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赖型钩端螺旋体与非致病钩端螺旋体差异基因片段的筛选与鉴定
目的:利用抑制消减杂交技术(suppression subtractive hybridization, SSH),比较致病与非致病钩体之间基因组差异,筛选致病钩体特有的基因片段,以分析钩体毒力相关基因.方法:以赖型钩体017株为tester,非致病性patoc Ⅰ株为driver进行SSH.用3种四碱基内切酶RsaⅠ、HaeⅢ、AluⅠ分别酶切基因组DNA,选择适内切酶消化产物(小于2 kb的片段),连接特殊设计的Adaptor进行消减杂交的PCR,得到消减混合物,与T/A克隆载体连接,转化JM109建立差异消减文库,经PCR和Southern blotting筛选鉴定阳性克隆,进而对部分片段进行测序和相似性分析.结果:AluⅠ适于将钩体酶切成用于SSH技术的小片段;经PCR和Southern blotting筛选鉴定得到25个致病钩体中特异存在的阳性克隆,阳性率达到62.5%;序列测定显示插入片段大小为149-1 506 bp,平均480 bp, GC含量从26.30%到51.98%不等,平均36.63%;相似性分析其中6个片段无任何相似性匹配,18个有一定相似性的序列可分为两类:与外膜蛋白或假想蛋白相关和与生化代谢修饰的酶相关.20个序列已被GeneBank收录,收录号分别为AF300873-AF300877,AF325807-AF325821.结论:SSH是一种有效、灵敏的、高特异的比较分析基因组差异的方法,对钩端螺旋体致病基因的筛选、基因组分化、分子遗传研究等具有重要意义;利用SSH技术筛选得到的致病钩体特有消减片段很可能与致病钩体的分子进化和毒力有关,也为我国特有微生物的基因资源开发和基因工程疫苗的设计提供给了重要信息.
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肝豆状核变性的临床表型与ATP7B基因第8外显子突变的关系
目的探讨WD患者临床分型和ATP7B基因8号外显子基因突变类型之间的关系.方法对60例首次住院的WD患者进行临床分型,用PCR-酶切法检测60例住院病人和20例健康对照者的ATP7B基因第8外显子的突变率和突变类型.结果典型肝豆状核变性型15例,突变率40%;扭转痉挛型13例,突变率30.8%;假性硬化型19例,突变率31.6%;内脏型与脑-内脏混合型13例,突变率61.5%.各患者组间第8号外显子的突变率无显著性差异,患者各组与正常组间有极显著性差异. 结论8号外显子突变是WD的发病原因之一.
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一种提高PCR产物亚克隆效率的方法
利用PCR扩增目的基因是常用的一种克隆方法,但在实际操作中,试剂盒中Taq DNA聚合酶在经过各种纯化方法(如酚氯仿抽提,乙醇沉淀,电泳和柱纯化)后,仍附着在扩增产物的5'端,有效地阻止随后的内切酶酶切过程,导致重组的失败。作者采用一种可以显著提高PCR产物克隆的效率的方法,即将10 μl蛋白酶K混合物[蛋白酶K混合物的配制:0.1 mol/LTris-HCl (pH8.0)、5%SDS,0.5 mg/ml蛋白酶K)加入100 μl PCR反应后的产物中,37 ℃水浴1 h后,68 ℃ 15 min以灭活蛋白酶K,用酚-氯仿、氯仿各抽提1次,无水乙醇沉淀,70%乙醇清洗后晾干,并用双蒸水溶解。采用这种方法得到了PCR产物与相应酶切载体连接,可以顺利得到大量的重组子,与常规方法比较大大地提高了克隆的效率。
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pEGFP-N1/PDX1真核载体的构建与表达
目的: 构建胰腺十二指肠同源框蛋白1 (pancreatic and duodenal homeobox factor 1, Pdx1)转录因子真核表达质粒,并检测其在真核细胞中的表达能力及其生物活性.方法:以人胚胎胰腺组织基因组的mRNA为模板经RT-PCR扩增获得Pdx1基因编码序列,克隆到真核表达载体pEGFP-N1的多克隆位点中,构建pEGFP-N1/Pdx1真核表达质粒,并转染L02细胞,用RT-PCR、免疫组化、间接荧光法和Western Blot检测目的基因表达情况.结果:酶切与测序结果表明目的基因序列克隆正确;RT-PCR检测目的基因Pdx1 mRNA在靶细胞L02中表达;免疫组化和间接荧光结果证实Pdx1主要存在于细胞核内;Western blot检测到细胞核内Pdx1目的蛋白.结论:完成人Pdx1基因克隆,成功构建了目的基因Pdx1真核表达载体,并在L02细胞中获得有效表达.
关键词： 胰腺十二指肠同源框蛋白1 质粒 转录因子 内切酶 -
细胞凋亡的流式细胞仪检测技术研究进展
细胞凋亡(apoptosis,APO)是指细胞在一定的生理或病理条件下,遵循自身的规律,通过启动内部机制,主要是内源性DNA内切酶的激活,自己结束其生命的过程.它在胚胎发育、造血、免疫系统的成熟以及维护正常组织和器官的细胞恒定与生长平衡、乃至机体衰老方面都起着重要作用.因此,有关凋亡的研究在临床和基础等各个领域已经广泛开展,凋亡细胞的检测方法显得非常重要.流式细胞仪(Flow cytometry,FCM)将流体喷射技术、激光光学技术、电子技术和计算机技术等集于一体,较其它方法有不可比拟的优越性,既可定性又可定量,且具有简单、快速和敏感性高的特点,可进行多参数和活体细胞分析[1].近年来在APO的研究得到较为广泛的应用,开辟了新途径.本文就应用FCM检测APO的常用方法与机理及新进展作一综述.
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特异性抗肝癌噬菌体单链抗体库的构建及鉴定
噬菌体单链抗体（ScFv）弥补了传统McAb制备繁琐、抗原性强、穿透力弱等不足，为HCC临床和基础研究提供新的手段。我们用基因工程技术和噬菌体表面呈现技术构建和筛选特异性抗HCC噬菌体ScFv库。 1. 材料与方法：(1)抗HCC噬菌体ScFv库的构建：应用HCC细胞常规免疫BALB/C小鼠，从其脾脏提取tRNA并纯化mRNA，逆转录合成cDNA，PCR扩增抗体轻链和重链可变区，应用linker-（Gly4Ser）3装配ScFv基因，在其5′端和3′端分别引入内切酶SfiⅠ和NotⅠ酶切位点，连接到噬菌体载体pCANTAB 5E，转化大肠杆菌TG1细胞，铺SOBAG平板，记数菌落。
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MMPs和TIMPs在脑创伤的研究进展
在中枢神经中,细胞外基质(extracellular matrix,ECM)构成细胞生活的微环境,对中枢神经细胞细胞的具有支持、营养、防御、增殖和迁移等作用.基质金属蛋白酶家族(matrix metalloproteinases,MMPs)是一类锌离子铺助的内切酶家族,它们是降解ECM的主要酶类.在正常条件下,MMPs以酶原形式合成,并且一种MMP受另外一种MMP激活,形成瀑布效应.此外,MMP与基质金属蛋白酶组织抑制物(tissue inhibitors of metalloproteinases,TIMPs)[1]以1:1形式形成复合物,使MMPs失活.ECM在脑创伤急性期破坏,恢复期重建.现对MMPs在脑创伤中的作用做一综述.
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细胞凋亡应用于肿瘤诊断治疗的新进展
目前认为,细胞凋亡是在生理或病理条件下,有核细胞接受某种信号的刺激和触发后,启动自身内部程序,主要通过内源性DNA内切酶的激活而发生的细胞自然死亡过程.肿瘤的发生,可认为是细胞群体凋亡和增殖的平衡受到破坏,异常细胞增殖速度超过凋亡速度,从而过度积累形成肿瘤.细胞凋亡在肿瘤诊断、治疗中的应用,是目前研究的热点.
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A型肉毒毒素美容注射的并发症及防治对策
肉毒毒素是一种锌依赖的肽腱内切酶,是一种强力、不可逆的、可致死的神经毒素,但它同时又是一种较强的肌肉松弛剂[1].自1989年美国FDA正式批准该药用于临床以来,至今已广泛应用于神经科、眼科、耳鼻喉科,口腔科.特别是在皮肤美容整形科,使用更为普遍.许多个体医疗美容机构在消除皱纹的过程中,甚至达到了滥用的程度.现将临床上常见的并发症及防治方法介绍如下.
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"酚氯仿裂解法"提取质粒DNA
1 材料和方法1.1 材料 含有人柯萨奇腺病毒受体(human Coxsackie and adenovirus receptor,hCAR)基因的真核表达质粒载体pIRES2-EGFP-hCAR由本研究所构建;转化菌E.coli DH5a由本研究所保存;内切酶PstI购自TaKaRa公司.LB培养基(蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,氯化钠10 g).Tris-饱和酚、氯仿按1:1体积比配制成混合液;无水乙醇;RTE溶液:10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0),1 mmol/L EDTA+20 mg/mL Rnase A(无Dnase).直径35 mm可反复使用针式小滤器及0.22 μm滤膜购自华美生物生物公司.
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心血管疾病细胞凋亡研究的进展
细胞凋亡(apoptosis),又称为细胞程序死亡(progremmed cell death),是一种细胞死亡的特殊形式,指在一定生理或病理条件下,有核细胞在复杂的调控机制下自身启动细胞内特定的程序,激活内源性DNA内切酶,导致细胞自然死亡.此现象100多年前Carl Vogtp[1]就已发现,1972年Kerr等[2]首次命名为"apoptosis",并初步分析其机制.在近几年的研究已证实细胞凋亡现象普遍存在心血管系统的许多生理及病理变化中,相信随着研究的进一步深入,人们会越来越认识到细胞凋亡与心血管疾病关系的重要性.
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细胞凋亡与心血管系统疾病
细胞凋亡(apoptosis),又称为细胞程序死亡(progremmed celldeath),是一种细胞死亡的特殊形式,指在一定生理或病理条件下,有核细胞在复杂的调控机制下自身启动细胞内特定的程序,激活内源性DNA的内切酶,导致细胞自然死亡.此现象100多年前Carl Vogtp[1]就已发现,1972年Kerr等[2]首次命名为"apoptosis",并初步分析其机制.在近几年的研究已证实细胞凋亡现象普遍存在心血管系统的许多生理及病理变化中,相信随着研究的进一步深入,人们会越来越认识到细胞凋亡与心血管疾病关系的重要性.
