小肠结肠炎耶尔森菌,检出率为54.59％;从196份生猪肛拭子中分离出36株小肠结肠炎耶尔森菌,检出率为18.37％.检出菌血清型为0:3,生物型为3型,I型(ail+、ys tA+、ystB、adA+、virF+)占93.71％(134/143),Ⅱ型(ail+、stA+、ystB-、yadA-、virF-)占6.29％(9/143).结论 登封市生猪小肠结肠炎耶尔森菌以致病性菌株为主,今后应加强该菌的进一步监测工作.
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交叉引物恒温扩增技术在副溶血性弧菌毒力基因检测中的应用
目的 建立一种快速检测副溶血性弧菌耐热直接溶血素(TDH)和不耐热溶血素(TLH)的CPA-核酸试纸条法.方法 根据副溶血性弧菌的TDH和TLH毒力基因序列设计特异性引物和探针,通过对反应体系进行优化,确立佳反应温度和时间,并将CPA方法与荧光定量PCR法进行比较与评价.结果 本研究建立的CPA-核酸试纸条法佳反应温度和时间为60℃40 min,对副溶血性弧菌的TDH和TLH毒力基因检测具有高度特异性,对副溶血性弧菌的TLH和TDH检出极限分别为1.8 cfu/ml和16.0 cfu/m,与荧光定量PCR法一致;而且具有较好的稳定性.464株菌株中检出副溶血性弧菌TLH和TDH基因阳性率分别为100％(464/464)和72.6％(337/464),其中,水产品中分离株TDH毒力基因阳性率为7.81％ (10/128);临床标本分离株TDH毒力基因阳性率为97.32％ (327/336).结论 该方法检测副溶血性弧菌TLH和TDH基因,具有检测时间短、扩增效率高、灵敏度高、特异性强以及操作简便等特点,可用于副溶血性弧菌的现场快速检测.
关键词： 副溶血性弧菌 交叉引物恒温扩增技术 毒力基因 -
致肾盂肾炎大肠杆菌对人肾盂上皮原代细胞黏附的实验研究
目的 建立人肾盂上皮原代细胞的培养方法,用于致肾盂肾炎大肠杆菌(UPEC)黏附作用的研究.方法 利用复合PCR方法检测UPEC 132菌株毒力基因hly和cnf1.采集人肾脏手术标本,利用组织块法取肾盂正常上皮组织,使用添加EGF及BPE的角朊细胞无血清培养基(K-SFM)进行原代细胞培养,经HE染色和免疫细胞化学染色进行鉴定.鉴定符合要求的人肾盂上皮原代细胞用于UPEC黏附试验,分别于不同作用时间观察黏附后细胞形态学变化,并计算黏附率和黏附指数.结果 此研究制备的人肾盂上皮原代细胞具备移行上皮细胞特征.带有毒力基因hly和cnf1的UPEC132菌株作用于人肾盂上皮原代细胞,15 min后细菌开始黏附,120 min达到高峰,黏附率为74.4%,黏附指数为34.0.显微镜下观察细胞形变、着色不均,胞浆和胞核都有改变.结论 人肾盂上皮原代细胞可用于UPEC的黏附试验,为其致病机理的深入研究奠定基础.
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河南睢县3岁以下儿童携带屎肠球菌耐药性及多位点序列分型研究
目的：了解河南睢县3岁以下儿童携带屎肠球菌耐药性和携带毒力基因情况,并对分离菌株进行多位点序列分型研究。方法应用K-B纸片法检测屎肠球菌对15种常见抗生素的耐药性；PCR方法检测屎肠球菌携带毒力基因的情况；多位点序列分型( multilocus sequence typing, MLST)方法对分离菌株进行分型。结果从120份河南睢县3岁以下儿童粪便标本中分离到47株屎肠球菌。在47株屎肠球菌中耐药菌株的比例为95.7%,分离菌株对大环内酯类、四环素以及利福平等多种抗生素广泛耐药,对临床常用于屎肠球菌感染治疗的β-内酰胺类以及氨基糖苷类抗生素耐药率亦高。未检测到对万古霉素、利奈唑胺、氯霉素和呋喃妥因耐药的菌株。3种以上抗生素耐药菌株都属于一个克隆群,其中包括12株携带透明质酸酶( hyalronidase,hyl)毒力基因的克隆复合群17(clonal complex 17, CC17)屎肠球菌。结论河南睢县3岁以下儿童携带屎肠球菌对多种抗生素广泛耐药,耐药菌株中存在携带毒力基因的CC17克隆群的菌株。
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82株副溶血性弧菌毒力基因及耐药性分析
目的 了解2015—2016年南通市副溶血性弧菌分离株毒力基因携带与耐药性情况,为防治副溶血性弧菌病及指导临床合理用药提供基础数据.方法 利用荧光定量PCR技术,对副溶血性弧菌进行不耐热溶血素基因(tlh)、耐热直接溶血素基因(tdh)和耐热相关溶血素基因(trh)毒力基因检测.采用微量肉汤稀释法,测定其对15种抗生素的耐药性.结果 82株副溶血性弧菌,tlh均为阳性,阳性率为100.0%(82/82);tdh阳性72株,阳性率为87.8%(72/82);全部菌株trh基因阴性.82株副溶血性弧菌,对氨苄西林、头孢唑啉、四环素、氯霉素的耐药率均为1.2%(1/82),对甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲噁唑的耐药率为2.4%(2/82),对另外10种抗生素敏感或中介.结论 2015—2016年南通市副溶血性弧菌分离株主要携带毒力基因tlh、tdh,不携带trh基因.除氨苄西林、头孢唑啉、四环素、氯霉素、甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲噁唑这5类抗生素外,其余10类抗生素在副溶血性弧菌感染的治疗中都有效,可作为首选抗生素.
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血液分离肠球菌毒力基因检测及生物膜形成测定
目的：检测肠球菌的主要毒力基因，并测定其生物膜形成情况。方法收集血液来源标本中的粪肠球菌28株，屎肠球菌54株，采用多重PCR检测肠球菌的5种主要毒力基因：asa1、esp、hyl、cylA及gelE；利用微孔板法检测生物膜的形成。结果粪肠球菌中asa1、esp、cylA、gelE的同时检出率为50％，且28株菌均检测到了至少一种毒力基因，仅在粪肠球菌中检测到了asa1、cylA和gelE基因；屎肠球菌对esp的检出率分别为50％，hyl和esp的同时检出率为22．2％，hyl基因仅在屎肠球菌中存在，18．5％的屎肠球菌没有检测到5种毒力基因中的任何一种。粪肠球菌和屎肠球菌形成生物膜阳性菌株的比率分别为85．7％和63．0％。结论致血液感染粪肠球菌在主要毒力基因的种类、毒力基因检出率及生物膜形成阳性菌株数均高于屎肠球菌。
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金黄色葡萄球菌毒力基因检测及分子分型研究
目的：研究湖北省黄州区人民医院于2011—2013年分离的488株金黄色葡萄球菌的分子生物学特征及毒力基因分布情况。方法采用琼脂稀释法测定苯唑西林和头孢西丁对金黄色葡萄球菌的小抑菌浓度（ minimum inhibitory concentration ，MIC）， PCR方法进行SCCmec分型（ staphy-lococcal cassette chromosome mec）和多位点序列分析（multilocus-sequence typing， MLST），多重PCR方法检测31个常见的毒力基因。结果488株金黄色葡萄球菌中共检出耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）227株，检出率为46．5％，227株MRSA 中 SCCmecⅢ型居多，占81．5％；其次为Ⅳ型，占10．1％。 MRSA菌株中，主要的克隆型为CC（clonal complex）8，占81．1％，其次为CC59和CC5，分别占4．8％和3．1％，261株甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）中，主要克隆型为CC1，占34．1％，其次为CC398、CC121和CC59，分别占21．8％、14．9％和13．0％。109株MSSA（48．2％）同时携带≥15个毒力基因，明显高于MRSA菌株（28．2％，P＝0．002），肠毒素基因（sed、sej和ser）的分布与CC8和CC5密切相关，表皮剥脱素基因（ eta， etb）和lukED基因仅在CC1中检测到，与其他CCs相比，CC1和CC59克隆中pvl基因检出率更高（P＜0．05）。结论本地区MRSA的流行率为46．5％，与全国平均水平基本一致，MRSA菌株主要流行克隆为ST239-MRSA-SCCmecⅢ型，占79．3％，医疗卫生部门应采取有效措施控制MRSA的传播。 MSSA菌株毒力基因检出率明显高于MRSA，并且不同的CCs克隆呈现不同的毒力基因谱，表明毒力基因的携带与遗传背景有关。
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浙江地区幽门螺杆菌cagA基因3'区多态性研究
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)的重要毒力基因cagA具有高度保守的5'区和可变的3'区,3'区中重复序列类型和数量的差异造成了cagA基因产物(CagA蛋白)在分子大小上的不同.cagA基因/CagA蛋白的结构差异可能终影响Hp感染的临床结局.
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嗜肺军团菌生物膜的形成与毒力基因表达量分析
目的 初步探讨生物膜相关军团菌独特的毒力基因表达特征.方法 在富营养条件下建立静止状态的单细胞嗜肺军团菌生物膜模型.运用反转录real-time PCR技术,比较和分析浮游和生物膜状态下嗜肺军团菌部分毒力基因的表达,毒力基因包括mip、flaA和fliA基因.结果 对数生长后期与对数生长期浮游菌的mip、flaA和fliA基因表达量比值分别为0.53、4.45、3.67,对数生长期浮游菌显示复制态军团菌的毒力基凶表达特征,对数生长后期表达转移态军团菌特点.生物膜相关军团菌与对数生长期浮游菌的mip、flaA和fliA基因表达量比值为4.42、5.24、16.21;与对数生长后期浮游菌的比值为8.39、1.18、4.43,生物膜相关军团菌同时表达复制态和转移态军团菌毒力基因特征.结论 生物膜相关军团菌毒力基因的表达具有其特殊性,有待进一步研究.
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甘磷酸胆碱对霍乱弧菌转录调控因子 AphB 活性的影响
霍乱(Cholera)是一种急性、烈性的腹泻性疾病,霍乱弧菌(Vibrio cholerae)为该病的病原体。霍乱弧菌对毒力基因进行调控依赖于复杂的调控系统[1],ToxR 是该系统中重要的调控因子,系统中还需要重要的膜蛋白 TcpP 的参与。研究表明,tcpP 的表达受 AphB 蛋白的影响[2],该蛋白也可结合ToxR 的启动子区[3],进而调控毒力基因的表达。 AphB 同时作用于多个关键因子[4],可见其在调控系统中发挥着重要作用。 AphB 属于 LysR 家族转录调控因子,该家族蛋白与辅助诱导物结合后构象发生变化,变化后的蛋白调控能力更强。有研究者推测[5],AphB 的调控作用可能需要与辅助诱导物结合,但目前为止还没有关于上述辅助诱导物的相关报道。本研究拟用化合物甘磷酸胆碱(L-A-glycerophosphorylcholine, GPC)来研究其对转录调控因子 AphB 活性的影响。
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耐万古霉素肠球菌耐药基因及毒力因子研究
目的 研究耐万古霉素肠球菌(VRE) van基因及肠球菌毒力基因esp、hyl、cylA、gelE 的携带情况,分析其对抗菌药物的耐药特性和流行特性,为临床抗菌药物的选择和感染控制提供依据.方法 采用含有6 μg/ml万古霉素的琼脂筛选平板(ADSP)筛选VRE菌株,VITEK-60全自动微生物分析仪检测常用抗菌药物的敏感性；运用PCR方法检测万古霉素耐药基因vanA、vanB、vanC1/C2、vanM和其携带的毒力基因esp、hyl、cylA、gelE；并对VRE菌株进行多位点序列分型(MLST).结果 360株肠球菌中共筛出VRE菌株7株,均为屎肠球菌；7株VRE对万古霉素均为高水平耐药,部分菌株对替考拉宁中介和敏感.所有VRE菌株均携带vanA基因,vanB、vanC1/ C2、vanM均为阴性；毒力因子esp均为阳性,其中一株菌株同时携带4种毒力因子.7株VRE的ST型呈散在分布.结论 本研究发现基因型为vanA型而表型为vanB型的VRE菌株；VRE菌株常对多种抗菌药物耐药且毒力因子携带率高；利奈唑胺可作为治疗VRE菌株的推荐药物.
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2013—2016年广东省腹泻患者致泻性大肠埃希菌病原学监测
目的 了解广东省腹泻患者致泻性大肠埃希菌(DEC)的感染状况及菌株的血清型分布、药物敏感性和分子特征.方法 采集粪便标本进行传统分离培养,对疑似菌株进行多重PCR毒力基因鉴定和生化鉴定,获得阳性菌株进行血清学分型、药物敏感试验和脉冲场凝胶电泳(PFGE).结果 腹泻患者中DEC的总阳性率为6.26%,肠致病性大肠埃希菌(EPEC)、肠产毒性大肠埃希菌(ETEC)、肠出血性大肠埃希菌(EHEC)、肠集聚性大肠埃希菌(EAEC)和肠侵袭性大肠埃希菌(EIEC)的阳性率分别为2. 47% 、1. 54% 、 1. 32% 、0. 62%和0. 09% ,以0~<7岁的儿童感染为主.血清分型率为52. 54% ,EHEC分子血清分型率为15. 00% . DEC对亚胺培南、环丙沙星、头孢他啶和头孢噻肟的敏感率较高. DEC多重耐药率为58. 45% ,EPEC多重耐药现象严重.广东省腹泻患者ETEC、EHEC、EPEC和EAEC的PFGE图谱呈现高度多态性.结论 EPEC是广东地区DEC流行的优势型别,首选三代头孢菌素为儿童感染治疗用药,成人还可选用环丙沙星. DEC多重耐药现象严重,应加强DEC的病原学监测和耐药性监测.
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幽门螺杆菌毒力基因cagA、vacA与胃十二指肠疾病的关系
国际上已有很多国家对本国幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)分离株的vacA基因进行了研究和分析。Atherton等曾提出Hp vacA基因镶嵌型模型，将信号序列分为三型，中间序列分为两型〔1〕，但来自欧洲和日本的报告显示不同地区Hp分离株具有较高多态性，具有地区、人群相关性特点。然而，目前国内尚未见这方面的研究报告。为了解我国Hp临床分离株vacA基因型特点以及不同vacA基因同胃、十二指肠疾病的关系以及cagA基因同Hp毒力的关系，本实验进行了以下研究。
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伤寒杆菌耐药质粒pRST98毒力基因的研究
目的研究多重耐药伤寒沙门菌耐药质粒pRST98是否具有沙门菌属其他致病菌毒力质粒上的保守基因spv. 方法用QIAGEN试剂盒提取pRST98,精确定量后选用8种限制性核酸内切酶消化,建立该质粒的酶切图谱.用spv特异引物的PCR扩增和spv探针Southern blot法分析pRST98的基因构成. 结果 pRST98酶切图谱显示BglⅡ、PstⅠ和SacⅡ作用后片段均一,是对该质粒进行分子生物学和分子流行病学研究的理想工具.PCR和Southern blot结果显示,伤寒杆菌耐药质粒pRST98上存在其他沙门菌毒力质粒上高度保守基因spv的同源序列. 结论从基因水平首次证实伤寒杆菌耐药质粒pRST98具有多效性,是既编码抗药性又编码细菌毒力的"嵌合型"质粒.
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临床分离肺炎链球菌的毒力基因及血清型分析
目的 了解肺炎链球菌的5种常见毒力基因(psaA、pspA、nanA、ply、lytA)在临床分离株中的分布情况.方法 以2006-2008年从临床分离133株肺炎链球菌为研究对象,采用PCR法对5种常见的毒力基因进行检测.结果 lytA、psaA、nanA、pspA、ply这5种基因在133株菌中的检测阳性率分别为94.7%、85.0%、84.2%、60.2%、82.7%;5种毒力基因在87株常见血清型菌中的阳性率分别为100%、87.4%、89.7%、67.8%、86.2%.结论 5种毒力基因在本地区肺炎链球菌中的阳性检测率均较高,在常见血清型菌株中的阳性检测率较其他血清型高.这5种基因是肺炎链球菌致病的主要毒力基因,可能作为新刑肺炎蛋白疫苗的候选基因.
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esp和hyl基因在不同来源屎肠球菌菌株中的分布及与万古霉素耐药性的相关性研究
目的 检测屎肠球菌(Enterococcus,faecium,Efm)可能的毒力基因esp和hyl在不同来源的临床分离屎肠球菌中的分布,探讨这两个基因与屎肠球菌致病性关系,以及万古霉素耐药性是否与其致病性有关.方法 采用菌落杂交法检测364株不同PFGE型的屎肠球菌中esp、hyl、vanA和vanB基因的分布,同时采用NCCLS的微量稀释法测定这些细菌对万古霉素和替考拉林的MIC.结果 临床分离菌株中esp(Efm)和hyl(Efm)的阳性率(59.5％和32.8％)明显高于非临床分离菌株(14.4％和5.3％);非临床分离屎肠球菌中esp和,hyl阳性的菌株,除了来自屎肠球菌感染患者粪便之外,其余绝大多数均为阴性.临床分离菌株中耐万古霉素菌株(VRE)esp的阳性率(64.8％)明显高于万古霉素敏感菌株(VSE,42.9％),且以manA为明显(72.7％),hyl基因在临床分离菌株中的分布与万古霉素耐药性无关.绝大多数hyl基因阳性菌株(94％)esp亦呈阳性.结论 esp和hyl基因主要出现于临床感染的屎肠球菌,可能与其致病性有关.esp基因与万古霉素耐药性密切相关;hyl基因则仅与vanA型耐药有相关性.
