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槲皮素对原发性高血压患者肠系膜动脉平滑肌细胞钙激活钾通道活性的影响
背景 槲皮素是是一种自然界广泛分布的具有多种生物活性的黄酮类化合物.大量研究已证实槲皮素能够通过多种方式实现降血压效应.但是对于槲皮素通过离子通道降血压的机制目前还不十分清楚.目的 观察槲皮素对高血压患者肠系膜动脉平滑肌细胞钙激活钾通道(Kca)活性的影响,以探讨槲皮素通过离子通道降血压的机制.方法 选取需择期行腹部手术者,共26例,分为两组,血压正常组14例,原发性高血压(EH)组12例.取肠系膜动脉小分支,用急性酶消化法获得单个肠系膜动脉平滑肌细胞.然后应用单通道细胞膜片钳技术观察不同浓度槲皮素对肠系膜动脉平滑肌细胞钙激活钾通道开放概率(Po)、电流幅度值(Am)、平均开放时间(To)、平均关闭时间(Tc)等各指标的影响.结果 在inside-out patch方式下,随着浴液中槲皮素浓度依赖性地增高正常血压者和高血压患者肠系膜动脉平滑肌细胞Kca通道Po,通道Am及通道To变化不大,而通道Tc均明显缩短.各槲皮素浓度下的两组Kca通道Po增长率(△Po%)差异无统计学意义.结论 槲皮素能直接激活人类血管平滑肌细胞Kca通道.高血压患者和正常血压者血管平滑肌细胞Kca对槲皮素的反应性无明显区别.槲皮素激活钙激活钾通道可能是其降血压的一种机制.
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自发性高血压大鼠左心室肌细胞动作电位延长的离子机制
目的:研究自发性高血压大鼠(SHR)左心室肌细胞动作电位时程延长的膜离子流基础.方法:应用酶解方法分离获得正常血压Wistar大鼠和SHR的左心室肌细胞,采用玻璃微电极技术记录动作电位,膜片钳全细胞记录膜离子流,对比正常心室肌细胞和肥大心室肌细胞间动作电位及膜离子流差别.结果:(1)SHR和Wistar大鼠的心脏/体重比分别为5.66±0.46 mg/g和3.7±0.29 mg/g (P<0.001) ,细胞平均膜电容分别为280.68±67.98 pF 和189.94±56.59 pF(P<0.05).提示SHR 心脏肥厚、心肌细胞增大;(2)SHR动作电位APD50和APD90较Wistar大鼠明显延长(21.33±1.56 ms vs 14.91±2.95 ms,P<0.001; 164.6±74 ms vs 93.27±10.59 ms,P<0.00 1),说明SHR心室肌细胞存在复极延迟;(3)SHR的平均ICa-L幅值显著大于Wistar大鼠,分别为1944±466.8 pA和1136±33.3 pA(P<0.001),电流密度二者间无差异(6.932±1.7 1 pA/pF vs 6.19±2.85 pA/pF) ,但SHR的慢失活时间常数明显延长(56.01±13.36 ms vs 43.63±17.89 ms,P<0.001);(4)S HR的Ik1内向电流密度显著小于Wistar大鼠(11.3±2.26 pA/pF vs 14.33 pA/pF,P<0.05),外向电流密度二者间差异无显著性(2.36±0.86 pA/pF vs 2.96±1.27 pA/pF);(5)SHR的Ik密度与Wista r大鼠间无差别(12.38±5.46 pA/pF vs 11.86±3.59 pA/pF);(6)SHR的Ito密度显著地低于Wistar 大鼠(+70 mV时, 8.21±6.64 pA/pF vs 19.16±6.17 pA/pF, P<0.001).但通道的激活和失活时间常数二者无差异,提示Ito的降低可能仅是通道数减少所致.结论:SHR左心室肌细胞动作电位时程延长系外向复极钾流(Ito、Ik1)减小和慢钙通道失活时间常数延长所致.
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适于膜片钳技术的大鼠肝Kupffer细胞急性分离和鉴定
目的:建立一种适于膜片钳技术(PCT)的大鼠肝Kupffer细胞的急性分离方法.方法:经门静脉插管,用无Ca2+,Mg2+K-H原位灌注液冲洗后,Ⅳ型胶原酶原位循环灌注消化,Percoll不连续密度梯度离心,分离制备大鼠肝Kupffer细胞,选择性贴壁纯化.用体内、体外吞噬功能(炭素墨水或聚苯乙烯乳珠)实验鉴定制备的肝Kupffer细胞.用全细胞膜片钳记录技术测定Kupffer细胞电流.结果:分离获得的大鼠肝Kupffer细胞形态多样,典型的为多角形或星形,细胞分离产量为2.5-3.5×106/g,细胞纯度90%,贴壁率为39.4%.用台盼蓝染色鉴定,细胞活性大于90%,多数细胞明显吞噬颗粒.易用于PCT,且记录到钙池操纵的Ca2+通道电流(store-operated Ca2+channel currents,Isoc).结论:用胶原酶原位循环灌注消化,结合Percoll不连续密度梯度离心和选择性贴壁纯化,成功分离制备出高产、纯度高的适于PCT的肝Kupffer细胞.
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大鼠心脏移植物排斥反应时心肌瞬时外向钾电流与心肌细胞动作电位变化的研究
目的:通过复制大鼠心脏移植模型,研究心肌瞬时钾电流在心脏移植物排斥反应时的变化,及动作电位变化.方法:复制大鼠腹部心脏移植模型,对照组(n=20)为Lewis-Lewis同基因移植,实验组(n=20)为Brown Norway-Lewis异基因移植.于移植后第2～4天处死大鼠,取心脏移植物进行病理检查并利用全细胞膜片钳技术记录心肌细胞动作电位(AP)、心肌瞬时外向钾电流(Ito)及内向整流钾电流(Ik1).结果:大鼠腹部心脏移植模型复制成功,组织学可见对照组心脏移植物在移植后无明显排斥反应,而实验组在移植后第2、4天有轻度到中重度排斥反应;在移植后第2天,两组心肌细胞瞬时外向钾电流(Ito)密度无明显差异;第4天,实验组较对照组Ito密度显著下降,内向整流钾电流(Ik1)显著下降(P＜0.05).在移植后第2、4天,实验组较对照组心肌细胞动作电位时程(APD)均显著延长(P＜0.01).结论:在大鼠心脏移植物排斥反应发生时,心肌细胞APD明显延长,Ito及Ik1密度均显著下降.
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丹参Ⅱ-A对大鼠心肌细胞L-型钙通道的影响
目的 研究丹参酮Ⅱ-A对大鼠心肌细胞L型钙通道的影响.方法 采用酶解法制备大鼠心肌细胞,应用全细胞膜片钳技术检测大鼠心肌细胞L-型钙通道的电流密度和动力学.结果 丹参酮Ⅱ-A对L-型钙通道有抑制作用.在0μmol/L、10 μmol/L、20μmol/L和40μmol/L丹参酮Ⅱ-A作下,L-型钙通道的峰值电流密度分别为-13.34±1.06 pA/pF、-10.46 ±0.75 pA/pF、-7.62±0.50 PA/pF和-4.69±0.18 PA/pF,其抑制率分别为28.40％、52.14％和73.50％ (n=8,P＜0.05).结论 丹参酮Ⅱ-A抑制大鼠心肌细胞L-型钙通道,降低L-型钙通道的电流密度,呈浓度依赖性.
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心肌肽素对豚鼠心室肌细胞内向整流钾电流的影响
目的研究心肌肽素对豚鼠心室肌细胞内向整流钾电流(ⅠK1)的影响,探讨心肌肽素抗心律失常的作用机制.方法用急性酶解法分离豚鼠心室肌细胞,用标准的全细胞膜片钳技术,观察不同浓度的心肌肽素对内向整流钾电流的影响.结果在测试电压-100 mV的条件下,观察豚鼠心室肌细胞ⅠK1内向电流对心肌肽素的影响.10 μg/ml心肌肽素使ⅠK1从给药前21.0±6.3 pA/pF降低到给药后18.4±5.4 pA/pF(P＜0.05),抑制率为(20±3)%.50 μg/ml心肌肽素使ⅠK1从给药前22.8±5.5 pA/pF降低到给药后16.0±3.8 pA/pF(P＜0.01),抑制率为(32±6)%.50 μg/ml心肌肽素没有改变ⅠK1的电流密度-电压曲线形态.结论心肌肽素抑制豚鼠心室肌细胞ⅠK1,可能是其抗心律失常作用的机理之一.
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非去极化心脏停跳液对缺血再灌注心肌的保护作用及其电生理机制
目的：探讨非去极化心脏停跳液对缺血再灌注心肌的保护作用及其电生理机制。
方法：①急性剪取SD大鼠心脏，建立Langendorff离体心脏灌注模型，随机分为8组，每组8只：A：短时间常温心脏保存实验分组处理：Con组、ST组、HTK组和NDP组平衡15 min后以室温的无钙KH液、ST液、HTK液和NDP液灌注5 min，并在相应的液体中保存1 hr，再复灌1 hr；B：长时间低温心脏保存实验分组处理：使用4℃的相应停跳液灌停并在4℃液体中保存8 hr后，再复灌1 hr。比较各组再灌注后血流动力学、冠脉流出液中心脏肌钙蛋白I水平、心肌梗死面积、组织ATP和乳酸含量、心肌组织形态和超微结构。②原代培养出生1~2天的SD乳鼠心肌细胞。分为Con组、缺血再灌注组、ST组、HTK组和NDP组。使用全细胞膜片钳技术记录并比较各组心肌细胞AP、INa、ICa-L和Ito通道的特性；用激光共聚焦显微镜下持续观察各组细胞和线粒体钙及膜电位水平的变化。 -
凝血酶受体激活肽对豚鼠心室肌细胞腺嘌呤核苷三磷酸敏感性钾通道的作用
目的:研究凝血酶受体激活肽(TRAP)对豚鼠心室肌细胞腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)敏感性钾(KATP)通道的作用及在保护心肌细胞方面的作用.方法:对健康成年豚鼠采取心室肌细胞急性分离,采用单通道膜片钳记录技术中的细胞贴附式及内面向外模式记录吡那地尔(Pinacidil)、ATP、格列苯脲(Glibenclamide)、TRAP对豚鼠单个心室肌细胞KATP通道电流的影响.结果:加入吡那地尔后KATP通道的通道活动度(0.55±0.07)比加药之前(0.23±0.05增加(记录5次);在吡那地尔存在时,加入ATP后KATP通道的通道活动度(0.67±0.14)较加入ATP之前(0.10±0.05)减少(记录4次);加入格列苯脲后KATP通道的通道活动度(0.56±0.12)比加药前(0.06±0.03)减少(记录5次);加入TRAP后通道的通道活动度(0.48±0.11)比加入TRAP前(0.15±0.11)增加(记录5次),上述比较差异均有统计学意义(P＜0.05～0.01).结论:TRAP激活心室肌细胞KATP通道,对心肌细胞具有保护作用.
关键词： 心室肌细胞 膜片钳技术 腺嘌呤核苷三磷酸敏感性钾通道 凝血酶受体激活肽 -
心脏电生理学新概念:(11) 膜片钳技术在心血管基础和药物研究中的应用
膜片钳技术,特别是全细胞记录技术发明20年来,极大地推动了心血管生理、病理生理及药理学的研究,使人们对心血管系统生理调节,分子水平的病理学改变,及药物的作用机制有了更深的认识和研究手段,解决了大量的理论和实际问题.今后膜片钳技术在心血管基础和药物研究中仍将发挥重要的作用.本文简要介绍膜片钳技术在心血管研究中的应用及进展情况.
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心肌细胞T型钙通道的研究进展
近年研究提示心肌细胞上T型钙通道与心肌增殖、分化、心律失常相关,阻断T型钙通道可以抑制心肌肥厚,预防心肌电重构,改善心功能,但其确切的机制有待进一步研究.
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高血压病患者动脉平滑肌细胞钙激活钾通道变化及意义
目的研究高血压病(essential hypertension,EH)患者肠系膜动脉平滑肌(mesenteric arterial smooth mus-cle,MASM)细胞钙激活钾通道(Ca2+activated K+channel,KCa)改变及意义.方法利用膜片钳单通道记录技术记录胞内和胞外Ca2+对无EH家族史的正常血压者(Nn组),有EH家族史的正常血压者(Nf组),无EH家族史的EH患者(En组),有EH家族史的EH患者(Ef组)肠系膜动脉平滑肌(MASM)细胞KCa开放概率(Po),平均开放时间(To),平均关闭时间(Tc)及电流幅值(Am)的影响.结果(1)人动脉平滑肌KCa开放具有明显的电压和Ca2+依赖性,其电导值大.(2)胞内Ca2+浓度≥5×10-7mol/L时,En组、Ef组MASM细胞KCa的Po分别低于Nn组、Nf组,To缩短.(3)胞外Ca2+浓度≥1.8×10-3mol/L时,En组、Ef组MASM细胞KCa的Po分别高于Nn组、Nf组,To延长,Tc缩短.结论(1)EH患者MASM细胞KCa对胞内Ca2+敏感性降低,这可能是促进高血压发生的机制之一.(2)EH患者MASM细胞对胞外Ca2+敏感性增加,可能与胞外Ca2+内流增加导致胞内Ca2+增加有关.
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一氧化氮对被动致敏人气道平滑肌细胞钾通道的作用
一氧化氮(NO)是一种重要的细胞信号分子,参与多种病理生理过程.既往动物实验发现硝普钠 (SNP)能通过开放钾通道松弛大鼠气道平滑肌,并且在单细胞水平上SNP(NO的供体)能使支气管哮喘(简称哮喘)大鼠模型的气道平滑肌细胞的大电导依赖性钾通道(BKCa)和电压依赖性钾通道(Kv)开放[1],但一氧化氮对哮喘患者的气道平滑肌细胞(HASMC)钾通道作用尚不十分清楚.我们采用全细胞膜片钳技术,通过哮喘患者血清致敏培养的人气道平滑肌细胞,观察SNP对BKCa和Kv电流及细胞兴奋性的影响.
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钾通道开放剂对哮喘豚鼠支气管平滑肌电压依赖性钾通道的作用
采用膜片钳技术探讨哮喘豚鼠支气管平滑肌细胞（BSMCs）电压依赖性钾离子通道（Ik）特性的变化和钾通道开放剂对哮喘豚鼠支气管平滑肌细胞膜Ik的作用。 材料与方法健康豚鼠25只，雌雄不限，体重约300～400 g，分为（1）哮喘组5只（25例细胞）；正常对照组7只（28例细胞），行外向峰值钾电流测定；（2）哮喘组6只（24例细胞）；正常对照组7只（25例细胞），应用钾通道开放剂（Cromakalim）前后钾通道动力学特性变化测定。 支气管平滑肌细胞分离：将两肺组织中3～4级支气管剪成碎块，加入0.25% 胰蛋白酶，洗涤后再加入0.1% 胶原酶消化，用尖端抛光的Pasteur吸管吹打，用200目不锈钢网滤过，用DMEM培养液反复冲洗，即可得到富含支气管平滑肌细胞的细胞悬液。将细胞悬液分装到涂有多聚赖氨酸的小平皿内，静置20 min，选择细胞膜完整、有立体感，胞体呈梭形的细胞用作通道记录。 离子通道记录：采用膜片钳技术的细胞贴附式和全细胞记录式。细胞外液（mmol/L）:NaCl 135、KCl 5、MgCl2 l、CaCl2 l、HEPES缓冲盐水10。记录用微电极电阻约为3 MΩ，单通道电流经膜片钳放大器放大，探头反馈电阻为10 MΩ。低通滤波器滤波频率为3 KHz。全细胞式记录采用负压抽吸式打通膜片。
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大蒜素对兔心房肌细胞超速激活延迟整流钾电流的作用
目的 研究大蒜素对兔单个心房肌细胞超速激活的延迟整流钾电流(IKUr)的作用,探讨其抗房性心律失常的机制.方法 采用双酶法分离兔单个心房肌细胞,应用细胞外局部灌流法给药,采用全细胞膜片钳技术记录电流,以观察大蒜素对IKUr的作用.结果 大蒜素200μmol/L对正常兔心房肌细胞IKUr有显著的抑制效应,使IKUr峰值由(14.5±3.2)pA/pF降至(7.9±1.2)pA/pF (P<0.01,n＝15).大蒜素可使IKUr的电流-电压曲线降低,且随着除极化电位的增加,作用更加明显,提示其作用具有电压依赖性.同时,发现大蒜素对IKUr的抑制效应存在浓度依赖性,半数抑制浓度(IC50)为149.6μmol/L.门控动力学机制研究发现,大蒜素可以使通道激活曲线右移,延迟激活;使通道稳态失活左移,加速失活;使通道失活后恢复时间延长,减缓通道失活后的再次激活.从不同环节减少IKUr通道的开放,降低电流密度.结论 大蒜素抑制心房肌细胞膜上IKUr,这可能是其治疗房性心律失常的细胞电生理基础.
关键词： 大蒜素 心房肌细胞 超速激活延迟整流钾电流 膜片钳技术 -
大电导钙激活钾离子通道与糖尿病视网膜动脉病变
大电导钙激活钾离子通道,即BKca通道,早于1981年在牛嗜铬细胞中发现,1991年其α亚基从果蝇中克隆并表达出来,由于α亚基位点上的突变与肌肉和神经元的钙激活钾电流相关,因此又称为dSIo通道[1],随后在哺乳动物、人和线虫上也克隆了出来.后续研究证明,BKcα通道广泛分布于各种组织细胞中,犬及人平滑肌细胞中多[2].近年来膜片钳技术的应用为BKcα通道电生理特性的研究提供了技术支持,BKcα通道在各种疾病状态下的功能改变成为了新的研究热点.
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依那普利、厄贝沙坦和血管紧张素(1-7)对快速心房起搏犬心房肌钠通道重构的干预作用
目的 观察依那普利、厄贝沙坦和血管紧张素(1-7)[Ang(1-7)]对快速心房起搏犬心房肌细胞钠通道电流(INa)的干预作用.方法 普通杂种犬30只随机分为5组,每组6只.单纯心房起搏组(C组)、心房起搏+依那普利组(EN组)、心房起搏+厄贝沙坦组(IB组)和心房起搏+Ang(1-7)组(A组)犬行心房快速起搏(500 次/min)2周;假手术组(S组)不行起搏刺激.应用膜片钳技术检测心房肌细胞,INa电流密度及通道激活和失活特性.结果 C组INa电流密度较S组明显降低(P<0.05);EN组、IB组和A组INa电流密度较C组明显升高(P<0.05).与S组相比,起搏对INa的电压依赖性激活没有影响(P>0.05);与C组和S组相比,在EN组、IB组和A组,钠通道半激活电位更加超极化(P<0.05).与S组相比,快速心房起搏以及3种干预因素对INa的电压依赖性失活没有明显影响(P>0.05).结论 依那普利、厄贝沙坦和Ang(1-7)通过加快INa的激活过程而增加心房肌INa电流幅度,有助于提高心房肌传导速度,从而抑制快速起搏所致的电重构.
关键词： 血管紧张素(1-7) 钠通道 心房电重构 肾素-血管紧张素系统 膜片钳技术 -
T型钙通道阻断剂对肥厚心肌L型钙通道电流及单细胞mRNA表达的影响
钙通道阻断剂咪拉地尔对T型钙通道有较高的选择性,在整体模型中对L型钙通道的作用尚不明确.本研究联合运用膜片钳技术及单细胞RT-PCR方法,研究二肾一夹肥厚心肌L型钙通道电流及mRNA表达以及药物的影响.
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膜片钳技术记录人重组生长激素对豚鼠心肌细胞L-型钙通道的影响
人重组生长激素(hr-GH)具有改善心功能,增加心肌收缩力作用,同时对心脏和外周血管可产生有利结果,而有关hr-GH强心作用的电生理机制报道较少.本实验利用膜片钳技术对hr-GH强心作用的电生理机制进行初步研究.
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甘松提取物对家兔心室肌细胞钠、钙通道的影响
目的研究甘松提取物对家兔单个心室肌细胞钠通道和L-型钙通道的电生理作用.方法采用全细胞膜片钳技术(Whole cell patch clamp),观察不同浓度的甘松提取物对钠通道电流和L-型钙通道电流的影响.结果5g/L和10g/L的甘松提取物使兔心室肌细胞ⅠNa峰值(Ⅰ Namax)从(66.48±6.44)pA/pF分别降至(50.95±4.78)pA/pF和(39.64±3.87)pA/F(n=8,P＜0.05和P＜0.01);使LCa-L峰值(ⅠCa-Lmax)由(6.485±0.78)pA/pF分别减至(3.644±0.39)pA/pF和(2.455±0.21)pA/pF(n=8,P＜0.01).甘松提取物使ⅠNa和LCa-L的电流-电压曲线上移,但均不改变其激活电位、电位峰值和反转电位.甘松提取物还减慢钠通道灭活后的恢复过程以及抑制钙通道的激活过程.结论甘松提取物对ⅠNa和LCa-L具有浓度依赖性阻滞作用.这可能是其抗心律失常的重要机制.
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体外循环血浆对体外培养人脐静脉血管内皮细胞钙池操纵的钙通道电流的影响
目的 探讨经体外循环(cardiopulmonary bypass,CPB)后人体炎性血浆对体外培养的人脐静脉血管内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVECs)的钙池操纵的钙通道电流(store-operated Ca2+ currents, Isoc)的影响.方法 CPB后血浆采自我科心血管外科手术患者,患者均知情同意.将已培养好的HUVECs按所加入的血浆不同分为4组,每组6例:即组Ⅰ (加入CPB刚开始0 min时血浆的对照组)、组Ⅱ (加入CPB后25 min的血浆)、组Ⅲ(加入CPB后50 min的血浆)及组Ⅳ(加入CPB后50 min含左旋精氨酸的血浆).应用全细胞膜片钳记录技术测定并观察各组HUVECs的Isoc变化.结果 在HUVECs上可记录到Isoc;当钳制电位为-100mV时,组Ⅰ~组Ⅳ中HUVECs的Isoc分别为(-302.38±35.13) pA、(-388.59±58.66) pA、(-577.04±93.69) pA及(-365.42±34.79) pA,各组比较差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01),其中组Ⅳ明显低于组Ⅲ(P＜0.01).结论 CPB后人体炎性血浆可增强血管内皮细胞的钙通道电流,左旋精氨酸可减轻此作用,这对于进一步深入研究CPB围术期血管内皮细胞钙超载的发生机制和防治具有重要意义.
关键词： 体外循环 血管内皮细胞 钙池操纵的钙通道电流 膜片钳技术
