银杏蜜环口服溶液作用p38MAPK调节eNOS/NO信号途径保护人脐静脉内皮细胞缺氧复氧损伤

目的:评估银杏蜜环口服溶液对缺氧复氧损伤人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的保护作用;从p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)及内皮型一氧化氮合酶(eNOS)/一氧化氮(NO)信号途径探讨银杏蜜环口服溶液保护受损HUVECs的药效机制.方法:缺氧缺糖/复氧复糖法建立体外HUVECs缺血再灌注损伤模型.分为正常组、模型组、银杏蜜环口服溶液高质量浓度组(75 mg·L-1,简称银蜜高),低质量浓度组(36 mg·L-1,简称银蜜低),p38 MAPK抑制剂SB203580组,银蜜高+SB203580组,eNOS抑制剂亚硝基左旋精氨酸甲酯(L-NAME)组,银蜜高+L-NAME组.细胞增殖-毒性检测试剂盒(CCK-8)及微量酶标法检测细胞活力及细胞损伤;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)/p38 MAPK和磷酸化eNOS(p-eNOS)/eNOS蛋白表达;酶联免疫吸附法(ELISA)检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α),可溶性细胞间黏附分子-1(sICAM-1),半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)含量;硝酸盐还原酶法检测NO含量.结果:银蜜高、银蜜低组可显著提高缺氧复氧损伤HUVECs活力、降低细胞乳酸脱氢酶(LDH)漏出量(P ＜0.05,P＜0.01);抑制受损细胞p38的磷酸化(P＜0.05),降低细胞培养上清中TNF-α,sICAM-1含量(P ＜0.05,P＜0.01).在给予银蜜高或(和)SB203580后,受抑制的eNOS磷酸化表达水平显著升高(P＜0.05);银蜜高可显著提高受损细胞NO含量,在加入eNOS抑制剂L-NAME后,银蜜高可拮抗L-NAME降低细胞NO生成和升高Caspase-3的作用(P＜0.05).结论:银杏蜜环口服溶液可提高氧复氧损伤HUVEs活力,具有抗炎、调节内皮系统、抑制细胞凋亡的作用,机制与其作用于p38 MAPK进而调节eNOS-NO信号途径相关.

紫芪方含药血清对肠上皮细胞缺氧复氧损伤的保护效应

目的:探讨紫芪方对IEC-6肠上皮细胞缺氧复氧损伤的保护效应.方法:建立IEC-6细胞缺氧复氧损伤模型;采用血清药理学方法,在细胞培养液中加入不同给药剂量制备的紫芪方药物血清(给药1次和间隔1 h两次给药10 g·kg-1 DJ-1,SJ-1;给药1次和间隔1 h两次给药20 g·kg-1;DJ-2,SJ-2),和参附药物血清(间隔1 h两次给药20 g·kg-1 SF)及对照血清(C).测定LDH漏出量和其细胞生长曲线.结果:与对照组比较,SJ-1,SJ-2两组制备的药物血清能明显减少IEC-6细胞LDH的漏出量,其中SJ-1(P＜0.05),SJ-2(P＜0.01);SJ-2组24 h细胞活力明显高于缺氧复氧细胞损伤组及参附血清组(P＜0.05),并随时间而逐渐增强.结论:紫芪方对IEC-6肠上皮细胞缺氧复氧损伤具有显著保护效应.

参元丹含药血清对缺氧复氧心肌细胞自噬的影响

目的:观察参元丹含药血清对缺氧复氧心肌细胞自噬的影响,探讨参元丹心肌保护作用机制.方法:建立缺氧复氧心肌细胞损伤模型,采用免疫细胞化学法观察心肌细胞微管相关蛋白1轻链3 (LC3)和磷酸肌醇-3-激酶( PI3K)表达,实时荧光定量PCR( Real-time PCR)法测定自噬相关基因(Beclin-1)和半胱天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)mRNA表达量.结果:与正常对照组相比,缺氧复氧组LC3和PI3K荧光表达增强,参元丹含药血清组与相应浓度空白血清组相比,细胞LC3和PI3K荧光表达强度减弱,其中参元丹含药血清10％组PI3K荧光强度明显降低,具有统计学意义(P＜0.05)；缺氧复氧组细胞Beclin-1和Caspase-3 mRNA表达量明显升高,与相应浓度空白血清组相比,参元丹含药血清组Beclin-1 mRNA表达水平明显降低；参元丹含药血清5％组Caspase-3 mRNA表达量降低.结论:参元丹含药血清对缺氧复氧细胞自噬具有抑制作用,可能与抑制PI3K,下调Beclin-1和Caspase-3基因有关.

含药血清药理作用强度与体内给药的量效、时效关系研究

目的:考察含药血清药理作用强度与体内给药的量效、时效关系.方法:以中药有效组分配伍方剂双参通冠方不同灌胃剂量、药后不同取血时间所得的药物血清为受试药物;培养心肌细胞,进行缺氧复氧实验,复氧同时给予不同双参通冠方药物血清处理,实验结束后取培养上清检测LDH值,以LDH释放抑制率为指标,观察含药血清药理作用强度与体内给药的量效、时效关系.结果:体内给药量大所获得的药物血清其LDH释放抑制率并不一定高,二者之间无明显量效关系;药后不同时间取血所获得的药物血清对LDH释放的抑制率亦不相同,以药后90min所得药物血清药理效应佳.结论:体内给药量并非越大其药物血清药理效应越好,药后佳取血时间亦得自行摸索.

迷迭香酸对心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用研究

目的:研究迷迭香酸对大鼠乳鼠原代心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用.方法:体外培养大鼠原代心肌细胞,复制心肌细胞缺氧复氧损伤模型,分别观察细胞活力和LDH漏出的改变,采用化学发光法检测细胞ATP含量变化,利用荧光探针技术检测细胞内ROS产生的变化,采用流式细胞术及Western blot法进一步考察迷迭香酸对心肌细胞凋亡,cleaved-caspase 3,Akt和p-Akt蛋白表达的影响.结果:实验结果显示,25,50,100 mg·L-1迷迭香酸均能显著抑制缺氧复氧导致的细胞活力下降,LDH漏出及ROS的过度产生,并能维持细胞内ATP水平;50,100 mg·L-1迷迭香酸显著抑制缺氧复氧诱导的心肌细胞凋亡和下调cleaved-caspase 3蛋白表达,并且100 mg·L-1迷迭香酸能够明显上调p-Akt蛋白的表达.结论:迷迭香酸具有显著的抗心肌细胞缺氧复氧损伤作用,能够改善心肌细胞能量代谢和减少细胞凋亡,其保护作用可能是通过激活Akt通路实现的.

琥珀酸对原代心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用

本研究采用SD大鼠乳鼠心肌细胞原代培养,复制心肌细胞缺氧复氧损伤模型,考察琥珀酸对心肌细胞缺氧复氧损伤的LDH漏出率的影响,并进一步采用流式细胞术及Western blot考察琥珀酸对心肌细胞凋亡,cleaved caspase-3及p-Akt的影响,探讨琥珀酸对新生大鼠原代心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用.研究结果发现:①琥珀酸31.25 ～ 500 mg·L-1对原代心肌细胞活力无明显影响,琥珀酸400,200,100,50 mg·L-1均可显著降低心肌细胞缺氧复氧损伤LDH漏出率(P＜0.01或P＜0.05);②琥珀酸400,200 mg·L-1可显著降低缺氧复氧损伤所致的心肌细胞凋亡百分数(P＜0.05),抑制心肌细胞缺氧复氧所致的cleaved caspase-3蛋白表达增加(P＜0.05);③琥珀酸400 mg·L-1可显著增加心肌细胞的p-Akt蛋白表达(P＜0.05),而琥珀酸200 mg·L-对p-Akt蛋白表达无明显影响.因此,本研究认为琥珀酸可通过激活Akt的磷酸化而抑制心肌细胞缺氧复氧所致的坏死和凋亡.

清脑益智方通过调控PI3K/Akt信号通路抗缺氧复氧诱导皮层神经元细胞凋亡的实验研究

目的 观察清脑益智方含药脑脊液对缺氧复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)神经元存活率、凋亡及PI3K/Akt信号转导通路的影响,探讨清脑益智方治疗血管性痴呆的部分机制.方法 原代培养皮层神经元,将神经元细胞(CNC)按照1×106的浓度接种于细胞培养板,将CNC分为正常组(简称NC组)、缺氧复氧组(简称MC组)、正常脑脊液组(简称N-CSF组)、清脑益智方含药脑脊液高剂量组(简称QN-H组)、清脑益智方含药脑脊液低剂量组(简称QN-L组)、恩必普组(简称NBP组).除NC组外,其余各组均在添加相应干预措施后进行缺氧24 h复氧24 h处理.采用CCK-8试剂盒检测细胞活力;采用TUNEL法检测细胞的凋亡情况;采用Western blot法检测磷酸化PI3K及磷酸化Akt蛋白表达;采用逆转录PCR(RT-PCR)法检测PI3K、Akt、mTOR基因表达.结果 与NC组比较,MC组CNC活力(OD值)下降(P＜0.01).CNC凋亡数目明显增多(P＜0.01).PI3K、Akt、mTOR基因表达均显著降低,p-PI3K、p-Akt蛋白表达升高(P＜0.05);与MC组比较,QN-H组OD值升高明显(P ＜0.01);QN-H、QN-L、NBP组神经元凋亡数目明显减少(P＜0.01),其中QN-H组神经元凋亡数目较NBP组更少(P＜0.01);QN-H组PI3K、Akt、mTOR基因表达水平均提高(P ＜0.05,P＜0.01),QN-L组PI3K、Akt基因表达水平亦升高(P＜0.01);QN-H、QN-L、NBP组的p-PI3K蛋白表达水平明显升高(P＜0.05).结论 清脑益智方能提高缺氧复氧致皮层神经细胞活力,减少缺氧复氧引起的皮层神经元的凋亡数目,此作用可能与清脑益智方对PI3 K/A kt信号转导通路的调节有关.

痰瘀同治方对缺氧复氧诱导心肌细胞AMPK-mTOR自噬信号通路的影响及机制

目的 研究痰瘀同治方对缺氧/复氧(H/R)心肌细胞自噬的影响及AMPK-mTOR信号通路在其中可能发挥的作用.方法 体外培养H9C2心肌细胞,随机分为空白对照组、H/R模型组(缺氧10h后复氧2h)、痰瘀同治方组、血府逐瘀汤组及栝蒌薤白半夏汤组,各组给予相应方剂肠吸收液18 mg/mL孵育2h后H/R处理.电镜下观察细胞自噬体结构,检测细胞上清液中LDH释放量和SOD活性,蛋白免疫印迹测定细胞内LC3、Beclin-1、P-AMPK和P-mTOR蛋白表达.结果 心肌细胞缺氧复氧后自噬体形成并增多.与空白对照组比较,H/R模型组心肌细胞LDH含量、LC3及Beclin-1蛋白表达量增加,p-AMPK表达增强,SOD活性下降且p-mTOR表达减弱(P ＜0.05,P＜0.01).与H/R模型组比较,各中药组干预后均能降低LDH、Beclin-1表达,痰瘀同治方组与血府逐瘀汤组可同时提高SOD活性,抑制LC3高表达(P ＜0.05,P＜0.01).同时痰瘀同治方组与血府逐瘀汤组可下调p-AMPK水平,并上调p-mTOR蛋白表达(P ＜0.05,P＜0.01).结论 缺氧复氧可激活心肌细胞AMPK-mTOR信号通路,从而诱导自噬过度表达加重心肌损伤,痰瘀同治方可通过调控AMPK-mTOR信号通路、抑制自噬而起到心肌保护作用.

缺氧复氧对肠上皮细胞凋亡指数及线粒体膜电位的影响

观察缺氧复氧对IEC-6(肠上皮)细胞凋亡和线粒体膜电位的影响,探讨其细胞损伤的机制.建立IEC-6细胞缺氧复氧损伤模型;用流式细胞仪检测细胞凋亡指数,采用激光共聚焦显微镜测定线粒体膜电位变化.结果表明IEC-6细胞缺氧复氧损伤后,细胞凋亡指数明显升高(P<0.01),线粒体膜电位明显降低(P<0.01).

HBSP抑制缺氧复氧心肌H9C2细胞Omi/HtrA2胞内转位及细胞凋亡

目的 探讨促红细胞生成素衍生肽(HBSP)对缺氧复氧心肌细胞Omi/HtrA2胞内转位及细胞凋亡的影响.方法 将乳鼠心肌细胞(H9C2细胞)分为对照(Ctrl)组、缺氧复氧(H/R)组、HBSP组和EPO组.培养结束后MTS法检测细胞存活率,酶标仪检测细胞上清液中LDH释放率,Western blot检测细胞内cleaved caspase-3表达,TUNEL法检测心肌细胞凋亡;分离H9C2细胞胞质及线粒体,Western blot分别检测线粒体及细胞质Omi/HtrA2表达.结果 与Ctrl组相比,H/R组细胞存活率下降(P＜0.05),LDH释放、cleaved caspase-3表达、心肌细胞凋亡及Omi/HtrA2胞内转位均明显上升(P＜0.05);与H/R组相比,EPO组的细胞存活率升高(P＜0.05),LDH释放降低、cleaved caspase-3表达减弱、心肌细胞凋亡减少、Omi/HtrA2线粒体转位明显减少(P＜0.05);随着HBSP浓度的增加,各组细胞存活率逐渐上升,LDH释放、cleaved caspase-3表达、心肌细胞凋亡及Omi/HtrA2胞内转位率逐渐下降(P＜0.05).结论 HBSP具有与EPO类似的保护作用,可抑制经H/R诱导的心肌细胞凋亡,其机制可能是通过减少Omi/HtrA2蛋白的胞内转位,抑制caspases通路激活,进而发挥细胞保护作用.

人参银杏复方制剂对缺氧复氧后大鼠海马CA1区GABA、Glu表达的影响

目的:探讨人参银杏复方制剂对缺氧复氧后海马CA1区神经元的保护作用机制.方法:应用低压氧舱仿海拔8000米高空缺氧模型,采用免疫组织化学及免疫荧光方法并结合图像分析等技术,观察预防性应用人参银杏复方制剂对缺氧24h复氧0h、24h时段海马CA1区GABA、Glu表达的影响.结果:缺氧24h复氧0h组海马CA1区GABA免疫反应阳性神经元数量、Glu免疫反应阳性神经元荧光强度分别较常氧对照组减少和减弱,复氧24h后上述变化更加明显.预防性应用人参银杏复方制剂后海马CA1区GABA免疫反应阳性神经元数量在复氧0h和24h时较常氧对照组多,以复氧0h时增加明显;Glu免疫反应阳性神经元荧光强度在复氧0h、24h时段也较缺氧复氧实验组相应时段增加.结论:人参银杏复方制剂可增加缺氧复氧后海马CA1区GABA表达及防止Glu过度释放,对缺氧复氧性脑损伤具有保护作用.

一氧化氮合酶与缺氧复氧所致神经细胞凋亡及银杏叶提取物的保护作用

目的探讨一氧化氮(NO)在缺氧复氧诱导神经细胞凋亡中的作用及中药银杏叶提取物的保护机制.方法实验使用胎龄16～17日Wistar大鼠的大脑皮层神经细胞进行原代分离培养;采用Wright-Giemsa染色,光镜、透射电子显微镜观察;原位末端标记法确立缺氧复氧神经细胞凋亡病理模型;应用NADPH-d组织化学方法检测神经细胞一氧化氮合酶(NOS)的表达并用计算机图像分析系统进行定量检测. 结果缺氧复氧可以使大鼠大脑皮层神经细胞发生凋亡,随缺氧时间的延长,凋亡细胞数渐多,至缺氧8 h复氧18 h达高峰;在缺氧2 h(H2R0组)和缺氧8 h复氧18 h(R8R18)组中神经细胞NOS表达均显著增高,与正常对照组比有显著性差异(P＜0.01;P＜0.05).EGB能显著抑制此双时相NOS活性的增强,并明显降低神经细胞凋亡率. 结论缺氧复氧损伤可诱导培养的大鼠大脑皮层神经细胞发生凋亡.NOS表达增强从而使NO产生增加可能是缺氧复氧诱导神经细胞凋亡的机制之一.银杏叶提取物(EGB)经下调NOS表达活性,抑制NO的产生保护培养的大鼠大脑皮层神经细胞免于凋亡.

TLR4基因小干扰RNA对缺氧复氧诱导BV-2细胞炎症因子分泌的影响

目的 研究Toll样受体4(TLR4)基因小干扰RNA(siRNA)对体外缺氧复氧条件下诱导BV-2细胞分泌TNF-α的抑制作用.方法 小鼠小胶质细胞株BV-2置于六扎培养板培养,随机分为N组(正常培养组)、H组(缺氧复氧组)、T组(缺氧复氧+TLR4-siRNA转染组,转染质粒pEGFP-H1/TLR4-siRNA)、C组(缺氧复氧+对照siRNA转染组,转染含对照序列的质粒pEGFP-H1/对照-siR-NA)和B组(缺氧复氧+空白质粒转染组,转染pEGFP-H1空质粒)共5组.其中H组、T组、C组和B组细胞缺氧培养3 h后复氧培养24 h,运用脂质体转染技术介导质粒转染,流式细胞术检测转染后BV-2细胞EGFP的表达率,RT-PCR方法检测各组BV-2细胞TLR4 mRNA和NF-кB p65 mRNA的表达水平,Western blot方法检测各组BV-2细胞TLR4蛋白表达变化,ELISA方法检测各组上清液中TNF-α含量.采用方差分析进行统计分析.结果 转染后BV-2细胞EGFP的表达率为(67.58±7.16)%;经缺氧复氧处理后,H组、T组、C组和B绀的TLR4 mRNA、NF-кB p65 mRNA、TLR4蛋白水平较N组均明显上调(P＜0.01),各组卜清液TNF-α含量较N组也明显升高(P＜0.01);而T组TLP4 mRNA、NF-кBp65 mRNA、TLR4蛋白表达量和上清液TNF-α含量较H组、C组和B组均明显下凋(P＜0.01);C组和B组分别与H组相比,各项检测指标表达均无明显变化(P＞0.05).结论 针对TLR4 mRNA的小干扰RNA可以有效的抑制缺氧复氧诱导的BV-2细胞的炎症反应.

黄连素对缺氧复氧诱导的心肌细胞凋亡的影响

目的 研究黄连素对缺氧复氧诱导的心肌细胞凋亡的影响.方法 以心肌细胞H9C2为研究对象,分为3组,依次为对照组、模型组、黄连素组,其中模型组和黄连素组进行缺氧复氧处理,黄连素组用黄连素预处理,对照组不做处理.MTT检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量,Western blot检测活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)、信号转导与转录因子3(STAT3)、磷酸化的STAT3(p-STAT3)表达.结果 模型组细胞存活率、p-STAT3水平、SOD含量均明显低于对照组,而细胞凋亡率、LDH含量、MDA含量和Cleaved Caspase-3水平均明显高于对照组(P<0.05).黄连素组细胞存活率、p-STAT3水平、SOD含量均明显高于模型组,而细胞凋亡率、LDH含量、MDA含量和Cleaved Caspase-3水平均明显低于模型组(P<0.05).结论 黄连素能够部分抑制缺氧复氧诱导的心肌细胞凋亡,并且对缺氧复氧抑制心肌细胞活性具有拮抗作用,其作用机制可能与细胞中STAT3信号通路有关.

蛋白激酶C在肝细胞缺氧预处理中的作用

目的:研究蛋白激酶C(PKC)在肝细胞缺氧预处理中的作用.方法:建立体外肝细胞缺氧预处理模型,应用PKC抑制剂白屈菜季铵碱(chelerythrine chloride,CHE)和激动剂豆蔻酸佛波酰乙酯(phorobol12-myristate13-acetate,PMA),通过检测PKC磷酸化活性,细胞存活率,同时在透射电镜下观察肝细胞超微结构改变,研究PKC的作用.对相关数据进行统计学处理.结果:和缺氧复氧组的PKC磷酸化活性(710.5±78.8)fkat/g比较,缺氧预处理组的PKC磷酸化活性(1823.7±2688.2)fkat/g和PKC激动剂组的PKC磷酸化活性(2541.2±326.5)fkat/g显著增高(P＜0.01),肝细胞结构损伤改变较小;和缺氧预处理组比较,PKC抑制剂组相应指标呈相反的变化,PKC磷酸化活性(1 088.0±89.3)fka/g(P＜0.01).结论:肝细胞缺氧预处理细胞保护作用中,PKC通路起到至关重要的作用.

培养心肌细胞缺氧复氧性损伤机制及ICAM-1MAb的干预研究

目的:探讨缺氧复氧性损伤的发生机制,澄清IL-1在损伤中的作用及ICAM-1MAb对损伤的影响.方法:新生Wistar大鼠50只,取其心肌细胞和主动脉内皮细胞培养,分离其外周血中性粒细胞,分设正常条件培养组,单纯缺氧复氧组(HR),正常培养+IL-1β(100 u/ml)刺激组,将以上3组再分别分为:不干预组和ICAM-1 MAb(100 ng/ml)干预组;于缺氧1 h复氧6 h,测定心肌细胞一氧化氮合酶(NOS),细胞胞浆游离钙([Ca2+]i),超氧化物歧化酶(SOD),丙二醛(MDA),还原型谷胱苷肽(GSH)和中性粒细胞与内皮细胞粘附率.结果:心肌细胞缺氧复氧时,[Ca2+]i、MDA显著增加,而SOD、GSH、NOS明显下降;IL-1β、ICAM-1蛋白质表达,中性粒细胞与内皮细胞的粘附率显著增加.IL-1干预刺激组的上述指标变化类似于缺氧复氧组.ICAM-1 MAb可明显改善SOD、GSH及NOS下降的程度和MDA增高的程度,降低中性粒细胞与内皮细胞的粘附率,但不能改善[Ca2+]i超载和IL-1β的表达水平,P＞0.05.结论:IL-1β通过直接或激活ICAM-1导致中性粒细胞与内皮细胞的粘附增加而引起细胞损伤,但钙超载,氧自由基和NO-NOS系统也共同参与了缺氧复氧性损伤.ICAM-1 MAb通过抑制中性粒细胞系统、减轻氧自由基产生、改善NOS代谢可部分减轻损伤.

HMGB1对缺氧复氧心肌细胞氧化损伤的影响研究

目的 研究高迁移率蛋白1(HMGB1)对缺氧复氧心肌细胞氧化损伤的影响.方法 构建H9C2细胞缺氧复氧损伤模型,ELISA法检测培养液上清中HMGB1水平,qRT-PCR检测细胞中HMGB1基因的转录水平.在H9C2细胞中转染HMGB1 siRNA后进行缺氧复氧处理,硫代巴比妥酸比色法检测细胞中丙二醛(MDA)含量,黄嘌呤氧化法检测细胞中超氧化物歧化酶(SOD)含量,二硝基苯肼显色法检测上清中乳酸脱氢酶(LDH)含量,流式细胞术测定细胞凋亡情况,Western blot测定细胞中剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)、Bc1-2相关X蛋白(Bax)、剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9(Cleaved Caspase-9)蛋白水平.结果 缺氧复氧后H9C2细胞中HMGB1转录水平升高,细胞分泌的HMGB1水平也升高,与正常培养的细胞相比,差异具有统计学意义(P＜0.05);细胞中转染HMGB1 siRNA后可以明显抑制HMGB1的转录和合成;敲低HMGB1可以降低缺氧复氧后的H9C2细胞中MDA水平,促进细胞中SOD合成,减少细胞释放LDH,降低细胞凋亡水平,减少Caspase-3、Caspase-9活化,促进Bax的表达,与单纯缺氧复氧的心肌细胞相比,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 缺氧复氧诱导心肌细胞合成HMGB1,敲低HMGB1可以减弱缺氧复氧诱导的心肌细胞凋亡,减轻氧化损伤.

p38MAPK信号通路的抑制减轻缺氧复氧环境下心肌细胞凋亡

目的 研究p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信号通路抑制剂对缺氧复氧诱导的心肌细胞凋亡的影响.方法 心肌细胞H9C2分为对照组(Con组)、缺氧复氧组(H/R组)、p38MAPK信号通路抑制剂SB203580组(SB203580组),Con组细胞正常培养,H/R组、SB203580组进行缺氧复氧处理,SB203580组细胞在缺氧前用p38MAPK信号通路抑制剂SB203580预处理24 h.噻唑蓝(MTT)检测细胞存活情况,流式细胞术检测细胞凋亡,二硝基苯肼显色法检测上清中乳酸脱氢酶(LDH)含量,用硫代巴比妥酸比色法检测细胞中丙二醛(MDA)含量,用黄嘌呤氧化法检测细胞中超氧化物歧化酶(SOD)含量,二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)法检测细胞中活性氧(ROS)含量,Western blot检测细胞中p38MAPK、磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)蛋白表达.结果 H/R组、SB203580组细胞存活率低于Con组,凋亡率高于Con组,细胞中MDA、ROS含量高于Con组,培养液上清中LDH高于Con组,细胞中SOD含量低于Con组,细胞中p-p38MAPK、Cleaved Caspase-3蛋白水平高于Con组.SB203580组细胞存活率高于H/R组,凋亡率低于H/R组,细胞中MDA、ROS含量低于H/R组,培养液上清中LDH低于H/R组,细胞中SOD含量高于H/R组,细胞中p-p38MAPK、Cleaved Caspase-3蛋白水平低于H/R组.结论 p38MAPK信号通路抑制剂能够减轻缺氧复氧环境下心肌细胞凋亡和氧化损伤.

缺氧复氧心肌细胞NF-κB活化调控iNOS基因表达及NO释放

N-乙酰半胱氨酸通过抑制活性氧-p38通路减轻缺氧复氧诱导的乳鼠心肌细胞凋亡

目的 探讨N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)抑制缺氧复氧(hypoxia-reoxygenation,H/R)诱导的乳鼠心肌细胞凋亡的机制.方法 心肌细胞培养48 h后随机分为对照组、缺氧复氧组(H/R组)、缺氧复氧+NAC组(100 p.mol/L)(H/R+NAC组).H/R组心肌细胞先缺氧6 h,随后复氧72 h,H/R+NAC组在H/R组细胞培养液中加NAC(100 μmol/L).采用锥虫蓝检测心肌细胞活性.流式细胞仪与Annexin V测定细胞早期凋亡.TUNEL检测细胞晚期凋亡.活性氧绿色荧光显色试剂检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)浓度.RT-PCR检测bcl2、bax基因mRNA水平.Western blot检测bel2、bax、p38与pp38基因蛋白水平.结果 H/R组有活性的细胞数量为74.9%,显著低于对照组(93.5%,P<0.01),H/R+NAC组有活性的细胞数为89.9%,显著高于H/R组(P<0.01).H/R组早期凋亡的心肌细胞数为25.2%,显著高于对照组(6.5%,P<0.01),H/R+NAC组早期凋亡的细胞数为11.1%,显著低于H/R组(P<0.01).H/R组晚期凋亡的心肌细胞数为33.5%,显著高于对照组(3.5%,P<0.01),H/R+NAC组晚期凋亡的细胞数为13.5%,显著低于H/R组(P<0.01).H/R组心肌细胞ROS产生显著高于对照组,H/R+NAC组心肌细胞ROS产生显著低于H/R组.H/R组pp38/p38条带密度比值(13.40)也显著高于对照组(3.89).H/R+NAC组pp38/p38条带密度比值(1.95)显著低于H/R组(13.4),P<0.01.H/R组bcl2 mRNA与蛋白水平显著低于对照组,bax mRNA与蛋白水平显著高于对照组.H/R+NAC组bcl2 mRNA与蛋白水平显著高于H/R组.H/R+NAC组bcl2/bax mRNA水平比值(1.79)显著高于H/R组(1.22),P<0.05,但仍低于对照组(1.85).H/R+NAC组bcl2/bax条带密度比值(0.71)显著高于H/R组(0.50),P<0.05,但仍低于对照组(2.53).结论 NAC通过抑制ROS-p38通路减轻缺氧复氧诱导的乳鼠心肌细胞凋亡,这一作用具有潜在的临床应用价值.