HPLC法同时测定甘草及甘草头中4种成分含量

目的：建立HPLC法同时测定甘草饮片及甘草头中甘草苷、异甘草苷、甘草素和甘草酸的含量。方法：采用 Diamonsil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm），0.1%磷酸水-乙腈梯度洗脱，流速1.0 mL· min-1，检测波长为276 nm（0~18 min）、360 nm（18~24 min）、276 nm（24~30 min）、250 nm（30~65 min），柱温30益。结果：在该色谱条件下，甘草苷、异甘草苷、甘草素、甘草酸的进样量分别在0.1085~1.085、0.0168~0.168、0.00494~0.0494、0.407~4.07μg范围内线性关系良好。加样回收率均在96.61%~100.89%，RSD值均小于0.81%。5个不同批次的甘草饮片中4种成分的含量分别为0.513%、0.0729%、0.0484%、1.945%；2个批次甘草头中4种成分含量分别为0.456%、0.0636%、0.0362%、1.630%。结论：4种成分的响应与浓度之间呈良好的线性关系；甘草头中4种成分的含量与甘草饮片基本相当，可作为活性成分提取的原料加以利用。

X射线辐照处理对甘草三萜类及黄酮类有效成分含量的影响

目的:探讨X射线辐照处理对乌拉尔甘草中三萜类及黄酮类有效成分含量的影响,提高栽培甘草的突变率,为甘草的分子育种奠定基础.方法:分别采用不同辐射剂量的X射线对甘草种子进行辐照处理,栽培1年后采收.采用HPLC测定甘草样品中2种三萜类成分(甘草酸、异甘草酸)及4种黄酮类成分(甘草苷、异甘草苷、甘草素及异甘草素)的含量,计算各成分产量,应用非参数检验进行统计学分析.结果:X射线辐照样品中三萜类和黄酮类有效成分的含量及产量均高于空白组.各有效成分产量随辐射剂量增加而呈先上升后下降再上升趋势.当辐射剂量为5 Gy时,各化合物的产量与空白组相比显著提高;当辐射剂量增加至10 Gy时,各化合物产量有所下降;当辐射剂量增加至20 Gy时,化合物产量再次明显提高,并在辐射剂量为50 Gy时达到大值.结论:X射线辐照处理能增加甘草生物量及其有效物质的含量和产量,其机制可能是X射线引起甘草基因突变,从而引起代谢物的变化.

HPLC法测定乐肝清炎胶囊中栀子苷、甘草素的含量

目的:研究以HPLC法同时测定乐肝清炎胶囊中栀子苷、甘草素含量的方法.方法:采用Kromasil C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),以甲醇-0.5%冰乙酸为流动相,梯度洗脱,体积流量:1.0 mL·min-1,λ1=238 nm(检栀子苷),λ2=276 nm(检甘草素),柱温30℃.结果:栀子苷在(54.1～162.4)μg·mL-1与峰面积呈良好的线性关系,r=0.9998,甘草素在(5.2～15.5)μg·mL-1与峰面积呈良好的线性关系,r=0.9999.平均加样回收率(n=9):栀子苷为99.66%;甘草素为99.90%.结论:本法操作简便,结果可靠,重现性好,可作为该产品质量控制的方法.

单因素配伍剂量对大黄甘草汤药效组分的影响

目的:研究大黄甘草汤中配伍饮片生大黄或生甘草剂量改变对该复方药效组分的影响,为该复方的临床合理应用和中药药效组分质量评价体系建立提供参考.方法:采用HPLC-DAD同时测定不同配伍的大黄甘草汤中通便止呕的药效组分芦荟大黄素-甘草酸-大黄酸-大黄素-大黄酚-大黄素甲醚(波长254 nm),甘草苷-甘草素(波长276 nm),番泻苷B-番泻苷A-异甘草苷-异甘草素(波长360 nm)的含量.结果:大黄甘草汤中生大黄(或生甘草)配伍剂量增加时,生甘草(或生大黄)药效组分均逐渐降低.当大黄与甘草配伍剂量为经方比例12 g/3 g时,甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素和甘草酸的质量分数依次为(1 258.03±35.52),(115.26±7.88),(246.09±4.02),(15.41±0.20),(1 823.44±23.44)μg·g-1;番泻苷B,番泻苷A,芦荟大黄素,大黄酸,大黄素,大黄酚和大黄素甲醚质量分数依次为(124.51±0.60),(189.91±7.04),(214.03±6.08),(1 110.60±24.36),(193.83±0.95),(133.21±3.28),(51.26±1.00) μg·g-1.结论:配伍剂量改变时,大黄甘草汤药效组分的溶出量与经方比较均具有显著性差异,说明其功效随配伍剂量的不同而变化.生大黄(生甘草)的配伍剂量改变对甘草(大黄)、其自身及大黄甘草汤药效组分总量均有显著影响.生甘草配伍剂量对大黄甘草汤药效组分的影响强于生大黄.

怀牛膝“性善下行”对通塞脉微丸中绿原酸、异甘草苷、哈巴俄苷和甘草素体内药代动力学影响研究

为了探索怀牛膝对通塞脉微丸中主要活性成分绿原酸、异甘草苷、哈巴俄苷和甘草素在大鼠体内的药动学参数的影响,该研究建立了UPLC-MS/MS同时测定大鼠血浆中绿原酸、异甘草苷、哈巴俄苷和甘草素4种成分的分析方法,色谱柱为BEHC18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);流动相为乙腈-0.1％甲酸水梯度洗脱,流速为0.3 mL·min-1,采用电喷雾电离源(ESI),多反应离子监测(MRM)扫描方式.结果显示,通塞脉微丸组4种成分的Cmax和AUC0-∞均比通塞脉微丸加牛膝组高,其中绿原酸的Cmax差异显著(P＜0.05),绿原酸和甘草素的AUC0-∞差异显著(P＜0.05);2组间Tmax和CL均无显著性差异.该研究建立的UPLC-MS/MS方法特异、快速、准确和灵敏,可用于通塞脉微丸中4种主要活性成分在大鼠体内的药代动力学研究;同时表明怀牛膝对通塞脉微丸中4种主要活性成分在大鼠体内药代动力学行为有不同程度的影响.

088 甘草根中的活性成分甘草素能抑制SARS相关冠状病毒的复制

HPCE法测定甘草中甘草素的含量

目的研究HPCE法测定甘草中甘草素的含量.方法采用未涂层弹性石英毛细管柱(75μm×50cm,有效长度42.5cm),以40mmol/L四氢硼钠-10%甲醇(pH)为运行缓冲液;运行电压:20kV;毛细管温度:25℃;二极管阵列检测器,测定波长λs=320nm,λR=380nm.结果以葛根素为内标,甘草素在0.6125～0.9800mg/L范围内有良好的线性关系,r=0.9999;平均加样回收率:98.72%,RSD为2.43%(n=6).结论该方法操作简便,结果可靠,回收率及重现性好,可作为甘草质量控制的方法.

牛瘤胃耐氧细菌菌株Aeroto-Niu-O16对中药甘草主要活性成分甘草素的开环转化

菌株Aeroto-Niu-O16是经耐氧驯化后能在有氧条件下将大豆异黄酮黄豆苷元和染料木素分别加氢还原为二氢黄豆苷元和二氢染料木素的耐氧细菌菌株.通过本研究发现,该菌株在有空气氧条件下能将中药甘草主要活性成分甘草素(liquiritigenin)进行开环转化.中药甘草的乙醇粗提物直接酸水解即得底物甘草素.根据产物的大紫外吸收图谱、质谱以及核磁共振氢谱和碳谱等测定结果,将菌株转化甘草素所生成的产物鉴定为达维荚蒾苷元(davidigenin).菌株Aeroto-Niu-O16对底物甘草素的大转化浓度为0.8 mmol·L-1,平均转化率为71.7％；当向培养基中添加0.1％(m/v)的L-半胱氨酸或硫代硫酸钠时,底物甘草素的平均转化率可由原来的71.7％分别提高到78.3％和77.2％.检测浓度在0.2 mmol·L-1到1.6 mmol·L-1范围内,相同浓度下的产物达维荚蒾苷元对二苯代苦味酰基自由基(DPPH)的体外清除能力均显著或极显著高于底物甘草素.利用微生物生物转化法将甘草素转化为具有更高更广生理活性的达维荚蒾苷元尚属国内外首次报道.

甘草素注射液制备工艺研究

目的 优选甘草素注射液的制备工艺.方法 通过单因素考察确定制剂的溶剂、辅料用量、pH、热原去除方法、灭菌工艺等,筛选出优工艺条件.结果 佳工艺条件为甘草素溶于pH 4.0～6.0,含量为40％的丙二醇溶液中,采用超滤法除去细菌内毒素,灭菌条件为121℃(97 kPa),灭菌15 min.结论 甘草素注射液制备工艺条件合理,利于生产操作,可用于工业化生产.

高效液相色谱法同时测定龙柴方及其组成药甘草中甘草苷等5种指标成分的含量

目的 建立HPLC测定龙柴方及其组方药材甘草中5种指标成分含量的方法,控制该方药的质量.方法 ODS C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相为乙腈和0.05％的磷酸水溶液,梯度洗脱；柱温为30℃;流速1 mL·min-1；检测波长237 nm.结果此方法可以使样品达到基线分离,阴性样品无干扰,甘草苷、异甘草苷、甘草素、甘草酸和异甘草素分别在0.156 8 ～1.568 μg(r =0.999 7)、0.157 1 ～1.571 μg(r =0.999 8)、0.155 8 ～1.558 μg(r =0.999 6)、0.187 1～1.871 μg(r=0.996 9)和0.158 1 ～1.581 μg(r =0.999 5)内与各自峰面积积分值呈良好的线性关系；平均回收率分别为101.47％(RSD=1.272％)、101.09％(RSD=1.937％)、101.14％(RSD=2.388％)、100.38％(RSD=1.448％)及100.86％(RSD=1.759％)(n=5).结论 该方法分离良好、精密准确,可用于龙柴方及其组方药材甘草的质量控制.

四逆散不同配伍对甘草素和异甘草素煎出量的影响

目的 研究四逆散不同药味组合与甘草素和异甘草素煎出量之间的关系.方法 采用RP-HPLC法测定四逆散不同配伍中甘草素和异甘草素的煎出量,并对结果进行统计分析.结果 全方组甘草素和异甘草素的煎出量较高,而甘柴组中两者的煎出量较低(P＜0.05).结论 四逆散不同药味配伍的甘草素和异甘草素溶出具有显著性差异.

甘草素对B16F10黑色素瘤细胞侵袭转移的抑制作用及其机制探讨

目的 研究甘草素(liquirigenin,LQ)对黑色素瘤B16F10侵袭转移的抑制作用及分子机制.方法 采用四甲基氮唑兰MTT比色法检测甘草素对B16F10细胞存活力的影响;划痕实验检测甘草素对细胞迁移的影响;Transwell小室实验检测细胞侵袭能力;蛋白质印迹法分析甘草素对侵袭转移相关蛋白和信号通路的影响.结果 在无毒剂量下,甘草素能明显抑制B16F10细胞的侵袭转移能力,并且随着浓度增加,其细胞的迁移和侵袭逐渐减弱;甘草素能通过抑制PI3K /AKT信号通路,下调基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9蛋白表达.结论 甘草素可能通过阻碍PI3K/PTEN/AKT信号通路传导,下调MMP-2和MMP-9的表达,从而抑制黑色素瘤B16F10细胞的侵袭转移.

UPLC-Q-TOF/MS法鉴定大鼠体内甘草素的代谢产物

[目的]研究甘草素在大鼠体内的代谢产物。[方法]采用静脉注射（iv）、灌胃（ig）两种给药方式，剂量20 mg/kg，收集大鼠血浆、尿液、粪便、胆汁，应用UPLC-Q-TOF/MS法鉴定甘草素的代谢产物。[结果]血浆、尿液、粪便、胆汁样品中共鉴定15种代谢产物，主要有异甘草素、(异)甘草素葡萄糖醛酸结合物和硫酸结合物、二氢异甘草素、二氢异甘草素硫酸结合物、异甘草素甲基化及甘草素脱氢的代谢产物；其主要代谢途径为异构化、葡萄糖醛酸化、硫酸化、甲基化、脱氢反应。[结论]构建的UPLC-Q-TOF/MS法可用于大鼠体内甘草素代谢产物的研究。

萎软紫菀化学成分的研究

目的 对萎软紫菀Aster flaccidus全草的化学成分进行分离研究.方法 采用正、反相硅胶柱进行分离纯化,用物理化学和光谱学方法鉴定化合物的结构.结果 从紫菀属植物萎软紫菀全草中分离鉴定出14个化合物,分别为2-oxo-isocostic acid(1)、单萜环烯醚苷(2)、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷(3)、1β,6α-二羟基桉烷-4(15)-烯(4)、6β-丙酸基-1,10-脱氢呋喃艾里莫芬型烷(5)、印乌头碱(6)、羽扇豆醇(7)、甘草素(8)、黄芹素(9)、苜蓿素(10)、松柏醛(11)、木栓酮(12)、芹菜素(13)、对羟基苯甲酸(14).结论 其中化合物2～7为该属植物中首次分离得到,化合物1～10、13为该植物中首次分离得到.

甘草素在体外不同种属肝微粒体中的代谢差异研究

目的 对甘草苷的苷元甘草素在体外不同种属肝微粒体中的代谢差异进行比较研究,为甘草苷的进一步研究开发提供参考依据.方法 甘草素与不同种属,包括大鼠、小鼠、入、犬及猴的肝微粒体进行孵育,比较其代谢稳定性和代谢转化情况.代谢稳定性通过底物消除法分析甘草素的剩余底物浓度水平随时间的变化,计算体外消除半衰期(t1/2).进一步对甘草素在肝微粒体孵育后生成的代谢产物谱以及代谢途径进行分析.结果 在Ⅰ相肝微粒体孵育体系中,甘草素在5个种属肝微粒体中发生代谢的f1/2依次为大鼠＜小鼠＜人＜猴＜犬;在Ⅱ相肝微粒体孵育体系中,甘草素代谢都非常快,除小鼠外,均在5min内下降50％以上.甘草素与人肝微粒体进行Ⅱ相孵育产生的代谢产物谱和猴的相同,其余种属则与人有明显不同.结论 甘草素在猴肝微粒体中的代谢稳定性和代谢产物谱均与人相似,其次为犬肝微粒体,大鼠和小鼠则与人存在明显差异.在进一步的临床前药代和毒理研究中可选用猴或犬作为模型动物.

甘草黄酮类成分对Caco-2细胞P-糖蛋白功能和表达的影响

目的 研究甘草黄酮类成分对Caco-2细胞P-糖蛋白(P-gp)功能和表达的影响,探讨甘草解毒的作用机制.方法 采用流式细胞仪检测经甘草黄酮类成分处理后Caco-2细胞对罗丹明123摄取量的影响,以评价P-gp的外排功能;采用Westernblotting法检测甘草黄酮类成分对Caco-2细胞P-gp表达的影响.结果 与对照组相比,甘草总黄酮5、10、50、100 μg/mL作用Caco-2细胞1h后,使细胞内罗丹明123的荧光强度分别减少61.1％、56.3％、49.2％、45.4％；甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素、芹糖基甘草苷、芹糖基异甘草苷在相同质量浓度,使细胞内罗丹明123的荧光强度减少了19.3％～37.9％.与对照组相比,甘草总黄酮10～400 μg/mL给药后72 h,使Caco-2细胞膜上P-gp的表达显著增加(P＜0.01)；甘草苷、异甘草苷、甘草素、芹糖基甘草苷5～400 μmol/L,异甘草素、芹糖基异甘草苷10～400 μmol/L对此也有显著作用(P＜0.01).结论 甘草黄酮类成分增强Caco-2细胞P-gp的功能,上调P-gp的表达,促进细胞内有毒物质的外排,减少有毒物质在肠道的吸收,这可能是甘草配伍其他中药的解毒机制之一.

UPLC-MS/MS法同时测定通塞脉微丸中10种有效成分

目的 建立同时测定通塞脉微丸中10种有效成分(绿原酸、芹糖甘草苷、毛蕊异黄酮苷、木犀草苷、甘草苷、阿魏酸、异甘草苷、哈巴俄苷、甘草素和肉桂酸)的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)分析方法.方法 采用BEHC18(100 mm×2.1 mm,1.7μm)色谱柱,流动相为乙腈-0.1％甲酸水溶液,梯度洗脱,体积流量为0.3 mL/min,采用电喷雾电离源(ESI),多反应离子监测(MRM)扫描方式进行检测.结果 10种成分线性关系分别为绿原酸Y=294.09 X+ 17 624:芹糖甘草苷Y=19.296X+748.42;毛蕊异黄酮苷Y=670.8 X+ 11 121;木犀草苷Y=490.45 X+2 938.3;甘草苷Y=33.489X+555;阿魏酸Y=127.76 X+1 343.5;异甘草苷Y=57.87 X+804.81;哈巴俄苷Y=13.125 X-20.365;甘草素Y=29.057X+367.71;肉桂酸Y=72.867 X+1 301.5,且各相关系数(r)均大于0.999 0.精密度、重复性和稳定性良好;加样回收率在96.00％～104.67％,RSD值均小于3％.结论 所建立的方法准确、快捷,重复性好,可用于通塞脉微丸中绿原酸、芹糖甘草苷、毛蕊异黄酮苷、木犀草苷、甘草苷、阿魏酸、异甘草苷、哈巴俄苷、甘草素和肉桂酸10种有效成分的同时测定.

防己黄芪汤HPLC-UV/ELSD指纹图谱研究

目的 建立防己黄芪汤(FHD) HPLC-UV/ELSD指纹图谱分析方法,归属和指认复方中主要特征峰.方法 采用HPLC法,色谱柱为Venusil MP C18 (250 mm×4.6 mm,5μm);流动相为乙腈-0.1％甲酸水溶液(梯度洗脱),紫外检测器:检测波长为254 nm,蒸发光散射检测器:漂移管温度为110℃,空气体积流量为3 L/min;进样量10 μL;体积流量为1 mL/min.运用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2008版)》对10批FHD指纹图谱进行相似度计算,并对共有峰进行药材归属及成分指认.结果 建立了FHD指纹图谱;10批FHD指纹图谱相似度良好;在FHD HPLC-UV指纹图谱中标定了20个共有峰,其中3、6～8号峰来自防己,1、2、4、5、9、12、13、16、20号峰来自黄芪,10、11、13、14、15、17～19号峰来自甘草.在FHD HPLC-ELSD指纹图谱中标定了16个共有峰,其中1'～3'号峰来自防己,4'、7'、9'、11'、13'、15'、16'号峰来自黄芪,5'～8'、10'、12'、14'号峰来自甘草.通过进样对照品、复方以及在复方中加对照品的方式指认出复方中9个成分,分别为9/4'号峰(毛蕊异黄酮葡萄糖苷)、11/6'号峰(甘草苷)、13/7'号峰(芒柄花苷)、15号峰(甘草素)、16/9,号峰(毛蕊异黄酮)、20/15'号峰(芒柄花素),11'号峰(黄芪甲苷)、13'号峰(黄芪皂苷Ⅱ)、16'号峰(黄芪皂苷Ⅰ).结论 首次建立了FHD HPLC-UV/ELSD指纹图谱分析方法,该法操作简单、准确,精密度、重复性好,可用于表征FHD中化学成分信息,为FHD质量控制提供了可靠的科学依据.

基于UPLC-Q Exactive四级杆-轨道阱液质联用法快速建立清热灵颗粒中潜在中药质量标志物(Q-Marker)成分库

目的 基于中药质量标志物(Q-Marker)理念,使用UPLC-Q Exactive四级杆-静电场轨道阱高分辨液质联用技术,对清热灵颗粒主要化学成分进行快速识别和鉴定,建立清热灵颗粒的潜在Q-Marker库,为探讨建立中成药清热灵颗粒的系统质量控制方法奠定基础.方法 以50％甲醇作为提取液制备供试液,采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100 mm×2.1mm,1.7 μm)进行分离,以甲醇-0.1％甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱,质谱采用负离子监测模式、全扫描及自动触发二级质谱扫描的功能,对清热灵颗粒中成分进行识别及鉴定.并采用Autodock vina 1.1.2软件,以H5N1禽流感病毒为神经氨酸酶受体,利用AutoDock Tools 1.5.6程序确定靶蛋白的活性口袋,对所选标志物进行分子对接研究.结果 通过高分辨UPLC-Q Exactive四级杆-静电场轨道阱高分辨液质联用技术共鉴定了39个化学成分,包括黄酮类化合物25个,苯乙醇苷类6个,有机酸4个,三萜类化合物2个,木脂素类2个.32个化学成分为首次在该制剂中鉴别出,其中15个为专属性成分,建议其中的黄芩苷、汉黄芩苷、连翘酯苷A、甘草苷、连翘酯苷E、连翘酯苷B、异甘草苷、黄芩素、连翘苷、汉黄芩素、甘草素11个成分可作为清热灵颗粒的Q-Marker.结论 通过高分辨UPLC-Q Exactive四级杆-静电场轨道阱高分辨液质联用技术,可以快速分析和确定中成药清热灵颗粒的化学成分,建立清热灵颗粒的潜在Q-Marker库.

反相二维色谱制备甘草中黄酮类化合物

目的 构建甘草黄酮类化合物系统性分离制备方法.方法 采用特异性吸附材料富集甘草中的黄酮类化合物,以自主研发的制备色谱工厂系统,采用色谱分离专家系统软件优化分离制备条件,通过上样量和富集次数等参数的考察,建立了基于分离富集模式的反相二维色谱制备甘草黄酮有效部位及单体化合物的方法.结果 建立了以C18为分离、富集填料,甲醇-水、乙腈-水为一维、二维分离流动相,水为富集稀释液,梯度洗脱体积流量和稀释富集液的体积流量均为21 mL/min,上样量300 mg,富集次数3次的二维色谱分离制备甘草黄酮的方法,其分离过程具有良好的重复性.应用该方法分离制备,可重复获得16个甘草黄酮部位和甘草苷、甘草素、芒柄花黄素、刺甘草查耳酮、7,4'二羟基黄酮、4'-O-[β-D-apio-D-furanosyl-(1 →2)-β-D-glucopyranosyl] liquiritigenin、异甘草素、甘草酚、甘草香豆素共9个单体化合物.结论 建立的甘草黄酮的制备方法为甘草资源的综合利用和甘草黄酮活性药物开发奠定了基础.