首页 > 文献资料
-
丙戊酸钠调节组蛋白乙酰化对肝癌细胞浸润转移影响的研究
目的:探讨应用组蛋白脱乙酰酶(his-tone deacetylase,HDAC)抑制剂丙戊酸钠(val-proate acid sodium,VPA)调节组蛋白乙酰化水平对肝细胞性肝癌细胞侵袭、迁移能力的影响及其可能作用机制.方法:采用肿瘤细胞体外迁移实验和Transwell小室体外侵袭模型评价HDAC抑制剂VPA对HepG2细胞浸润转移能力的影响.进一步应用间接免疫荧光技术检测HepG2细胞MMP-2、MMP-9蛋白表达来探讨其作用机制.结果:细胞培齐24 h后,对照组迁移细胞数目较多,为(142±16.5)个,而(0.75～4.0)mmol/L VPA试验组细胞迁移数目随药物浓度升高而逐渐由(125±12.4)个减少(42±6.1)个,差异有统计学意义,P<0.001;对照组穿过聚碳酯膜细胞数目(85±7.8)个,明显高于药物实验组(69±6.9～18±3.6)个,差异有统计学意义,P<0.001;与对照组比较,试验组MMP-2、MMp-9蛋白表达被明显下调,并且与肿瘤细胞迁移、侵袭的变化密切相关.结论:应用HDAC抑制剂逆转染色体组蛋白低乙酰化水平可显著抑制肝癌细胞侵袭转移,下调MMP-2和MMP-9表达可能是其发挥作用的主要机制之一.
-
miR-20a通过靶向抑制PTEN诱导肝癌细胞放射抵抗
目的 探讨miR-20a在肝癌放射敏感性中的作用及机制.方法 荧光定量PCR检测肝癌细胞系和组织标本中miR-20a的表达;构建稳定过表达miR-20a肝癌细胞系,通过克隆实验探讨miR-20a对肝癌细胞放射敏感性影响;蛋白印记法检测Bcl-2、Caspase-3以及 γ-H2AX的表达;生物信息学预测miR-20a下游调控的靶基因,双荧光素酶报告系统、荧光定量PCR及蛋白印记法进一步验证;在稳定过表达miR-20a的肝癌细胞系中转染pCDNA3.0-PTEN探讨细胞放射敏感性的变化,明确PTEN是否为miR-20a诱导肝癌放射抵抗的一个功能性靶基因.结果 miR-20a在肝癌细胞系和组织标本中表达上调(P<0.05);经过同等条件的放射处理后,与空白及对照组(WT组、LV-con组)相比,过表达miR-20a组(LV-miR-20a组)细胞存活分数升高,放射抵抗增强(P<0.05),Bcl-2表达上调,Caspase-3及 γ-H2AX表达下调;过表达PTEN能够逆转miR-20a引起的放射抵抗.结论 miR-20a在肝癌细胞系及组织标本中表达上调;过表达miR-20a可以促进肝癌细胞放射抵抗,PTEN是miR-20a诱导肝癌放射抵抗的一个功能性靶基因,预示着miR-20a/PTEN位点可能是是肝癌临床放疗相关的有效分子靶点.
-
CCR4对肝癌细胞索拉非尼放射敏感性及裸鼠成瘤的影响
目的 探讨CC趋化因子受体4(CCR4)对肝癌细胞索拉非尼放射敏感性及裸鼠成瘤的影响.方法 采用Western blot检测CCR4在肝癌细胞系中的表达.利用慢病毒感染构建过表达及敲减CCR4的PLC/PRF/5和SMMC-7721稳转株,并采用Western blot进行验证.采用平板克隆形成实验检测CCR4对肝癌细胞放射敏感性的影响.通过裸鼠成瘤实验检测CCR4对肝癌细胞体内成瘤的影响.结果 高转移肝癌细胞中CCR4呈高表达,低转移肝癌细胞中CCR4呈低表达.成功构建稳定过表达CCR4的PLC/PRF/5和敲减CCR4的SMMC-7721肝癌稳转株,过表达CCR4可逆转索拉非尼放疗对PLC/PEF/5的抑制作用,而敲减CCR4可增加SMMC-7721对索拉非尼放射敏感性.过表达CCR4可促进PLC/PEF/5裸鼠体内成瘤能力,而敲减CCR4可抑制SMMC-7721裸鼠体内成瘤能力.结论 CCR4高表达能显著增强肝癌PLC/PEF/5细胞对索拉非尼放射抵抗及裸鼠体内成瘤能力,而敲减CCR4则可显著增加肝癌SMMC-7721细胞对索拉非尼放射敏感性并抑制其裸鼠体内成瘤能力.
-
参桃软肝丸对人肝癌细胞HepG-2细胞凋亡基因影响随机平行对照研究
[目的]观察参桃软肝丸对人肝癌细胞HepG-2细胞凋亡基因影响.[方法]将雄性新西兰家兔分为3组,每组3只.连续灌胃给药3d,2次/d,第3d给药2h后同剂量追加给药1次.参桃软肝丸组:成人口服剂量10倍.空白血清组:等量生理盐水.阳性药物对照组(5-氟尿嘧啶组),每日药液41.67mg/kg/day.后灌药后1h(灌药前禁食不禁水12h),乙醚麻醉,75％乙醇局部消毒,心脏采血,无菌分离血清,3000 r/min离心20min.同组家兔药物血清混匀,水浴灭活处理,保存备用.MTT显色法取1×104浓度的人肝癌细胞接种于96孔的细胞培养板中,每孔100ul,设八复孔.置于含5％ C02 37℃培养箱中培养24h,至细胞生长旺盛后,加入含药血清10％、20％、30％浓度的培养液各200uL,继续培养24～ 72h,加人20uL浓度为5mg/mL的MIT,继续培养4h,加入DMSO100uL,回旋振荡器振荡10min,于酶联仪长570nm处测各孔吸光度值,计算抑瘤率.ELISA法检测凋亡调控基因突变型P53、bcl-2.[结果]参桃软肝丸组合药血清30％、20％、10％浓度均对突变型P53有抑制作用,三种浓度对突变型P53的抑制与阳性组和空白组比较有统计学意义(P＜0.01).三种浓度含药血清对bcl-2的抑制与阳性组和空白组比较无统计学意义,但数值有下降趋势.三种浓度中以20％浓度对突变型P53、bcl-2抑制效果好.[结论]参桃软肝丸抗肿瘤作用机制之一可能是对突变型P53、bcl-2基因抑制.
-
RPMI-1640和DMEM培养基中肝癌细胞系BEL-7402与HepG-2的生长状态比较
背景:DMEM和RPMI-1640是两种常用的商品化培养基,二者对肝癌细胞生长的影响尚未见直接的对比研究.目的:比较两种常用培养基对人肝癌BEL-7402与HepG-2细胞系体外生长和增殖效果的影响,从中选择更适合的培养基.方法:分别应用高糖DMEM与RPMI-1640完全培养液培养BEL-7402和HepG-2细胞,于培养的0,24,48,72,96,120 h用酸性磷酸酶检测法测定细胞生长和增殖速率,并于倒置显微镜下观察细胞的形态.结果与结论:结果发现BEL-7402和HepG-2细胞在RPMI-1640培养基中的生长增殖速率均明显高于DMEM培养基 (P < 0.01).镜下观察证实细胞在RPMI-1640培养基中的黏附和伸展状态更好.因此,建议首选RPMI-1640培养基进行肿瘤细胞体外培养.
-
核转录因子HMBOX1对肝癌细胞生物学特征的影响
目的:比较肝癌细胞系与肝细胞系中HMBOX1的表达水平,探讨其在肝癌发生、发展中的作用.方法:RT-PCR检测HMBOX1在多种肝癌细胞系和正常肝细胞系中的表达.利用分子生物学方法构建pEGFP:HMBOX1融合表达载体,采用脂质体方法转染HepG2肝癌细胞系,MTT方法及流式细胞技术评价转染后细胞增殖和细胞周期的变化.基因芯片技术分析表达载体转染HepG2后肿瘤相关信号通路的变化.结果:PCR结果显示肝癌细胞系HMBOX1 mRNA表达水平明显低于正常肝细胞系;pEGFP:HMBOX1融合表达载体转染HepG2后,细胞的增殖能力和周期未出现显著变化;基因芯片的结果提示转染表达载体的HepG2细胞,肿瘤和免疫信号通路相关基因的表达发生显著变化.结论:HMBOX1在多种肝癌细胞系表达下调,可能参与了多条与肿瘤和免疫相关信号通路的调节,为进一步阐明肝癌的发生机制提供了新的实验依据.
-
化疗药与维拉帕米、利多卡因和法莫替丁联用对肝癌细胞系的影响
原发性肝癌是常见恶性肿瘤之一,临床对于多数中晚期恶性肿瘤患者往往缺少有效的治疗手段;介入治疗近年来以其可靠的疗效及较低的并发症逐渐成为中晚期原发性肝癌的首选治疗方法;我科近年来行肝动脉留管持续化疗,取得满意效果;据文献报告,维拉帕米[1]可以逆转癌细胞对多种化疗药的耐药性,利多卡因、H2受体阻断剂[2]与化疗药有协同作用,本实验研究动脉化疗常用的化疗药与这3种药物对肝癌细胞系的影响.
-
下调PAI对HpG2细胞组织型纤溶酶原激活物和尿激酶纤溶酶原激活物的影响
目的 探讨纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)的发卡样小干扰RNA(siRNA)真核表达载体对人肝癌HpG2细胞组织型纤溶酶原激活物(tPA)和尿激酶PA(uPA)表达的影响.方法 设计短发夹状PAI siRNA的寡核苷酸链,将其插入到真核细胞表达载体pSilencerTM 2.1-U6 neo载体中构建重组载体后,采用脂质体转染方法将构建的重组载体导入人肝癌细胞HpG2中,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western印迹法分别检测转染细胞PAI mRNA和蛋白对tPA和uPA表达的影响.结果 转染后细胞中PAI含量降低,tPA和uPA的表达减少(均P＜0.01).结论 测序结果表明发卡样的PAI siRNA真核表达载体转染HpG2细胞后获得稳定表达,并可特异性封闭PAI的表达,PAI siRNA能有效阻断PAI的蛋白合成,同时抑制细胞中tPA和uPA的表达.
-
利多卡因对抗肿瘤药物的增敏作用研究
目的:研究利多卡因对3种化疗药物的增敏作用.方法:微量细胞培养四氮唑(MTT)法检测肝癌细胞系SSMC 7721对3种抗癌药物5-氟脲嘧啶(5-FU)、丝裂霉素(MMC)和顺铂(CDDP)的敏感性.结果:SSMC 7721对3种化疗药物(5-FU、MMC及CDDP)均敏感.结论:利多卡因对这3种化疗药物均有明显增敏作用.
-
高表达ABCG2基因对人原发性肝癌细胞SP表型的影响
目的 研究高表达ABCG2基因对人原发性肝癌细胞SP表型的影响.方法 构建pMSCVpuro-ABCG2逆转录病毒质粒,并转染至病毒包装细胞PT67中,将获得的病毒上清液感染人原发性肝癌non-SP(Side population)细胞,筛选稳定感染的细胞系non-SP-ABCG2和non-SP-puro,RT-PCR法检测细胞中ABCG2基因的转录水平,Western blot法检测细胞中ABCG2蛋白的表达水平,显微镜观察细胞形态的变化,Hoechst33342染色分析细胞的SP表型.结果 逆转录病毒质粒pMSCVpuro-ABCG2经双酶切及测序证实构建正确；non-SP-ABCG2细胞中ABCG2基因的转录和蛋白表达水平均较空载体pMSCVpuro转染的细胞non-SP-puro明显提高；non-SP-ABCG2细胞的形态发生改变,成梭形生长,偶见小三角样细胞,细胞生长缓慢,细胞间排列不紧密,并出现了SP表型.结论 ABCG2基因的高表达与细胞SP表型的形成具有一定的相关性,并能影响细胞的基本形态.
-
乙型肝炎病毒持续性感染防治策略的研究进展
HBV持续感染与肝细胞癌(HCC)的发生密切相关，其HCC发病率是无HBV感染者的100倍。 全世界每年死于慢性乙肝的人约100多万，死于与HBV感染相关的HCC的人约10万人，HBV持续性感染严重影响着人们的心身健康。因此，控制HBV持续性感染倍受重视。本文将近年来有关防治HBV持续感染的研究进展概述如下。 一、反义核酸与核酶用于治疗 反义核酸HBV作用的研究很多，多为体外研究，也有用鸭肝炎病毒模型的。所用的反义核酸，多数为反义mRNA，也有用反义DNA的。反义核酸所针对的HBV基因组特异性靶序列包括Pres、SPreC、C及P区，包装信号区或polyA加尾信号区等[1]。用这些区段特异性的反义mRNA或DNA，经载体转染或感染导入整合有HBVDNA并表达HBV抗原的肝癌细胞系后，对HBV基因表达与复制有不同程度的抑制作用，抑制率往往在40％以下，用反义DNA寡核苷酸预处理无HBV基因整合的肝癌细胞，再转染HBV质粒发现反义DNA对HBV基因的与复制有明显的抑制作用。对基因转录与HB-sAg合成的抑制率分别为60％和97％，作者认为这对肝移植后肝炎有治疗意义[2]。 用HBV核心区临近部位多靶位核酶在体外能有效地切割HBVRNA。因为HBV基因突变率高，HBV基因的突变形成了免疫逃避株[3]，用常规的乙肝疫苗免疫往往失败，从而为HBV持续性感染创造了条件。这种情况采用多靶位核酶可能有效。多靶位切割可能更有效。细胞内可能有抑制核酶切割活性的因子存在，用针对HBV前基因组RNA保守的包装信号靶序列的锤头状核酶所做的研究表明，该核酶对外合成的HBVRNA和细胞提取物HBVRNA有明显的切割作用，
-
5-Fu不同作用方式对肝癌细胞凋亡的影响
目的观察5-Fu不同作用时间、不同作用浓度对肝癌细胞凋亡的影响.方法将我院自建的肝癌细胞系HHC98加入培养皿中,分三大组,每大组人为四小组,一小组为生理盐水对照,其余三小组与5-Fu混合培养,浓度分别为0.01mg/ml,0.1mg/ml,1.0mg/ml.三大组的培养时间分别为1.5小时、15小时、30小时.结果0.1mg/ml培养30小时引起HHC98肝癌细胞系大的凋亡比例为32.04±5.38%,1.0mg/ml培养30小时引起HHC98肝癌细胞系大的死亡比例为24.15±3.33%.结论5-Fu为时间依赖性药物,适当的浓度,随着时间的延长可以引起肝癌细胞很好的凋亡.
-
雄黄对肝癌细胞系BEL-7402增生的影响
雄黄辛温有毒,入肝胃经,其成分为硫化砷.近年来,雄黄在治疗急性早幼粒细胞白血病方面取得了令人著目的的成就[1],而其诱导导细胸凋亡的作用可能是疗效机制[2、3].
-
miR-375靶向调控YAP表达对肝癌细胞增殖和侵袭能力的影响
目的:探讨miR-375靶向调控Yes相关蛋白(Yes-associated protein,YAP)的表达对肝癌细胞增殖和侵袭能力的影响.方法:收集2015年1月至2016年12月河南中医药大学第二附属医院普外二科行手术切除的70例肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者的癌组织及对应的癌旁组织标本,以及肝癌细胞系SMMC-7721、Hb611、HepG2和BEL-7405,用qPCR法检测HCC癌组织和肝癌细胞中miR-375的表达水平.双荧光素酶报告基因检测miR-375与YAP的相互作用;分析miR-375和HCC患者的临床病理特征之间的关系,MTT法检测miR-375对肝癌细胞增殖能力的影响,Transwell小室法检测抑制miR-375表达后HCC细胞侵袭能力的变化;Western blotting检测HepG2细胞中YAP的表达.建立裸鼠肝癌皮下移植瘤模型,观察抑制miR-375表达后移植瘤体积和质量的变化,免疫组化法和Western blotting检测裸鼠移植瘤中YAP的表达情况.结果:HCC组织中miR-375和YAP表达水平明显高于癌旁组织(均P＜0.05),肝癌HepG2细胞中miR-375的表达水平高(P＜0.05).miR-375能与YAP的3' UTR特异性结合,调控YAP的表达活性.抑制miR-375的表达后,HepG2细胞增殖、侵袭的能力显著减弱(均P＜0.05),裸鼠移植瘤体积和质量都明显减小(均P＜0.05),移植瘤组织细胞中YAP的表达水平相应下调(P＜0.05).结论:miR-375在肝癌的发生发展过程中起重要作用,可以通过靶向调控YAP的表达影响肝癌细胞的恶性生物学行为.
-
人肝癌细胞系EH-H1的建立及其相关生物学特性
目的: 采用原代培养的方法建立一株人肝癌细胞系EH-H1,并对其生物学特性进行分析.方法:将取自东方肝胆外科医院诊断为原发性肝细胞癌的组织标本分离成单细胞悬液,用含10%胎牛血清的DMEM培养液进行原代和传代培养,在普通显微镜以及电子显微镜下观察细胞的形态,并绘制细胞的生长曲线.用放射免疫法检测细胞系AFP和HBV的含量,采用染色体G显带方法进行细胞染色体核型的分析,裸鼠皮下接种细胞检测该细胞的成瘤能力. 结果:成功建立一株新的人肝癌细胞系,命名为EH-H1.EH-H1细胞体外连续传代80代以上,细胞形态不变,生长周期恒定在24 h.放射免疫检测EH-H1各代细胞HBV均为阴性,AFP分泌微量(0.6 μg/L) .染色体G带显示,EH-H1细胞染色体为非整倍体,以超2倍体为主.该细胞经皮下接种可使裸鼠致瘤(10/10),移植瘤病理组织学类型和分化程度与肝细胞癌一致.结论: 通过原代培养建立的肝癌细胞系EH-H1与原发癌保持相似的生物学特性,可望成为一个稳定的细胞系.
-
不同p53状态的肝癌细胞系DNA损伤修复能力的比较
目的观察不同p53状态的肝癌细胞在DNA损伤因素存在下,探讨p53在肝细胞癌发生过程中的作用.方法选用内源性表达野生型p53、突变型p53、p53全基因缺失的HepG2、PLC/PRF/5、Hep3B肝癌细胞系,将含有p53结合序列的CAT报告基因质粒分别转染各细胞,通过ELISA方法检测报告基因CAT活化情况,观察p53功能状态;用细胞生长曲线比较不同p53状态的细胞生长速度的差异;给予一定剂量的紫外线照射,检测各细胞程序外DNA损伤修复(UDS)能力;观察紫外线照射后细胞克隆形成情况,反映不同细胞系在紫外线照射后细胞存活率的不同.结果报告基因CAT在HepG2细胞表达强,而在PLC/PRF/5、Hep3B肝癌细胞均处于较低水平,说明HepG2细胞具有功能性的p53表达;HepG2细胞生长速度明显慢于其他两种细胞;紫外线照射后,HepG2具有较好的DNA损伤修复能力以及较高的细胞生存率.结论野生型p53具有抑制肝癌细胞生长、保持细胞良好的DNA损伤修复的功能.
-
不同肝癌细胞系中P53/P21/MDM2表达初步观察
选用P53状态不同的Hep3B、PLC/PRF/5、HCC-9204、HepG2、HepG2215细胞,通过Western 印迹分析观察各细胞P53蛋白以及P53下游基因p21、mdm2蛋白表达情况;将报告基因PG13-CAT转染细胞,通过观察CAT酶表达水平反映各细胞中P53的反式活化功能;P21-LUC质粒细胞内转染,比较不同细胞中P53对P21启动子的活化情况.结果显示,PLC/PRF/5细胞中P53蛋白高表达、低功能,但P21蛋白以及报告基因P21-LUC转染细胞后荧光素酶均具有较高水平表达;Hep3B细胞中P53蛋白无表达、无功能,P21蛋白低表达,MDM2蛋白表达相对较高;HCC-9204细胞具有较高MDM2表达,P53蛋白表达及功能均较低,P21亦呈低表达;HepG2215较HepG2细胞具有较高的P53、P21蛋白表达,P53活化报告基因的活性也较强.结果提示,肝癌细胞中P53活性与其表达水平、存在状态有关;某些细胞中P21的活化表达存在不依赖于P53的途径; MDM2与P53的表达具有负性相关倾向.
-
信号调节蛋白SIRPα在肝癌内的表达及意义
目的:探讨信号调节蛋白SIRPα与肝细胞癌之间的关系.方法:应用Northern杂交技术,检测36对肝细胞癌(HCC)和相应癌旁肝组织,以及1种正常肝细胞系、4种肝癌细胞系内SIRPα基因表达的变化,并结合各组织标本的病理学特点进行分析.结果:SIRPα在20例肝癌组织及两种肝癌细胞系内表达水平明显下降.在两种主要杂交信号中,肿瘤组织内3.9 kb转录子表达量较癌旁组织下降2～4倍,而2.5 kb转录子表达量则下降4～6倍.有9例肿瘤组织在原基因表达水平下降的同时,在3.9 kb转录子的上方又出现一长度稍大的杂交信号,而相应癌旁肝组织内则为阴性.其中,5例有肝内或门静脉转移的肿瘤组织,SIRPα表达全部下降,且均发现有这种新的基因表现形式出现.结论:SIRPα,尤其是2.5 kb转录子在肝癌内表达下降,与肿瘤进展程度密切相关,且肿瘤组织内存在SIRPα相关的新的基因表现形式.SIRPα可能为肝癌发生发展过程中一个重要的调节蛋白.
-
乙型肝炎病毒DNA转染细胞的一种内参标准:真核细胞报告基因SEAP
目的建立用真核细胞报告基因SEAP转染人肝癌细胞系(Huh7、HepG2)及鸡肝癌细胞系(LMH)的表达系统,供研究HBV基因功能应用.方法分别将带有分泌性碱性磷酸酶(SEAP)报告基因的pBC12/ PL/ SEAP及pBC12/ CMV/ SEAP质粒DNA转染Huh7、HepG2及LMH细胞,并用pBC12/ CMV/ SEAP质粒DNA与S基因区变异体的克隆HBV DNA共转染HepG2细胞.培养后收取细胞培养液,用ELISA法测定SEAP活性及HBsAg.结果在三种细胞中pBC12/ CMV/ SEAP均可表达,以72小时表达的酶活性测定为适宜;而pBC12/ PL/ SEAP表达仅处于低水平.以SEAP表达量作为内参对HBsAg的表达量进行比较,发现S基因129L变异体表达HBsAg量显著高于野毒株.结论 SEAP作为内参具有快速简便,不需同位素及特殊仪器的优点,有较高的实用价值.
关键词： 分泌性碱性磷酸酶基因 转染 肝癌细胞系 乙型肝炎病毒 -
Hsulf-1在肝癌细胞系中的作用及STAT3信号通路研究
目的 基于肝癌细胞中人硫酸酯酶-1(human sulfatase-1,Hsulf-1)基因对STAT3信号通路的影响,探讨Hsulf-1基因在肝癌发生发展中的作用.方法 应用RT-PCR方法测定Hsulf-1在肝癌细胞中的表达;通过Western blot方法测定Huslf-1在HGF加入前后对STAT3磷酸化(p-STAT3)水平及下游蛋白的影响.结果 5-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-dC和曲古抑菌素Actrichostain A,TSA)处理HepG2细胞中Hsulf-1表达增加,且2者具有协同作用;与正常细胞相比,Hsulf-1在肝癌细胞系中(HepG2,Hep3B,Huh-7,SMMC-7221)表达水平下降,在转染pcDNA3.1(+)/Hsulf-1以及pcDNA3.1(+)/STAT3siRNA-Hsulf-1中的HepG2细胞,Hsulf-1的蛋白表达量增加,p-STAT3和c-met的表达水平下降,在未转染组以及转染阴性siRNA的HepG2细胞中,结论则相反.结论 Hsulf-1在肝癌细胞中表达下降;Hsulf-1在肝癌细胞中可抑制由HGF刺激的p-STAT3及下游蛋白的表达水平.
