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冬凌草甲素抑制血管生成活性及作用机制
目的:研究冬凌草甲素抑制血管生成的活性及其作用机制.方法:采用体外和体内两种模式,研究冬凌草甲素在血管生成方面的抑制效应.通过体外培养心脏微血管内皮细胞,噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞的活力,酶联免疫吸附(ELISA)法测定血管内皮生长因子(VEGF)的含量;体内选择斑马鱼(Fli1-GFP)生物模式,观察冬凌草甲素对胚胎期血管生成和成鱼期血管损伤后再生的影响,并采用相对荧光定量PCR法检测VEGF通路上主要相关基因VEGFA,血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)2,VEGFR3的表达量.结果:冬凌草甲素具有抑制血管生成活性的作用,可抑制体外内皮细胞活力,其半抑制浓度(IC50)8.04 mg·L-1,可使细胞血清中VEGF的表达量明显下降;可抑制斑马鱼胚胎期体节间血管生成,且抑制成鱼期血管损伤后再生,可能通过降低体内VEGFA,VEGFR2,VEGFR3基因的表达量从而抑制血管生成.结论:冬凌草甲素可有效抑制血管生成,为其抗肿瘤血管生成治疗提供了重要的科学依据.
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川芎内酯A预处理对心肌微血管内皮细胞缺氧/复氧损伤保护作用及机制研究
目的:探讨川芎内酯A预处理对心脏微血管内皮细胞缺氧/复氧(H/R)损伤的保护作用及作用机制.方法:采用体外培养的大鼠乳鼠心脏微血管内皮细胞,空白组不加任何处理;单纯H/R组缺氧4 h/复氧2 h;单纯预处理组低氧25 min/复氧30 min,然后缺氧4 h/复氧2 h,各给药组分别加1×10-7,1×10-9,1×10-11 mol·L-1的川芎内酯A孵育55 min,然后缺氧4 h/复氧2 h;实验结束后取细胞上清液测一氧化氮(NO),一氧化氮合酶(NOS),内皮素(ET),取造模后的且固定在盖玻片的细胞,用原位杂交法检测iNOSmRNA和ETmRNA的基因表达.结果:H/R组细胞存活数降低明显,细胞培养液中NO和NOS活性显著降低,ET的活性明显升高,iNOSmRNA表达量减少,ETmRNA表达量增加;川芎内酯A 3个剂量组与H/R组比较,细胞存活数均明显增加,细胞培养液中NO和NOS活性增加,ET活性降低,iNOSmRNA表达量增加而ETmRNA表达量则减少.结论:川芎内酯A预处理能减轻内皮细胞损伤,对心脏微血管内皮细胞缺氧/复氧损伤可能具有保护作用,其作用机制可能与上调内皮细胞中iNOSmRNA的表达和下调ETmRNA的表达有关.
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人参三七川芎醇提物对衰老人心脏微血管内皮细胞自噬的影响
目的 观察人参三七川芎醇提物延缓内皮细胞衰老的可能作用机制.方法 实验分为衰老细胞组、自噬模型组、白藜芦醇组、人参三七川芎醇提物组,除衰老细胞组外,其余各组的衰老人心脏微血管内皮细胞(HCMEC)通过饥饿方法建立自噬模型.白藜芦醇组用10μmol/L白藜芦醇溶液培养,人参三七川芎醇提物组用100 mg/L人参三七川芎提取物溶液培养48 h.采用电子显微镜观察细胞中自噬小体的形态学改变,western blot法检测自噬蛋白Beelin1、LC3B表达情况.结果 与自噬模型组比较,人参三七川芎醇提物组和白藜芦醇组细胞质中出现较多的独立双层及多层膜结构的自噬体.与自噬模型组比较,人参三七川芎醇提物组和白藜芦醇组Beclin1、LC3B蛋白表达明显增多(P＜0.01),且白藜芦醇组Beclin1、LC3B蛋白的表达明显多于人参三七川芎醇提物组(P＜0.01).结论 人参三七川芎醇提物可促进衰老内皮细胞自噬体的产生及自噬蛋白的表达,这可能是其延缓内皮衰老的重要机制之一.
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PKC/NADPH氧化应激途径对大鼠心脏微血管内皮细胞eNOS脱偶联的影响
目的 观察体外原代培养大鼠心脏微血管内皮细胞内PKC/NADPH氧化应激途径在eNOS脱偶联中的作用.方法 用牛血清白蛋白糖基化终末产物(BSA-AGEs)(100 mg/L)与LY33531(PKC抑制剂)和DPI(NADPH抑制剂)分别作用大鼠心脏微血管内皮细胞(24 h),HPLC法检测BH4,试剂盒检测NO和O2-生成,免疫组化检测eNOS蛋白表达,Western blot法检测P47phox蛋白表达.结果 随着LY33531和DPI浓度(5、10和20 μmol/L)的增加,eNOS脱偶联状态减轻:NO生成逐渐增加(90.7 ±0.3～122.6 ±0.3,160.6 ±0.6,P＜0.05),而O2-生成逐渐减少(P＜0.05),eNOS表达逐渐减少(126.1 ±3.5 ～ 112.6±1.7,114.4 ±1.8,P＜0.05),而BH4含量逐渐增加(P＜0.05).同时,ROS表达和P47phox表达减少(P＜0.05).结论 NADPH氧化应激途径可能参与AGEs诱导的心脏微血管内皮细胞eNOS脱偶联的发生.而AGEs诱导的心脏微血管内皮细胞内NADPH氧化应激的发生是依赖PKC激活的.
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AGEs诱发体外大鼠心脏微血管内皮细胞iNOS表达
目的 观察体外原代培养心脏微血管内皮细胞内一氧化氮(NO)生成与诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达的变化及相关性.方法 采用不同浓度牛血清白蛋白糖基化终末产物(BSA-AGEs)(50～200 mg/L)分别作用于心脏微血管内皮细胞(0～24 h),检测NO生成,免疫组化及Western blot检测iNOS表达.结果 随着AGEs浓度增加及作用时间的延长,心脏微血管内皮细胞中NO生成增多,iNOS表达也增多(P＜0.05).结论 BSA-AGEs可以诱发心脏微血管内皮细胞产生毒性NO,从而引发以微血管内皮功能障碍为特征的糖尿病性心肌病.
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microRNA 在柯萨奇 B3病毒诱导的心肌微血管内皮细胞凋亡中的差异表达
目的：本研究通过体外培养心脏微血管内皮细胞（CMVECs），经柯萨奇 B3病毒（CVB3）感染后，利用miRNA寡核苷酸基因芯片技术筛选差异表达的miRNAs，进一步探讨miRNA在 CVB3诱导 CMVECs 凋亡中的潜在作用机制。方法原代分离培养大鼠 CMVECs 细胞，以100TCID50CVB3病毒感染48 h 后检测Caspase-3活性和细胞凋亡；提取CMVECs细胞RNA，用Agilent大鼠miRNA寡核苷酸基因芯片进行检测，并通过TargetScan、miranda、mirbase和mirdb数据库选取出差异表达明显并与心血管疾病相关的miRNA，经qPCR对其进行验证，通过生物信息学分析预测其调控靶基因；合成miRNA21 mimics转染CMVECs细胞，同时合成miRNA21 inhibitor，与 CVB3共转染 CMVECs 细胞，检测各组细胞 Caspase-3活性变化和细胞凋亡。结果 CVB3感染CMVECs细胞48 h后与正常对照组比较Caspase-3活性显著上调（P＜0.01），细胞凋亡明显增加；通过基因芯片检测及生物信息学分析后发现，与心血管系统疾病密切相关的miRNA为miRNA21，经qPCR验证结果一致，预测其靶基因为PDCD4；miRNA21mimics转染CMVECs细胞后与正常对照组相比Caspase-3活性显著上调，细胞凋亡增加（P＜0.05）；而miRNA21 inhibitor与CVB3共转染 CMVECs 细胞后与 CVB3感染组相比 Caspase-3活性显著下调，细胞凋亡明显减少（P＜0.05）。结论 miRNA21在CVB3感染的CMVECs细胞中的表达有显著变化，并与CMVECs细胞凋亡密切相关，提示miRNA21在CVB3诱导的病毒性心肌炎发病过程中可能起着重要作用。
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miR21对心脏微血管内皮细胞PDCD4/AP1通路的调节作用
目的 探讨柯萨奇B3病毒(CVB3)感染离体培养的大鼠心脏微血管内皮细胞(CMVECs)后,miR-21对PDCD4和转录因子AP1构成的调节通路的影响.方法 (1)CVB3感染CMVECs 48h,实时荧光定量PCR检测各组细胞中miR-21表达;(2) CVB3病毒感染CMVECs48h后,Western Blot法检测各组细胞中PDCD4蛋白表达;(3) CMVECs瞬时转染miR-21模拟物48h后,WesternBlot法检测各组细胞中PDCD4蛋白表达;(4)双荧光素酶报告基因法研究miR-21与PDCD4基因靶向结合位点;(5) CMVECs细胞共转染PDCD4和AP1-Luc质粒,检测AP1-Luc荧光素酶活性以观察PDCD4基因对AP1活性的影响;(6)提取各组细胞核蛋白,电泳迁移率改变实验(EMSA实验)检测AP1和DNA的结合活性.结果 (1) CMVECs感染CVB3病毒48小时后,与对照组比较,病毒感染组miR-21表达上调4.12倍;(2)CMVECs感染CVB3病毒48小时后,与对照组比较,病毒感染组PDCD4蛋白表达明显下调;(3)CMVECs过表达miR-21后PDCD4蛋白表达下调;(4) CMVECs过表达miR-21后显著抑制野生型PDCD4基因3'UTR活性,而对突变型3' UTR活性无影响;(5) CMVECs过表达PDCD4基因48h后AP1-Luc荧光素酶活性与对照组相比明显下调;CMVECs过表达miR-21 48h后AP1-Luc荧光素酶活性与对照组相比显著上调;(6) EMSA实验结果显示CMVECs过表达PDCD4 48h后AP1与DNA结合活性明显下调,过表达miR-21后AP1与DNA结合活性明显上调.结论 CVB3感染CMVECs后上调miRNA-21表达.miR-21通过与靶基因PDCD4的3'非翻译区(3' UTR)靶向结合抑制PDCD4表达、上调AP1活性及AP1与DNA结合活性.
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芪苈强心对缺氧诱导的大鼠心脏微血管内皮细胞凋亡的作用及机制研究
目的 探讨芪苈强心对缺氧诱导心脏微血管内皮细胞(CMVECs)凋亡的影响及可能机制.方法 植块法培养大鼠CMVECs,传代至P2后随机分为对照组、缺氧组(采用低氧发生装置模拟缺氧刺激)、缺氧+芪苈强心(0.5mg/ml)干预组.采用电镜观察CMVECs形态;Caspase3活性检测试剂盒检测细胞Caspase3活性;原位末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡;Western Blot检测细胞Bel-2,Bax蛋白表达水平.结果 与对照组比较,缺氧组CMVECs细胞浆内可见大量凋亡小体,Caspase3活性明显升高(p＜0.01),凋亡率增加(p＜0.01),抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少,促凋亡蛋白Bax表达增加(p＜0.05);与缺氧组相比,芪苈强心干预组细胞形态接近正常;Caspase3活性下调(p＜0.01),凋亡率下降(p＜0.01);Bcl-2表达增加,Bax表达受抑(p＜0.05).结论 芪苈强心可以减少缺氧刺激下CMVECs凋亡,上调抗凋亡蛋白Bcl-2表达,下调促凋亡蛋白Bax表达.
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线粒体外膜转运蛋白70在高糖高脂诱导的心脏微血管内皮细胞损伤中的作用
目的 研究高糖高脂对小鼠心脏微血管内皮细胞(MCMECs)的影响以及线粒体外膜转运蛋白70(Tom70)的作用,并探讨相关机制.方法 将MCMECs分为正常糖组(NG组,给予5.5mmol/L葡萄糖)、高糖组(HG组,给予25mmol/L葡萄糖)和高糖高脂组(HG+HF组,给予25mmol/L葡萄糖以及500μmol/L混合脂肪酸).采用Tom70 siRNA敲低MCMECs中Tom70的表达,进一步将HG+HF组分为对照组(Control组仅转染试剂)、阴性对照siRNA组(Negative siRNA组,转染非特异性阴性Scramble siRNA)和Tom70-siRNA组.为探索Tom70在高糖高脂诱导的MCMECs损伤中的可能作用机制,将Tom70-siRNA组分为不含N-乙酰半胱氨酸(NAC)组和含NAC组.通过流式细胞仪检测各组细胞凋亡水平,ELISA试剂盒测定MCMECs中一氧化氮(NO)的生成,RT-qPCR和免疫荧光检测MCMECs中Tom70的表达变化,DHE染色法与ELISA法测定细胞内活性氧簇(ROS)的水平.结果 高糖可增加MCMECs的凋亡、减少NO生成,而合并高脂可加重这些损伤(P＜0.05).高糖可抑制MCMECs中Tom70的表达,促进ROS生成(P＜0.05);与HG组相比,高糖合并高脂可进一步抑制Tom70的表达,同时显著增加了ROS的生成(P＜0.05).更重要的是,与Control组和Negative siRNA组相比,Tom70-siRNA组胞内ROS含量和细胞凋亡率增加,NO生成显著减少(P＜0.01).与此相反,在此基础上加用抗氧化剂NAC部分逆转了上述MCMECs损伤(P＜0.05).结论 高脂会进一步加重糖尿病MCMECs损伤,Tom70可能通过抑制氧化应激反应在糖尿病心脏微血管内皮损伤中发挥作用.
关键词： 心脏微血管内皮细胞 高糖 高脂 线粒体外膜转运蛋白70 氧化应激 -
灯盏细辛注射液对肿瘤坏死因子损伤大鼠心脏微血管内皮细胞炎性因子的影响
目的 观察灯盏细辛注射液对损伤心脏微血管内皮细胞(CMEC)的保护作用及其对合成释放炎性介质的影响,寻找灯盏细辛注射液的作用靶点和机制,为临床应用提供实验依据.方法 本实验采用大鼠扎鼠CMEC为研究对象,肿瘤坏死因子(TNF-a)为刺激剂,检测CMEC细胞活力(MTT)及乳酸脱氢酶(LDH)释放量;用双抗体夹心酶联免疫法(ELISA)检测损伤的CMEC释放白介素6(IL-6)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的含量;用实时定量PCR方法检测损伤CMEC IL-6,MCP-1 mRNA的表达.结果 灯盏细辛注射液(12.5,25,50和100 mg·L~(-1))提高TNF-a损伤CMEC的细胞活力,降低LDH的释放,灯盏细辛注射液(50和100 mg·L~(-1))抑制TNF-a损伤CMEC IL-6和MCP-1的释放及mRNA的表达.结论 灯盏细辛注射液能够抑制TNF-a诱导CMEC分泌IL-6、MCP-1的作用,降低其mRNA表达,减轻炎性因子对CMEC的损伤.灯盏细辛注射液减轻TNF-a对CMEC的损伤,抑制炎性因子的释放可能是其保护血管内皮细胞的作用机制之一.
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丹酚酸B预适应对缺氧/复氧损伤的心脏微血管内皮细胞蛋白激酶CmRNA表达的影响
[目的]探讨丹酚酸B对心脏微血管内皮细胞(CMEC)抗缺氧损伤的保护机制.[方法]基于缺氧预适应的保护机制,通过缺氧/复氧的CMEC损伤模型,采用分子生物学方法,观察蛋白激酶C mRNA表达情况.[结果]丹酚酸B预适应可促进缺氧/复氧损伤的CMEC的蛋白激酶C mRNA表达增强,且明显优于缺氧预适应(HPC).[结论]丹酚酸B预适应与HPC具有相类似的细胞保护效应,可增强细胞对随后较长时间缺氧/复氧损伤的耐受性,其机制可能是通过增强蛋白激酶C mRNA表达实现的.
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丹酚酸B和丹参酮ⅡA不同配比对肿瘤坏死因子α损伤大鼠心脏微血管内皮细胞的影响
目的观察不同配比的丹酚酸B(Sal B)、丹参酮ⅡA(TanⅡA)对体外肿瘤坏死因子α(TNF-α)损伤大鼠心脏微血管内皮细胞(CMEC)的影响.方法采用CMEC体外培养技术,建立TNF-α损伤模型,以细胞活力,细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)释放、一氧化氮(NO)合成、内皮素(ET)分泌、超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量的变化为评价指标,观察Sal B和TanⅡA不同配比(10:0,8:2,5:5,2:8,0:10)对TNF-α损伤CMEC的保护作用.结果Sal B和TanⅡA(5:5)组明显提高细胞活力,Sal B和TanⅡA(8:2)组显著降低LI)H释放水平,TanⅡA促进NO合成、降低ET分泌以及抗氧化的作用好.结论Sal B和TanⅡA的各配比组均能明显改善细胞的损伤,佳配比根据检测指标的不同而不同.
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汉黄芩素增强乙酰胆碱对大鼠胸主动脉血管的舒张作用研究
目的 探讨汉黄芩素增强乙酰胆碱对大鼠胸主动脉血管的舒张作用及其作用机制.方法 实验分为对照组和加药组,加药组使用含有不同浓度汉黄芩素的DMEM/F12培养基作用;对照组使用含有与加药组相同体积二甲基亚砜(DMSO)的DMEM/F12培养基作用.汉黄芩素孵育大鼠心脏微血管内皮细胞24 h,MTT法检测细胞活力;硝酸还原酶法检测细胞上清NO含量;ELISA法检测细胞内皮型一氧化氮合酶(eNOS)蛋白表达.汉黄芩素孵育大鼠胸主动脉环24 h,去甲肾上腺素(1×10-6 mol/L)收缩血管后应用乙酰胆碱(1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5 mol/L)舒张血管,检测血管张力变化.结果 与对照组比较,汉黄芩素处理细胞后,各组细胞活力没有显著变化.与对照组比较,汉黄芩素(5、20 μmol/L)显著促进NO的产生(P＜0.01),但亚硝基左旋精氨酸甲酯(L-NAME)可以抑制汉黄芩素的这种作用(P＜0.01).汉黄芩素(0.5、5、20 μmol/L)可以浓度相关性地促进心脏微血管内皮细胞eNOS蛋白表达,与对照组比较,汉黄芩素产生的eNOS蛋白水平差异非常显著(P＜0.01).乙酰胆碱(1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5 mol/L)能够浓度相关性地舒张离体大鼠胸主动脉环.与对照组比较,汉黄芩素(20 μmol/L)孵育血管24 h,能显著增加乙酰胆碱对大鼠胸主动脉血管环的舒张程度,降低胸主动脉血管环的收缩率(P＜0.01、0.05).结论 汉黄芩素可能通过促进血管内皮细胞eNOS蛋白表达和NO产生这一途径增强乙酰胆碱对血管的舒张作用.
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新生大鼠心脏微血管内皮细胞原代培养
目的 建立乳鼠心脏微血管内皮细胞(CMEC)体外培养研究模型.方法 采用混合酶(0.06%胰蛋白酶和0.1%Ⅱ型胶原酶均量混合)消化法和差速贴壁法纯化细胞,倒置显微镜对所培养的细胞进行形态学观察,以Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色法进行细胞鉴定.结果 通过形态学特征及微血管内皮细胞相关特异性抗原检测证实,得到高纯度乳鼠心脏微血管内皮细胞.结论 利用混合酶消化法成功分离并培养乳鼠的CMEC,该方法简单易行,可用于进一步的科学研究.
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脑源性神经营养因子与心脏微血管内皮细胞的管状形成
背景:研究发现脑源性神经营养因子可促进内皮细胞的存活,诱导血管新生,但其促进血管新生的细胞与分子机制尚不清楚.目的:观察脑源性神经营养因子在3D体外管状形成模型中对心脏微血管内皮细胞管状结构形成的影响.方法:分离提取大鼠心脏微血管内皮细胞并培养使之形成细胞小球,将心脏微血管内皮细胞小球接种于Ⅰ型胶原-甲基纤维素的3D环境中培养,然后分别加入50,70,100 μg/L的脑源性神经营养因子继续培养,于培养24,48 h观察并测量心脏微血管内皮细胞的分枝长度和分枝条数.结果与结论:经分离的大鼠心脏微血管内皮细胞小球在Ⅰ型胶原-甲基纤维素3D环境中培养24 h,均可见管状分枝,且脑源性神经营养因子可促进管状分枝生长,以100 μg/L的脑源性神经营养因子的促生长效果明显,分枝也多.培养至 48 h,心脏微血管内皮细胞小球的分枝更长.说明脑源性神经营养因子在3D体外管状形成模型中可促进大鼠心脏微血管内皮细胞发芽及管状结构的形成,且具有剂量依赖性.
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TrkB-shiRNA质粒转染心脏微血管内皮细胞
背景:脑源性神经营养因子与其受体TrkB在心脏与骨骼肌内皮细胞存在表达,在心脏血管系统的发育中及骨骼肌缺血时能有效促进血管新生,但其促血管新生的细胞与分子机制尚不清楚.目的:应用针对脑源性神经营养因子受体TrkB的shiRNA质粒对心脏微血管内皮细胞进行转染,观察TrkB 3种亚型的表达及心脏微血管内皮细胞的生长状况和形态,初步探讨脑源性神经营养因子TrkB通路在心脏微血管内皮细胞中的调控作用.方法:使用TrkB-shiRNA质粒转染大鼠心脏微血管内皮细胞,应用荧光实时定量PCR检测TrkB的3个亚型,TrkB-FL、TrkB-T1及TrkB、T2 mRNA的表达,并观察经转染的心脏微血管内皮细胞的增殖情况.结果与结论:应用TrkB-shiRNA质粒转染心脏微血管内皮细胞后,TrkB 3种亚型在转染后的4 d内mRNA表达均下降(P<0.05或P<0.01),且经转染的心脏微血管内皮细胞的生长变慢.说明TrkB-shiRNA质粒可沉默心脏微血管内皮细胞的TrkB-FL、TrkB-T1及TrkB-T2的表达,且TrkB表达被抑制可能会影响心脏微血管内皮细胞的增殖.
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Trx通过Sirt3-P53通路促进自噬并改善高糖诱发的CMECs损伤
目的:明确硫氧还蛋白(Thioredoxin,Trx)通过自噬调节对大鼠心脏微血管内皮细胞损伤的保护作用及相关机制.方法:分离成年大鼠心脏微血管内皮细胞并分为:①正常对照组;②高糖组;③高糖+Trx组;④高糖+Trx+ Ad-shSirt3组;⑤高糖+Trx+Ad-shP53组;⑥高糖+DMSO空载组.通过In Vitro Vascular Permeability Assay Kit检测单层心脏微血管内皮细胞通透性,TUNEL染色检测细胞凋亡,Western blot法检测Sirt3、P53、Atg5、LC3BⅠ/Ⅱ等相关自噬相关信号通路关键蛋白的表达水平.结果:与正常对照组相比,高糖引起单层心脏微血管内皮细胞通透功能损伤,增加细胞凋亡,抑制自噬,且Sirt3、Atg5、LC3BFⅡ表达下降而P53表达上升;给予Trx可以上调Sirt3、Atg5、LC3BⅠ/Ⅱ蛋白表达水平,抑制P53表达,并显著减轻上述高糖引起的细胞损伤;但是,分别干扰Sirt3和P53表达后,Trx的作用明显减弱.结论:Trx通过Sirt3-P53信号通路促进心脏微血管内皮细胞自噬,降低细胞凋亡,改善高糖诱发的大鼠心脏微血管内皮细胞损伤.
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两种分离大鼠心脏微血管内皮细胞方法的比较及改良
目的:比较两种分离成年大鼠心脏微血管内皮细胞的方法并进行改良.方法:分别采用组织块贴壁法和酶消化法分离大鼠心脏微血管内皮细胞,并对其进行表面特异性抗原CD31免疫荧光鉴定.结果:两种方法都获得了心脏微血管内皮细胞,CD31鉴定细胞阳性率在95％以上.两种方法相比,酶消化法具有获得所需的细胞时间相对短,稳定可靠,细胞纯度高等特点.结论:使用酶消化法可获得纯度高、状态良好的心脏微血管内皮细胞.
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雷公藤内酯醇对缺氧再给氧大鼠心脏微血管内皮细胞和中性粒细胞黏附的影响
目的研究雷公藤内酯醇(TRI)对缺氧再给氧大鼠心脏微血管内皮细胞和中性粒细胞黏附的影响.方法培养分离大鼠心脏微血管内皮细胞,建立内皮细胞缺氧再给氧模型,分离大鼠的中性粒细胞,通过凝胶电泳迁移率(EMSA)测定核转录因子-κB(NF-κB)的活性,内皮细胞和中性粒细胞的黏附模型测定内皮细胞和中性粒细胞的黏附率.结果大鼠心脏微血管内皮细胞在缺氧刺激后内皮细胞和中性粒细胞的黏附增加,NF-κB活性明显增高,再给氧后升高更明显;TRI组内皮细胞NF-κB活性明显降低(P<0.01),内皮细胞和中性粒细胞的粘附率显著下降(P<0.01),且呈剂量依赖效应.结论 TRI能明显抑制缺氧再给氧大鼠心脏微血管内皮细胞NF-κB活性,抑制内皮细胞和中性粒细胞的粘附.
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改良大鼠心脏微血管内皮细胞的培养方法及鉴定
目的 建立一种分离大鼠心脏微血管内皮细胞的方法.方法 雄性SD大鼠2只,快速取出心脏,去除左室外约1/4层,充分剪碎剩余组织,Ⅱ型胶原酶和胰酶先后消化20~30 min,过滤并离心收集细胞,加入培养液置于细胞培养箱中培养.结果 原代细胞基本于接种后1~2 h已大部分贴壁,24 h细胞充分伸展,并进入对数生长期,细胞增殖迅速,培养3 d时,可见细胞汇合度达80%~90%,细胞长至融合后呈典型的"铺路石"或"鹅卵石"征.免疫细胞化学鉴定表明在分离培养的大鼠心脏微血管内皮细胞中有特定Ⅷ因子及CD31表达,体外小管形成实验证明大鼠心脏微血管内皮细胞具有小管形成的能力.原代周期3~4 d,传代周期2~3 d,P2代细胞纯度达95%以上.传至P4代仍未见细胞形态及分裂增殖活性下降.结论 本方法培养大鼠心脏微血管内皮细胞简单有效,重复性好,且获得细胞数量多、纯度高,有利于实验人员掌握.
