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麦贞花颗粒对H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用及凋亡的影响
目的 探讨麦贞花颗粒(麦冬、女贞子、灵芝、水蛭等)含药血清对H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用及对细胞凋亡的影响.方法 将H9C2心肌细胞随机分为正常对照组、缺氧/复氧组和麦贞花颗粒含药血清组.用酶联免疫吸附试验检测超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、环磷酸腺苷(cAMP),定磷法测定Na+-K+-ATP酶活性,RT-PCR测定谷胱甘肽过氧化物酶(GPX) mRNA表达,电镜检测心肌细胞凋亡.结果 麦贞花颗粒血清预处理心肌细胞48 h能明显降低上清液中MDA水平,提高SOD、Na+-K+-ATP酶、cAMP活性,上调GPX mRNA表达,与缺氧/复氧组相比均有显著性差异(均P＜0.05 ～0.01)；电镜检测心肌细胞显示麦贞花颗粒含药血清组具有相对完整的细胞膜和细胞器而缺氧/复氧已经出现凋亡小体.结论 麦贞花颗粒含药血清对心肌细胞缺氧/复氧损伤具有明显保护作用并能抑制心肌细胞凋亡.
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地氟醚预处理对缺氧/复氧损伤时核因子-κB转导通路效应分子的影响
目的:探讨地氟醚预处理对于核因子(NF)-κB信号转导通路激活后效应分子的影响.方法:选用人脐静脉内皮细胞株(ECV304).将细胞分为5组:(1)空白对照组;(2)缺氧/复氧(A/R)组;(3)A/R+肿瘤坏死因子-α(TNF-α,10 ng·mL-1) 刺激组(A/R+TNF-α组);(4)地氟醚1.0 MAC预处理+A/R组(Des+A/R组);(5)地氟醚1.0 MAC预处理+A/R+TNF-α (10 ng·mL-1) 刺激组(Des+A/R+TNF-α组).应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法分别检测各组细胞的细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)和白细胞介素-8(IL-8)的基因表达水平.结果:A/R组较对照组细胞的ICAM-1、VCAM-1和IL-8 mRNA表达水平均有所增加;而经地氟醚预处理后,Des+A/R组细胞的mRNA表达较A/R组有明显降低.结论:地氟醚预处理可抑制TNF-α刺激的内皮细胞表面黏附分子及炎性介质的基因表达水平.
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莱菔硫烷对H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用
目的:探讨莱菔硫烷(sulforaphane,SFN)对H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用.方法:H 9 C2心肌细胞随机分为3组:正常对照组、缺氧/复氧组(H/R组)和SFN预处理组(10μmol/L SFN预处理细胞12 h后,进行缺氧/复氧处理).采用倒置显微镜观察各组细胞形态及凋亡程度,CCK8法检测各组H9 C2心肌细胞存活率,Western blot法检测血红素氧化酶1(HO-1)、醌氧化还原酶1(NQO1)、Bcl-2和Bax蛋白的表达水平.结果:与正常对照组相比,H/R组和SFN预处理组心肌细胞存活率均降低(P均<0.01),HO-1、NQO1、Bcl-2和Bax蛋白表达水平及Bcl-2/Bax均升高(P均<0.01).与H/R组相比,SFN预处理组的细胞生长状态较好,细胞存活率明显提高[(76.00±0.52)%对(55.73±0.43)%,P<0.01],HO-1(3.24±0.01对1.86±0.01,P<0.01)、NQO1(1.67±0.01对0.95±0.01,P<0.01)和Bcl-2(0.70±0.00对0.48±0.01,P<0.01)蛋白表达水平及Bcl-2/Bax(1.22±0.01对0.56±0.00,P<0.01)均明显升高,Bax蛋白表达水平明显降低(0.57±0.00对0.85±0.01,P<0.01).结论:SFN对H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤有保护作用,可能与促进HO-1、NQO1、Bcl-2蛋白表达,抑制Bax蛋白表达有关.
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马齿苋总黄酮对H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用
目的 探讨马齿苋总黄酮(PTF)对H9c2心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤的保护作用及可能的作用机制.方法 采用培养的H9c2心肌细胞株,分为正常对照组、模型组和PTF 10、30、100 mg·L-1组,建立H/R损伤模型,在H9c2心肌细胞H/R前用PTF预处理12h,应用MTT比色法检测心肌细胞存活率,测定培养液中肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)释放量,超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量.结果 与正常对照组相比,模型组心肌细胞存活数明显减少,心肌细胞培养液中CK和LDH释放量增加(P＜0.01),SOD活性下降、MDA含量升高(P＜0.01)；与模型组相比,PTF 10、30、100 mg·L-1组细胞存活数明显升高,心肌细胞培养液中CK、LDH释放量降低,MDA含量降低,SOD活性增加(P＜ 0.01).结论 PTF可减轻心肌细胞H/R损伤,具有心肌细胞保护作用,其机制可能与提高SOD活性、增强抗氧化能力有关.
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腺病毒介导的HSP70基因转染对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用
目的:研究热休克蛋白70(HSP70)基因转染对体外培养的乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用.方法:体外原代培养乳鼠心肌细胞.以携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的腺病毒载体(Ad.EGFP)按不同感染倍数(MOI)感染体外心肌细胞,通过荧光显微镜、流式细胞仪观察所构建腺病毒的感染力和安全性;应用含有人HSP70基因的重组腺病毒(Ad.HSP70)进行体外感染,采用ELISA法、Western印迹法及免疫组化染色法检测HSP70基因在心肌细胞中的表达情况.利用体外心肌细胞缺氧/复氧损伤模型,研究HSP70基因转染对心肌细胞的保护作用.结果:原代培养获得高纯度的乳鼠心肌细胞,随着MOI值升高,Ad.EGFP的感染效率和基因表达增强,在MOI值为50时,Ad.EGFP感染心肌细胞的效率高于90%,在MOI值为200时,未见心肌细胞的生长明显受抑;ELISA法、Western印迹法证实转染的心肌细胞在正常生理状态下,可高水平表达HSP70.免疫组化染色法结果显示,表达的HSP70主要分布干心肌细胞的胞质和胞核中;利用体外的缺氧/复氧损伤模拟在体的缺血/再灌注损伤,结果显示Ad.HSP70感染组的细胞活力、MTT代谢率、细胞凋亡率、心肌酶谱的变化等指标均优于对照组(P<0.05).结论:重组腺病毒Ad.HSP70能够在体外高效、安全地感染心肌细胞,并成功表达HSP70;HSP70高表达对体外培养的乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤具有显著的保护作用.
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环孢素A对高糖状态下七氟醚后处理大鼠心肌细胞保护作用的影响
目的 明确环孢素A(CsA)能否通过抑制线粒体通透性转换孔(mPTP)开放,并维持线粒体形态恢复七氟醚后处理(SPostC)对高糖培养心肌细胞的保护作用.方法 原代培养SD乳鼠心肌细胞,分别在低糖与高糖浓度下培养48 h后接受缺氧复氧损伤.缺氧前给予CsA或者再灌注前给予SPostC,或二者联合应用,观察心肌细胞复氧后的死亡率、乳酸脱氢酶(LDH)水平、线粒体形态改变及线粒体膜电位变化.结果 SPostC与CsA均降低了缺氧/复氧损伤后的LDH水平与细胞死亡率,增加了缺氧/复氧损伤后的线粒体平均面积/周长比与线粒体膜电位水平(P＜0.05),二者联合并未进一步增强保护作用.高糖(35 mmol/L)加剧了心肌细胞缺氧/复氧损伤,高糖浓度下,上述保护作用均消失.与高糖组相比,SPostC、CsA及二者联合均未能降低缺氧/复氧损伤后的LDH水平与细胞死亡率(P＞0.05),线粒体平均面积/周长比与线粒体膜电位水平变化差异也无统计学意义.结论 CsA和SPostC均能够通过调节线粒体形态抵抗缺氧/复氧损伤,高糖时保护作用消失,联合CsA无法恢复其保护效应.
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地氟醚预处理对缺氧/复氧损伤ECV304细胞NF-κB活性的影响
目的 探讨地氟醚预处理对缺氧/复氧(A/R)损伤ECV304细胞NF-κB活性的影响.方法 选用ECV304细胞株.实验分为两部分:(1)将细胞分为空白对照组及TNF-α不同持续时间刺激组共6组,用Western blot法分析NF-κB的抑制因子IκB蛋白的降解和磷酸化.(2)将细胞分为5组,即空白对照组(Ⅰ组)、A/R组(Ⅱ组)、A/R+TNF-α 10 ng/mL刺激组(Ⅲ组)、地氟醚1.0 MAC预处理+A/R组(Ⅳ组)和地氟醚1.0 MAC预处理+A/R+TNF-α 10 ng/mL刺激组(Ⅴ组).用间接免疫荧光法检测各组细胞NF-κB/p65亚基的定位.结果 TNF-α刺激ECV304细胞后, IκB-α蛋白降解的时间高峰为30 min,而IκB-α磷酸化的时间高峰为1 h.A/R损伤可激活ECV304细胞中NF-κB的活性,而经1.0 MAC地氟醚预处理后,由TNF-α激活的上述变化可受到抑制.免疫荧光分析显示, TNF-α刺激可使NF-κB/p65荧光标记由胞浆区转入胞核区,而经地氟醚预处理后, NF-κB/p65入核明显减少.结论 抑制NF-κB的激活可能是地氟醚预处理减少ECV304细胞缺氧/复氧损伤的机制之一.
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JAK2/STAT3信号通路介导原花青素抗H9C2细胞缺氧/复氧损伤
本研究旨在探讨原花青素(proanthocyanidin,Pro)抗H9C2细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤的机制,明确蛋白质酪氨酸激酶2/信号传导子与激活子3 (Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3,JAK2/STAT3)信号通路在此过程中的作用.取对数生长期的H9C2细胞株,随机分为5组:对照组(Con)、H/R损伤组(H/R)、Pro处理组(H/R+Pro)、JAK2小干扰RNA处理组(H/R+Pro+JAK2 siRNA)和JAK2小干扰RNA对照组(H/R+JAK2 siRNA).Pro (40 μmol/L)预处理8h,H9C2细胞系缺氧2h、复氧4h后用MTT和TUNEL法分别检测各组细胞活力和凋亡率,用试剂盒检测超氧化物生成量,用Western blot法检测JAK2/STAT3通路相关分子,氧化应激指标及内质网应激相关蛋白的表达.结果显示,与H/R组相比,Pro处理可显著提高H/R处理的H9C2细胞活力,并降低细胞凋亡率,明显上调p-JAK2及p-STAT3水平,下调氧化应激指标超氧化物生成量及gp91phox蛋白表达量,下调内质网应激标志蛋白葡萄糖调节蛋白78 (glucose-regulated protein 78,GRP78)、CCAAT/增强子结合蛋白(CCAAT/enhancer binding protein homologous protein,CHOP)及caspase-12的表达,而Pro以上保护作用均被JAK2 siRNA所抑制.本研究结果表明,Pro可通过JAK2/STAT3信号通路减轻H/R引起的H9C2细胞氧化应激与内质网应激损伤.本研究为阐明Pro的心血管保护作用及相关药物的开发提供了实验依据.
关键词： 原花青素 缺氧/复氧损伤 JAK2/STAT3 氧化应激 内质网应激 -
腺苷对缺氧/复氧心肌细胞的保护作用
本研究旨在探讨腺苷(adenosine, ADO)对缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation, H/R)心肌细胞的保护作用及其分子机制.将原代培养的新生大鼠心肌细胞分成H/R对照组和ADO (1.0 μmol/L)保护组.用倒置相差显微镜观察心肌细胞的生长状态.检测两组培养基质乳酸脱氢酶(LDH)活性和心肌细胞Ca2+和丙二醛(MDA)浓度.用ELISA法检测肿瘤坏死因子(TNF-α)的表达, 并用凝胶电泳迁移率改变法(EMSA)测定核因子(NF-κB)结合活性.所得结果如下: (1) 心肌细胞H/R培养后皱缩、变圆, 伪足减少, ADO组心肌细胞的形态变化小于对照组; (2) ADO减少缺氧和复氧期间心肌细胞LDH的漏出(both P<0.01); (3)ADO降低缺氧和复氧期间心肌细胞内的Ca2+浓度(both P<0.01); (4) ADO降低缺氧和复氧期间心肌细胞MDA浓度(both P<0.01); (5) ADO抑制缺氧和复氧期间TNF-α的表达(both P<0.01); (6)ADO抑制缺氧和复氧期间心肌细胞NF-κB结合活性(both P<0.01).以上结果提示: (1) 外源性ADO可减轻心肌细胞的H/R损伤; (2) 外源性ADO抑制H/R期间心肌细胞TNF-α的表达; (3) 外源性ADO可能通过抑制心肌细胞NF-κB结合活性下调TNF-α的表达.
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碱性成纤维细胞生长因子对乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的影响
本实验在培养的乳鼠心肌细胞缺氧复氧(A/R)损伤模型上观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对A/R损伤及蛋白激酶C(PKC)活性的影响,以探讨bFGF作为药物预处理心肌保护的可行性及其机理.结果表明,bFGF预处理呈浓度依赖性地提高A/R后心肌细胞存活率,减少细胞内ATP消耗及胞浆乳酸脱氢酶(LDH)漏出;PKC抑制剂H7完全消除bFGF的上述保护作用;实验结果还表明,bFGF可以直接激活心肌细胞PKC,其激活时相的变化与缺氧预处理者相近,提示bFGF对心肌细胞A/R损伤的保护作用可能是由PKC所介导的.
关键词： 碱性成纤维细胞生长因子 心肌细胞 预处理 蛋白激酶C 缺氧/复氧损伤 -
促炎因子白细胞介素-1参与缺氧/复氧损伤的体外研究
目的研究促炎因子IL-1参与缺氧/复氧损伤的可能机制,探讨保护缺氧/复氧损伤的方法.方法 ECV304细胞株接种于培养瓶中,随机分为A、B、C、D四组,D为正常对照组,A组为实验组,行缺氧(60min)/复氧(240 min)培养,B、C组分别与IL-1和IL-1α受体拮抗剂共孵育.测定各组细胞的成活率,并应用细胞免疫组化分析ECV304细胞表面黏附分子的表达水平.结果经不同试剂培养后,各组细胞的成活率明显不同,A、B组显著低于D组,尤以B组为;细胞形态学也发生相应改变;H/R孵育后ECV304细胞株表达ICAM-1和E-selectin增加,外源性IL-1可以进一步上调ICAM-1和E-selectin的表达,而IL-1受体拮抗剂则可明显抑制这种增多现象.结论缺氧/复氧损伤过程中产生的内源性IL-1在调控ICAM-l和E-selectin的表达及中性粒细胞的黏附中发挥着重要作用;采取措施降低IL-1的生物学活性,可能为临床治疗缺氧/复氧损伤提供新的途径.
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降钙素基因相关肽通过PKC-mitoKATP通路抑制缺氧/复氧诱导的caspase-3和caspase-9酶活性升高
目的 研究降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)对缺氧/复氧(anoxia/reoxygenation,A/R)诱导大鼠心肌细胞凋亡的影响及其相关的信号转导通路. 方法 选用60只健康1～3 d龄SD大鼠,建立心肌细胞体外原代培养模型,采用随机数字表法将心肌细胞分成10组,并进行分组实验(每组6孔):①对照组;②A/R组;③CGRP组(CGRP+A/R组);④特异性CGRP受体阻滞剂组(CGRP8-37+CGRP+A/R组);⑤线粒体ATP敏感性钾通道(ATP sensitive potassium channel,KATP)阻滞剂组(5-HD+CGRP+A/R组);⑥线粒体KATP激动剂组(DZ+A/R组);⑦蛋白激酶A阻滞剂组(H-89+CGRP+A/R组);⑧蛋白激酶C阻滞剂组(chelerythine+CGRP+A/R组);⑨非特异性KATP阻滞剂组(glibenclamide+CGRP+A/R组);⑩细胞膜KATP阻滞剂组(HMR-1098+CGRP+A/R组).采用分光光度法分别检测各组心肌细胞A/R损伤后caspase-3、caspase-9酶活性. 结果 与对照组比较,A/R组心肌细胞中caspase-3、caspase-9的酶活性均明显升高(P＜0.05).与A/R组比较,CGRP+A/R组心肌细胞中caspase-3、caspase-9的酶活性均明显降低(P＜0.05),使用10-6 mol/L CGRP8-37阻滞剂该作用可被逆转(P＜0.05).此外,与A/R组比较,DZ+A/R组心肌细胞中caspase-3、caspase-9的酶活性均明显降低(P＜0.05).与CGRP+A/R组比较,glibenclamide+CGRP+A/R组和5-HD+CGRP+A/R组心肌细胞中caspase-3、caspase-9的酶活性均明显升高(P＜0.05),而HMR-1098+CGRP+A/R组心肌细胞中caspase-3、caspase-9的酶活性并未明显升高(P＞0.05).与CGRP+A/R组比较,chelerythine+CGRP+A/R组心肌细胞中caspase-3、caspase-9的酶活性出现明显升高(P＜0.05),H-89+CGRP+A/R组心肌细胞中caspase-3、caspase-9的酶活性有升高的趋势,但差异无统计学意义(P＞0.05). 结论 CGRP主要通过激活蛋白激酶C-线粒体敏感性钾通道(protein kinase C-mitochondrial KATP,PKC-mitoKATP),降低凋亡蛋白酶caspase-3、caspase-9的表达,来减轻心肌细胞A/R损伤,发挥抗心肌细胞凋亡作用.
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自噬和PI3K-Akt-mTOR信号转导通路在缺氧预处理对高糖心肌细胞缺氧/复氧损伤保护中的作用
目的 探讨自噬和磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 hydroxy kinase,PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)-雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号转导通路在缺氧预处理(hypoxia preconditioning,HPC)对高糖心肌细胞缺氧/复氧(anoxia/reoxygenation,AR)损伤中的作用及机制.方法 将采用高糖培养基培养72 h的心肌细胞用随机数字表法分为5组:空白对照组(S组)、AR损伤对照组(AR组)、HPC组、渥曼青霉素+HPC组(Wo+HPC组)、雷帕霉素+HPC组(Ra+HPC组).采用乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)检测试剂盒检测心肌细胞LDH漏出率,Annexin V/PI双染流式细胞术检测心肌细胞凋亡情况,蛋白印迹法检测心肌细胞微管相关蛋白1轻链3(microtubulesas sociated protein light,LC3)-Ⅱ、Beclin-1、mTOR、PI3K表达和磷酸化(phospho,p)蛋白激酶B/蛋白激酶B(p-Akt/Akt)比值.结果 与AR组比较,Wo+HPC组LDH漏出率、早期和晚期凋亡率降低(P<0.05),LC3-Ⅱ和Beclin-1表达降低(P<0.05),mTOR、PI3K表达和p-Akt/Akt比值升高(P<0.05).HPC组各指标与AR组比较,差异均无统计学意义(P>0.05).与HPC组比较,Wo+HPC组LDH漏出率、早期和晚期凋亡率降低(P<0.05),Beclin-1表达降低(P<0.05),mTOR、PI3K表达和p-Akt/Akt比值升高(P<0.05).结论 激活PI3K-Akt-mTOR信号转导通路抑制自噬可明显改善HPC对高糖心肌细胞AR损伤的保护作用.
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右美托咪定预处理减轻H9C2细胞缺氧/复氧损伤
目的 探讨右美托咪定(dexmedetomidine,Dex)的抗炎作用在抑制H9C2心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤中的作用. 方法 体外培养H9C2细胞,采用连二亚硫酸钠诱导H/R损伤模型.采用随机数字表法分为:正常对照组(C组),常规培养细胞;H/R组,4 mmol/L连二亚硫酸钠处理缺氧lh,换正常培养基继续培养进行复氧12 h;Dex组(D组),缺氧前经不同浓度Dex(0.1、1.0、10.0 μmol/L)预处理lh,其余处理同H/R组.采用甲基噻唑蓝(3-[4,5-dimethyhhiazol-2-yl]-2,5 diphenyhetrazolium bromide,MTT)法检测细胞存活率,2,4-二硝基苯肼显色法检测培养基乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性,倒置显微镜观察H9C2心肌细胞形态,RT-PCR检测TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA的表达水平.结果 与C组比较,H/R组细胞存活率低至(44±l2)％(P＜0.01),LDH活性显著升高(P＜0.01);与H/R组比较,Dex可不同程度地提高H9C2细胞存活率,降低LDH活性,且1.0 μmol/L Dex预处理可将细胞存活率提高至(75±7)％(P＜0.0l),显著降低LDH活性(P＜0.05).倒置显微镜观察到与C组比较,H/R组细胞排列不规则、细胞坏死、细胞膜折光率降低,Dex可以改善H9C2细胞的形态学改变.与C组比较,H/R组TNF-α、IL-6、IL-lβ mRNA的表达水平显著升高(P＜0.05);与H/R组比较,D组TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA的表达水平显著降低(P＜0.05). 结论Dex预处理可减轻H9C2细胞H/R损伤,其机制可能与抑制炎症反应有关.
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七氟醚预处理对缺氧/复氧损伤心肌细胞中自噬的影响
目的 探讨七氟醚预处理对大鼠心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤中自噬变化的影响及机制. 方法 大鼠H9C2心肌细胞采用随机数字表法分为5组(免疫印迹每组4瓶细胞,共20瓶;细胞存活率检测时细胞培养在96孔板中,每组8孔,共40孔):空白对照组(Con组)、H/R组(缺氧4h、复氧2h)、七氟醚预处理组(Sev+H/R组,给予2.5％七氟醚预处理30 min后行H/R)、叔丁基过氧化氢(tert-butylhydroperoxide,TBHP)组(TBHP+H/R组,培养基内加入浓度为25 mmol/L TBHP后行H/R)和七氟醚预处理+叔丁基过氧化氢组(Sev+TBHP+H/R组,2.5％七氟醚预处理后于25 mmol/L TBHP的培养基行H/R).复氧结束后取心肌细胞,四氮唑蓝(thiazolyl blue tetrazolium bromide,MTT)检测细胞存活率,二氯荧光素法(dichlorofluorescein diacetate,DCFH-DA)检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量,免疫印迹法检测Ⅱ型微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein l light chain 3,LC3-Ⅱ)和Beclin l蛋白的表达. 结果 与Con组(100％)比较,H/R组和Sev+H/R组心肌细胞存活率[(52±14)％,(76±20)％]均降低(P＜0.05),ROS的产生量均增加;其余4组Beclinl和LC3-Ⅱ的表达均升高(P＜0.05).与H/R组比较,Sev+H/R组心肌细胞存活率增加(P＜0.05),ROS的产生量降低,LC3-Ⅱ和Beclin1的表达均降低(P＜0.05).与Sev+H/R组[(0.75±0.10),(0.65±0.08)]比较,Sev+TBHP+H/R组LC3-Ⅱ和Beclin1的表达[(1.02±0.08),(0.85±0.04)]均升高(P＜0.05). 结论 七氟醚预处理通过降低H/R期间ROS的产生量来降低大鼠心肌细胞H/R损伤中自噬的水平,对大鼠心肌细胞H/R损伤产生保护作用.
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线粒体通透性转换孔与心肌细胞缺氧/复氧过程中炎症反应关系的实验研究
目的 探讨线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)功能状态与心肌细胞缺氧/复氧损伤过程中炎症反应的关系.方法 心肌细胞培养72 h后,采用随机数字表法将其随机分为4组:空白对照组(Sham 组)、缺氧/复氧损伤对照组(AR组)、mPTP开放抑制剂环孢素A(ciclosporin A,CSA)后处理组(CSA组)、mPTP开放剂苍术苷(atractyloside,ATR)后处理组(ATR组).实验结束后检测各组心肌细胞乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)漏出率、心肌细胞凋亡、线粒体膜电位的变化和心肌细胞核转录因子-κB p65(nuclear factor-κB p65,NF-κB p65)与磷酸化核转录因子-κBp65 Ser536(p-NF-κB p65 Ser536)蛋白的表达量,并检测心肌细胞培养上清液白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)与肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的浓度.结果 与AR组比较,CSA组LDH漏出率显著降低[(27.2±2.6)％,(19.0±2.3)％](P＜0.01),早期凋亡细胞百分比显著降低[(33.4±2.8)％,(15.4±2.3)％](P＜0.01),p-NF-κB p65 Ser536蛋白表达量显著降低(5.1±0.7,4.4±0.4)(P＜0.01),IL-6和TNF-α浓度均显著降低[IL-6 (190±10),(170±11) ng/L;TNF-α(129±9),(118±12) ng/L](P＜0.01).与AR组比较,ATR组LDH漏出率显著升高[(27.2±2.6)％,(32.1±3.6)％](P＜0.01),早期凋亡细胞百分比显著升高[(33.4±2.8)％,(43.0±3.3)％](P＜0.0l),p-NF-κB p65 Ser536蛋白表达量显著升高(5.1±0.7,5.8±0.6)(P＜0.01),IL-6和TNF-α浓度均显著升高[IL-6 (189±10),(205±9) ng/L;TNF-α(129±9),(144±10) ng/L] (P＜0.01).结论 mPTP开放状态能够通过调控心肌细胞缺氧/复氧过程中的炎症反应而显著影响缺氧/复氧心肌细胞损伤的程度.
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地氟醚预处理对缺氧/复氧损伤内皮细胞内游离Ca~(2+)浓度和钙网蛋白表达的影响
目的 观察地氟醚预处理对缺氧/复氧(A/R)损伤的内皮细胞内游离Ca~(2+)浓度及钙网蛋白表达水平的影响.方法 人脐静脉内皮细胞株(ECV304)细胞分为三组:A/R组(Ⅰ组)、地氟醚1.0 MAC预处理+A/R组(Ⅱ组)和空白对照组(Ⅲ组).应用Fluo-3/AM荧光探针法和Western blot方法检测细胞中游离Ca~(2+)浓度和钙网蛋白水平.结果 与Ⅲ组比较,Ⅰ和Ⅱ组细胞中游离Ca~(2+)浓度显著增高(P<0.01),但Ⅱ组的升高幅度明显低于Ⅰ组(P<0.05);Ⅱ组细胞中游离Ca~(2+)负载有所增高,但钙网蛋白表达水平增加(P<0.05).结论 地氟醚预处理可通过降低细胞内的钙超载来减轻A/R造成的损伤.
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利多卡因对缺氧/复氧后肝细胞Bcl-2、Caspase-3蛋白表达及细胞凋亡的影响
目的 探讨利多卡因预处理对肝细胞缺氧/复氧后Bcl-2、Caspase-3蛋白表达及细胞凋亡的影响.方法 将体外培养的肝细胞分为三组:缺氧/复氧组(Ⅰ组)、利多卡因预处理组(Ⅱ组)和正常对照组(Ⅲ组),每组10份.检测肝细胞缺氧/复氧培养后细胞培养液中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)浓度,肝细胞Bcl-2、Caspase-3蛋白表达、肝细胞凋亡率及超微结构变化.结果 Ⅰ、Ⅱ组细胞培养液中ALT、AST浓度、肝细胞Caspase-3蛋白表达和肝细胞凋亡率较Ⅲ组均升高(P＜0.05),透射电镜示肝细胞损伤,可见凋亡细胞;Ⅱ组细胞复氧后培养液中ALT、AST浓度、肝细胞Caspase-3蛋白表达和细胞凋亡率均低于Ⅰ组(P＜0.05),而肝细胞Bcl-2蛋白表达较Ⅰ组升高(P＜0.05),透射电镜观察也显示Ⅱ组肝细胞比Ⅰ组损伤轻微.结论 利多卡因预处理可以在一定程度上减轻缺氧/复氧后肝细胞损伤,降低细胞凋亡率,保护机制可能与Bcl-2、Caspase-3蛋白表达有关.
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红景天苷对小牛胸主动脉内皮细胞的保护作用
目的:探讨红景天苷对小牛胸主动脉内皮细胞过氧化损伤﹑缺氧/复氧损伤的作用及其机制.方法:体外培养原代小牛胸主动脉内皮细胞,观察红景天苷对正常细胞增殖的作用及cNOS活性;用H2O2和Na2S2O4分别复制过氧化损伤模型和复制缺氧/复氧损伤模型,测定细胞活性(MTT法),并测量LDH、NO、SOD和MDA含量.结果:红景天苷明显促进正常内皮细胞增殖,给药后24小时作用明显,增加细胞裂解液中cNOS活性;在氧化损伤模型和缺氧/复氧损伤模型中,红景天苷明显提高细胞存活率,增加胞内SOD活性和NO的释放,降低培养液中LDH释放量和胞内MDA含量.结论:红景天苷能促进正常内皮细胞增殖,对缺氧/复氧损伤、过氧化损伤内皮细胞均有一定的保护作用.
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丝氨酸蛋白酶抑制物vaspin对缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡的影响
目的:探索丝氨酸蛋白酶抑制物vaspin对缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡的作用及可能的机制.方法:体外分离培养新生乳鼠心肌细胞,设立对照组(正常培养组)、缺氧/复氧组和缺氧/复氧+vaspin组(300 ng/mL预处理).经不同处理后通过TUNEL染色评估细胞凋亡情况,蛋白质印迹法检测心肌细胞PI3K及Akt表达.结果:缺氧/复氧处理后心肌细胞凋亡增加,心肌细胞内PI3K p100γ、Akt1、Akt及p-Akt的表达水平降低;而在复氧前予以外源性vaspin处理可增加心肌细胞内PI3K p100γ、Akt1、Akt及p-Akt的表达水平(均P＜0.05),且降低心肌细胞凋亡比例(P＜0.05).结论:外源性vaspin可通过激活心肌细胞内PI3 K/Akt信号通路抑制缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡.
