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梓醇促大鼠大脑皮质神经元轴突生长的离体研究
目的:观察梓醇对原代培养的新生SD大鼠皮质神经元生存活性及轴突生长的影响.方法:新生24 h内SD大鼠大脑皮质神经元原代培养6 d后,分为空白组、终浓度分别为0.25,0.5,1.0,2.5,5.0 mg·mL-1梓醇干预组和终浓度为1.0 mg·mL-1胞磷胆碱阳性药物对照组.药物干预48 h后,观察细胞生长情况,用NF-200免疫组化染色鉴定神经元,MTT法检测神经元生存活性,测微尺测量神经元轴突长度.结果:梓醇终浓度在1～5 mg·mL-1时,可明显促进神经元轴突生长,2.5 mg·mL-1时作用强;梓醇各浓度组神经元生存活性与空白组和胞磷胆碱组差异无显著性.结论:梓醇能明显促进皮质神经元轴突生长,但对其生存活性无显著影响.
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步长脑心通含药血清抗缺氧诱导的皮质神经元凋亡的实验研究
目的 运用中药血清药理学方法研究步长脑心通抗缺氧诱导的原代皮质神经元凋亡的作用.方法 培养出生24h内SD乳鼠大脑皮质神经元,第7天以不同浓度步长脑心通含药血清处理后制造缺氧模型,定性定量检测细胞凋亡:MTT法观察神经元活力;Hoechst33258染色分析细胞核形态的变化;琼脂糖凝胶电泳分析DNA断裂,进一步验证和检测细胞凋亡.结果 步长脑心通含药血清处理后缺氧神经元活力增加,缺氧所致神经元凋亡明显减少.结论 步长脑心通对缺氧引起的皮质神经元凋亡有抑制作用.
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二十二碳六烯酸降低β淀粉样蛋白25-35致大鼠皮质神经元损伤
目的 观察二十二碳六烯酸(DHA)对β淀粉样蛋白25-35(Aβ25-35)致原代培养大鼠皮质神经元损伤的保护作用.方法 原代培养Wistar大鼠皮质神经元,先后给予不同剂量的DHA(20、50和100μmol/L)及Aβ25-35(25 μmol/L),用CCK-8比色法观察神经元存活率,用激光扫描共聚焦显微镜观察细胞内游离钙离子浓度.结果 1)与对照组相比,Aβ25-35使细胞存活率明显下降(31％±6％,P＜0 05)；使细胞内游离钙离子浓度明显升高( 249％±12％,P＜0 05)；2)孵育DHA可降低Aβ25-35引起的神经元存活率明显下降及细胞内游离钙离子浓度升高.结论 Aβ致细胞内钙超载是Aβ产生神经毒作用的一个方面,而DHA可部分拮抗Aβ25-35的神经毒作用.
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氯胺酮诱导原代培养大鼠皮质神经元凋亡
＿＿发育期大鼠反复使用氯胺酮可导致大脑神经细胞的大量凋亡，影响幼鼠成年后的学习记忆功能［1－2］。因此研究氯胺酮对发育期大脑的影响具有重要的临床意义。本研究观察氯胺酮对发育期皮质神经元凋亡的影响并探讨可能机制。
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13-甲基十四烷酸对氧反常诱导大鼠胚脑皮质神经元凋亡和形态学损伤的保护作用
目的 探讨13-甲基十四烷酸(13-MTD)对氧反常诱导大鼠胚脑皮质神经元凋亡和形态学损伤的保护作用.方法 原代培养大鼠胚脑皮质神经元,并以神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫荧光法鉴定.将神经细胞随机分为正常对照组、模型组和不同剂量13-MTD组,每组设6个复孔.氧糖剥夺3h/再复氧糖24h(OGD3h/R24h)方法制备神经元氧反常模型,于再复氧糖即刻分别给予13-MTD 5、10、20、40mg/L干预.倒置相差显微镜下观察神经细胞形态改变;磺酰罗丹明B(SRB)法测定神经细胞存活率;吖啶橙/溴乙啶(AO/EB)染色法观察神经细胞凋亡;透射电子显微镜下观察神经元超微结构的改变.结果 与正常组比较,模型组神经元呈现病理改变,神经细胞存活率显著下降(P＜0.01),细胞凋亡显著增多(P＜0.o1),神经元超微结构损伤明显,可见核内染色质边集或凝聚成块状,胞质内细胞器明显减少甚至消失,线粒体肿胀、嵴断裂甚至消失等;与模型组比较,不同剂量的13-MTD可有效改善上述变化(P＜0.05,P＜0.01),使神经元形态及其超微结构损伤明显恢复,且存在剂量依赖关系,以13-MTD 20mg/L改善更显著(P＜0.01).结论 13-MTD对氧反常诱导的大鼠胚脑皮质神经元损伤具有明显保护作用,其可能通过改善神经细胞形态和线粒体超微结构损伤,减少神经元凋亡,提高细胞存活率.
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血管内皮生长因子解除V亚型分泌型磷脂酶A2协同增强的谷氨酸诱导的皮质神经元毒性作用
目的:探讨血管内皮生长因子及分泌型磷脂酶A2对谷氨酸诱导增强的神经元死亡的不同作用.方法:原代胚胎鼠皮质神经元细胞培养,细胞毒性试验及生化指标测定,细胞染色,显微镜下观察形态学改变及影像分析.结果:不同浓度的谷氨酸12.5、25、50、100μM可单独增加胚胎鼠皮质神经元死亡且呈剂量及年龄依赖关系.V亚型分泌型磷脂酶A2可协同增强谷氨酸所致神经元死亡.不同浓度的血管内皮生长因子10、30、100ng/ml对分泌型磷酯酸酶A2协同增加的谷氨酸神经元毒性有解除作用且呈剂量依赖关系.结论:血管内皮生长因子可解除分泌型磷脂酶A2协同增加的谷氨酸诱导的皮质神经元毒性作用.
关键词： 血管内皮生长因子 V亚型分泌型磷脂酶A2 谷氨酸 皮质神经元 细胞死亡 -
淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方对阿尔茨海默病转基因小鼠大脑皮质神经元 DMT1、FPN1的影响
目的：：观察淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方对阿尔茨海默病APPswe/PS1△E9双转基因小鼠模型大脑皮质神经元DMT1、FPN1表达情况的影响,探讨淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方对阿尔茨海默病小鼠大脑皮质的保护作用及其机制。方法：6月龄雄性APPswe/PS1△E9双转基小鼠60只,随机分为6组,模型组、淫羊藿组、黄芪组、葛根组、复方组、DFO组,每组各10只。6月龄雄性C57 BL/6 J小鼠10只作为正常对照组。淫羊藿组小鼠灌胃给予淫羊藿苷水溶液,黄芪组灌胃给予黄芪甲苷水溶液,葛根组灌胃给予葛根素水溶液,复方组灌胃给予淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方,DFO组肌肉注射DFO,模型组和阴性对照组小鼠灌胃给予等量生理盐水。连续给药3个月,取各组小鼠脑组织,分别采用免疫组织化学、Real time PCR和Western方法检测各组小鼠大脑皮质DMT1和FPN1的表达情况。结果：免疫组织化学结果显示：阴性对照组均未见DMT1及FPN1阳性细胞。与正常对照组相比,模型组DMT1的表达增高,模型组FPN1的表达降低；与模型组相比,复方组和DFO组DMT1的表达降低,模型组和DFO组FPN1的表达增高；与DFO组相比,复方组DMT1和FPN1的表达无明显差异。 Real time PCR结果、Western结果与免疫组化结果相一致。结论：应用淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方可以下调AD小鼠大脑皮质DMT1的表达,上调AD小鼠大脑皮质FPN1的表达,从而抑制AD小鼠脑铁超载,缓解铁超载带来的中枢神经系统功能衰退。
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帕金森病相关认知损害的生物标记物
帕金森病（Parkinson′s disease）是仅次于阿尔茨海默病第二常见的神经系统变性病。除黑质纹状体系统变性引起运动障碍症状外，非运动症状如嗅觉缺失、便秘、抑郁、自主神经功能衰竭、快动眼睡眠行为异常及认知损害等是帕金森病重要的临床组成部分［1］。帕金森病相关性认知损害包括轻度认知损害、帕金森病伴痴呆两种状态，是帕金森病非运动症状的主要表现形式之一，点患病率约为20％～50％［2］。80％的帕金森病患者合并存在认知损害，给患者及看护者带来沉重负担。轻度认知损害在无痴呆帕金森病患者中相当普遍，其发生率高达27％［3］。轻度认知损害患者转化为痴呆的风险明显增加。某些新发的帕金森病患者在初诊时便存在轻度认知损害，随年龄增加、病程延伸及病情严重程度增加轻度认知损害发生率逐渐升高。轻度认知损害可表现为多认知域损害，非遗忘型单认知域轻度认知损害较遗忘型单认知域轻度认知损害更常见。与路易体痴呆相似，帕金森病相关性认知损害的主要病理改变是新皮层及边缘叶皮质神经元内存在路易体，后者是一种富含α突触核蛋白（α-synuclein ）胞浆内神经元包涵体。部分帕金森病伴痴呆与阿尔茨海默病重叠，阿尔茨海默病典型的病理改变如神经纤维缠结和淀粉样蛋白斑形成可见于部分帕金森病伴痴呆患者，从而使部分帕金森病伴痴呆与阿尔茨海默病鉴别困难。早期识别帕金森病相关性认知损害并进行及时干预对改善帕金森病患者预后及生活质量、减轻患者及看护者负担具有重要意义。
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β淀粉样蛋白25-35诱导皮质神经元tau蛋白过度磷酸化
目前阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)研究仍缺乏理想的动物模型,细胞模型通过复制AD的某些分子生化改变,可用于研究AD的发病机制和筛选治疗药物.脑内β淀粉样蛋白(Aβ)的大量沉积和tau蛋白过度磷酸化是AD的两大主要分子生化改变.淀粉样瀑布学说认为Aβ可直接诱导神经元tau蛋白过度磷酸化.我们于2002年6月至2004年2月采用Aβ的生物活性片段Aβ25-35作用于胎鼠脑皮质神经元,观察Aβ25-35是否也能诱导tau蛋白过度磷酸化,并探讨其作用的可能机制.
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经颅磁刺激技术在研究工作记忆中的应用
一、经颅磁刺激概述经颅磁刺激(transcranial magnetic stimulation,TMS)是一种无电极刺激形式,通过颅外放置的电磁刺激器在大脑皮质诱导产生感生电流直接刺激特定的皮质神经元,受到刺激的皮质产生瞬间可逆性功能障碍,可看作是一种"虚拟性损毁".对比磁刺激前后发生的功能变化,可以粗略了解和判断特定时刻所刺激的皮质结构的脑功能.重复经颅磁刺激(rTMS)是在TMS基础上发展起来的一项新技术,与单脉冲TMS(sTMS)比,rTMS不仅影响刺激局部和功能相关的远隔皮质功能,而且产生的生物学效应可持续到刺激停止后一段时间,已成为研究神经网络功能重建的良好工具[1,2].
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老年前期痴呆发病机制和抗炎治疗的研究进展
老年前期痴呆又称阿尔茨海默病,属于神经细胞退行性变疾病,约占所有痴呆病人的50%～60%.主要病理改变为脑皮质神经元纤维缠结、神经炎性斑(老年斑)和神经细胞死亡,但其真正病因目前仍不十分清楚.抗炎治疗能延缓老年前期痴呆的发病时间和减慢病程进展,作者就此研究进展作一介绍.
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阿托伐他汀通过激活PI3K/Akt/mTOR信号转导而促进神经元突起生长
目的 探讨阿托伐他汀(Ato)对体外培养大鼠皮质神经元突起生长促进作用的信号转导机制.方法 取培养7 d大脑皮质神经元,分为Ato 10 μmol·L-1作用48 h组和阻断剂+Ato组,先分别加入阻断剂PD98059 50 μmol·L-1、LY294002 30 μmol·L-1、曲西立滨(TCBN)2.5 μmol·L-1和西罗莫司(雷帕霉素,Rapa) 100 nmol·L-1作用1 h,再加入Ato共同作用48 h.应用倒置相差显微镜观察神经元突起生长状况;Western 印迹法检测磷酸化的磷酸肌醇依赖激酶1(PDK1)、磷酸化蛋白激酶B(Akt)、磷酸化西罗莫司靶蛋白(mTOR)、磷酸化的核糖体S6激酶(p70S6K)和磷酸化的真核翻译起始因子4E结合蛋白 1(p-4E-BP1)的表达.结果 形态学观察结果显示,Ato 10 μmol·L-1组可明显促进突起生长,表现为突起总长度增加、一级突起数目增多、末端分支数增多及胞体面积增大.PD98059,LY294002,TCBN和Rapa均可阻断Ato对神经元突起生长的促进作用.Western印迹结果显示,Ato 10 μmol·L-1可显著上调p-PDK1,p-Akt(Ser473),p-mTOR,p-p70S6K和p-4E-BP1蛋白表达水平(P<0.01).LY294002可显著阻断Ato引起的p-PDK1,p-Akt(Ser473) 蛋白表达水平增加(P<0.01).TCBN 可显著阻断Ato引起的p-mTOR蛋白表达水平增加(P<0.01).Rapa可明显阻断Ato引起的p-p70S6K和p-4E-BP1蛋白表达水平增加(P<0.01).结论 Ato对体外培养皮质神经元突起发育的促进作用可能与激动MEK/ERK信号转导通路有一定的关系,主要可能与通过激活PI3K/Akt/mTOR信号转导通路有关.
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Sertoli细胞对体外培养的大脑皮质神经元的营养作用
为研究睾丸支持细胞(Sertoli cells,SCs)对体外培养的大脑皮质神经元的营养作用,采用2种实验方法:1)将Sertoli细胞与大脑皮质神经元共培养;2)在神经元培养基内添加Sertoli细胞条件培养基(Sertoli preconditioned medium,SCM).结果:在培养早期SCs能显著促进大脑皮质神经元的贴壁,对神经元胞体及突起的生长也有显著的效果,培养晚期SCs组的神经元生长状况也显著优于DMEM培养组和SCM组,说明SCs对神经元有显著的促生长作用;同时实验还证实SCM对神经元在体外的生长也具有一定的促进作用.
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分离大鼠大脑皮质神经元长时程单细胞内Ca2+的测定
采用酶解结合机械分离方法,急性分离生后6～7 d的SD大鼠的大脑皮质神经元;用Fura -2作为钙离子指示剂,用M40 钙离子测量系统(PTI)长时程测量单个细胞内钙离子浓度的变化.以激发光波长340 nm和380 nm时510 nm处的荧光发射强度比率(340/380)显示胞内C a2+ 浓度的动态变化.用高K+ (60 mmoL/L)、低K+(1 mmol/L)、氨甲酰胆碱(Carbachol, 108～107 mmol/L)作为刺激物,观察胞内Ca2+浓度的变化.结果发现,高K+ 引起去极化刺激,导致Ca2+浓度迅速增加,在去除刺激后自动恢复正常;低K+和 Carbachol能诱发自发钙震荡;且63个细胞中37个有自发Ca2+浓度震荡现象,震荡的频率和幅度不尽相同.结果提示,急性分离的单个神经元可用于Ca2+浓度测定,神经元在无突触联系存在的情况下可诱发或自发钙震荡.
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灯盏花素对谷氨酸体外诱导大鼠皮质神经元损伤的保护作用
目的 探讨灯盏花素对谷氨酸(Glu)体外诱导原代培养大鼠皮质神经元损伤的作用及机制.方法 通过MTT法观察灯盏花素对Glu诱导神经元损伤的细胞存活率的影响,并结合超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)生化测试及细胞钙影像方法探讨相关作用机制.结果 灯盏花素呈质量浓度依赖性提高Glu诱导神经元损伤细胞的存活率,并拮抗由Glu诱导的[Ca2+];升高、MDA生成,提高SOD活性.结论 灯盏花素对Glu体外诱导大鼠皮质神经细胞损伤具有保护作用,可能与减轻胞内Ca2+超载、提高神经细胞抗氧化能力有关.
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黑海参多糖对β-淀粉样蛋白诱导的皮质神经元凋亡的保护作用
体外培养大鼠皮质神经元,用β-淀粉样蛋白(β-AP)诱导皮质神经元凋亡.黑海参多糖使皮质神经元存活率增加,使神经元的DNA电泳图谱不出现"梯子状",使神经元的流式细胞仪分析图上不出现凋亡峰,表明黑海参多糖对β-AP诱导的皮质神经元凋亡具有保护作用.
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永磁磁场对胎鼠大脑皮质神经元细胞的影响
目的;以磁源空间磁场定量计算为依据,研究不同强度永磁磁场对胎鼠大脑皮质神经元细胞的影响.方法:选取极面中心磁感应强度为3.9、8.0、12.1、20.5、27.0、80.0、170.0、400.0 mT的8组圆片磁源(即A、B、C、D、E、F、G、H组),采用有限元数值法计算其空间磁场,得出磁感应强度.取孕17d胎鼠大脑,分离皮质神经元细胞;将8种不同磁感应强度的磁源分别作用于大鼠脑皮质神经元细胞进行体外培养,6d后分别用四甲基偶氮唑盐(MTT)法和乳酸脱氢酶(LDH)法检测细胞活力.设非加磁培养大鼠脑皮质神经元细胞为空白对照组.对各组大鼠脑皮质神经元细胞做统计学分析.结果各加磁组皮质神经元细胞光密度(OD)(A组1.204±0.003,B组1.210±0.003,C组1.202±0.004,D组1.220土0.001,E组1.172±0.002,F组1.223±0.012,G组1.235±0.010,H组1.028±0.060)均比空白对照组OD(1.275±0.002)低,其中A、B、C、D、E、H组与空白对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05或0.01),F,G组与空白对照组差异无统计学意义(P>0.05);各加磁组皮质神经元细胞上清液中LDH水平(A组13.33±0.33,B组12.33±0.33,C组8.33±2.33,D组10.67±2.33,E组11.33±4.33,F组10.00±1.00,G组9.00±0.30,H组9.67±0.33)均比空白对照组LDH水平(8.330±0.003)高,其中A、B、D、E、F、H组与空白对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05或0.01),C,G组与空白对照组差异无统计学意义(P>0.05).结论:实验所使用各磁感应强度组磁场对胎鼠大脑皮质神经元细胞代谢有一定抑制作用.
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氧化应激诱发大脑皮质神经元凋亡的体外实验研究
既往研究表明,神经细胞死亡容易坏死而较少发生凋亡,1994年,Ratan等培养神经细胞发现有大量神经元发生凋亡,但其凋亡机制尚不清楚.本实验采用氧化应激方法作用于原代培养的新生大鼠大脑皮质神经元,并进行凋亡指标的检测,以对其凋亡机制进行探讨.
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利多卡因对谷氨酸致大鼠大脑皮质神经元损伤的保护作用研究
脑缺血、缺氧时大量兴奋性氨基酸(EAA)尤其是谷氨酸(Glu)爆发性释放,EAA过度激活,使某些受体在正常生理刺激下引起第二信使效应放大,突触后神经元过度兴奋、溃变、坏死.这就是所谓的兴奋性毒性[1].目前Giu的兴奋性毒性作用于缺血性脑损害的研究多.脑缺血时突触前Glu释放增加.再摄取减少,导致N-甲基-D-天门冬氨酸受体过度兴奋,Ca2+大量内流.产生离子依赖性兴奋性毒性.我们前期的研究和文献报道显示,临床上常用药物纳洛酮、神经生长因子、异丙酚和依达拉奉等对神经细胞均有保护作用[2-4];而利多卡因在
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乳鼠脑皮质神经元的培养方法
离体原代神经元培养是研究神经元损伤和药物作用的模型,目前关于神经元培养方法多种多样[1].2009年4月至11月本课题组通过157只新生24 h SD大鼠大脑皮质神经元原代培养,并借助倒置相差显微镜和透射电镜观察其形态学、超微结构变化,以及四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法测定神经元存活率等指标,寻求一种简单、高效的培养方法,为神经系统的体外研究提供实验依据.
