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益气养阴方及其拆方影响急性髓细胞白血病细胞Flt3和N-ras表达研究
目的 研究益气养阴方及其拆方后的扶正方、祛邪方对Flt3和N-ras在人急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)表达的影响,探讨益气养阴方治疗白血病的作用机制.方法 收集60例AML患者骨髓单个核细胞,将所提取每例患者的细胞混悬液分成4组:对照组不加药物,实验组分别加入益气养阴方、扶正方、祛邪方中药制剂.采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),免疫印迹法(Western bloting)观察益气养阴组、扶正组、祛邪组及对照组对Flt3、N-ras基因及FLT3蛋白表达的影响.结果 RT-PCR 法检测:对照组、益气养阴组、扶正组、祛邪组Flt3基因表达率分别为(90.78±6.92)%、(38.18±4.50)%、(65.57±5.55)%、(61.35±6.39)%,N-ras基因表达率分别为(93.28±5.54)%、(34.38±6.69)%、(59.42±7.35)%、(65.28±7.64)%,益气养阴组、扶正组、祛邪组与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05).Western bloting检测:对照组、益气养阴组、扶正组、祛邪组FLT3蛋白灰度值分别为0.8127±0.0284、0.4265±0.0353、0.5396±0.0274、0.5473±0.0282,对照组与益气养阴组、扶正组、祛邪组比较差异有统计学意义(P<0.01).结论 中药益气养阴方可抑制AML细胞的克隆性增殖,可降低Flt3和N-ras在AML细胞的表达水平,对AML治疗具有作用.
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VEGF和N-Ras及pERK1/2在急性髓系白血病骨髓中的表达及相关性研究
目的:研究VEGF、N-Ras和pERK1/2在急性髓系白血病(AML)中的表达及临床意义,探讨白血病发展过程中VEGF的表达与Ras/MAPK信号通路之间的相互关系.方法:应用免疫组织化学染色法检测骨髓单个核细胞VEGF、N-Ras和pERK1/2蛋白的水平,应用PCR/ RFLP、PCR-SSCP和 DNA测序方法对初诊和完全缓解(CR)AML患者进行N-ras基因12位点突变分析.结果:检测AML46例,在初诊组28例AML中,VEGF、N-ras和pERK1/2的表达[(52.1±0.31)%、(59.8±0.32)%和(41.9±0.38)%]显著高于20例对照组[(20.5±0.16)%、(20.9±0.12)%和(14.1±0.14)%],P=0.034、 P=0.008和P=0.005.CR组18例AML患者中,VEGF、N-Ras和pERK1/2的表达[(18.6±0.18)%、(28.2±0.27)%和(15.1±0.19)%]与对照组差异无统计学意义,P>0.05、 P=0.411和P=0.343.初诊组VEGF、N-ras和pERK1/2的表达较CR组显著增高,P=0.029、 P=0.018和P=0.008.初诊和CR组中未发现N-ras基因12位点突变. VEGF与N-ras和pERK1/2表达水平相关性分析结果表明,VEGF的表达与N-Ras和pERK1/2的表达具有密切相关性(VEGF与N-Ras: r=0.510, P=0.003;VEGF与pERK1/2: r=0.513, P=0.003;VEGF与pERK1/2: r=0.464,P=0.009).结论:VEGF和N-Ras/ERK信号传导通路共同参与了AML的发展过程, N-Ras/ERK信号传导通路的工作状态与N-ras基因突变关系不密切.
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局部注射胆固醇包裹let－7a miRNA模拟物下调人3种Ras表达抑制裸鼠皮下肝癌移植瘤的生长和转移
目的：研究胆固醇包裹let－7a模拟物（mimics）是否能通过下调人3种Ras抑制肝癌发展，寻找肝癌的潜在治疗策略。方法采用MTT增殖分析、 PI单染和Annexin V／FITC双染方法检测let－7a mimics在体外对肝癌细胞的作用。使用裸鼠皮下移植瘤模型和通过肿瘤局部注射方法观察let－7a mimics对体内肝癌的作用。采用实时定量PCR和Western blot方法检测let－7a及其靶点Ras的表达。结果与阴性对照组相比， let－7a mimics转染的肝癌细胞let－7a水平升高，细胞增殖缓慢（P均＜0．05）； let－7a mimics阻滞更多肝癌细胞停留在G0－G1期且促进肝癌细胞凋亡（P均＜0．05）。经let－7a mimics治疗的裸鼠体内肿瘤体积较阴性对照组减小，是阴性对照组的54．97％（ P＝0．039）；局部浸润和肝脏转移较阴性对照组明显减轻。肝癌细胞和移植瘤组织内let－7a上调的同时，人K－Ras、 H－Rras和N－Ras mRNA和蛋白的表达降低（P均＜0．05）。结论 let－7a mimics下调人3种Ras mRNA和蛋白的表达，影响细胞周期，进而抑制细胞增殖和促进细胞凋亡。瘤周多点注射胆固醇包裹的let－7a mimics能抑制移植瘤的生长、浸润和转移。提示let－7阻断Ras可成为肝癌治疗的研究策略。
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多发性骨髓瘤N-Ras pERK1/2的表达及相互关系的探讨
目的:观察N-Ras/pERK1/2在多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma,MM)中的表达及临床意义,探讨N-Ras/MAPK信号通路与多发性骨髓瘤发生、发展之间的相互关系.方法:选择多发性骨髓瘤患者28例,应用Westem blot印记杂交检测N-Ras、pERK1/2蛋白表达水平,分析两者表达的相互关系.应用聚合酶链反应(PCR)/限制性片段长度多肽性分析法(RFLP),单链构象多肽性分析法(SSCP)和DNA测序方法对多发性骨髓瘤患者进行N-Ras基因12位点突变分析.结果:多发性骨髓瘤N-Ras、pERK1/2的表达水平(N-Ras:0.56±0.19;pERK1/2:0.39±0.21)显著高于正常人末梢血淋巴细胞(N-Ras:0.13±0.12;pERK1/2:0.10±0.14)(P＜0.01);28例多发性骨髓瘤患者中未发现N-Ras基因12位点突变;相关性分析结果表明多发性骨髓瘤N-Ras与pERK1/2的表达具有密切相关性(r=5.1326,P＜0.01).结论:非突变型N-ras基因产物介导的ERK信号传导通路参与了多发性骨髓瘤的发生、发展过程.
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杞菊合剂防治高血压左室肥厚机制研究
目的:通过观察杞菊合剂对自发性高血压大鼠(SHR)血压、左室重量与体重比(LVW/BW)、心肌组织原癌基因N-ras及c-myc mRNA表达的影响,探讨该方剂对高血压左室肥厚的作用及其机理.方法:SHR 32只,随机分成杞菊合剂组(A组,8只)、苯那普利组(B组,8只)、杞菊合剂加苯那普利组(C组,8只)、模型组(D组,8只),再取8只正常SD大鼠作为正常对照组(E组,8只),共五组.各治疗组给予相应药物剂量灌胃,正常组与模型组同时给予等量的蒸馏水灌胃,每日1次,治疗12周,每周测量血压,实验结束时收集标本,检测左室重量与体重比(LVW/BW)、心肌组织原癌基因N-ras及c-myc mRNA的表达.结果:杞菊合剂可降低SHR的血压、左室重量、心肌组织N-ras c-myc mRNA的表达(P<0.05).以杞菊合剂加苯那普利疗效佳,杞菊合剂在降压方面不及苯那普利,二者对左室重量及N-ras、c-mye mRNA表达的影响与苯那普利无显著性差异(P>0.05).结论:杞菊合剂可有效逆转高血压左室肥厚;杞菊合剂逆转高血压左室肥厚的机制可能与其降低血压.抑制原癌基因N-ras、C-myc表达有关;杞菊合剂与苯那普利联合应用其逆转高血压左室肥厚的作用更为显著.
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N-Ras和pERK1/2在急性髓系白血病中的表达及临床意义
目的:研究N-Ras,pERK1/2在急性髓系白血病(AML)中的表达,探讨Ras/MAPK信号通路在AML中的临床意义.方法:选择AML46例,应用免疫组织化学染色法检测骨髓单个核细胞N-Ras,pERK1/2蛋白表达水平.结果:初诊组N-Ras和pERK1/2的表达水平(59.8%,41.9%)显著高于对照组(P＜0.05),完全缓解组N-Ras和pERK1/2的表达(28.2%,15.1%)与对照组比较差异不显著(P＞0.05),初诊组N-Ras和pERK1/2的表达较完全缓解组明显增高(P＜0.05).相关性分析结果表明N-Ras与pERK1/2的表达具有密切相关性(P＜0.01).结论:N-Ras,pERK1/2的表达密切相关,N-Ras/ERK信号传导通路参与了AML的发展过程.
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人肝癌细胞N-ras基因RNA干涉有效靶点的确定
目的寻找人肝癌细胞N-ras基因的RNA干涉有效靶点.方法利用计算机网络资源及Oligo6.0、BlastResearch等生物学软件在N-ras基因编码区寻找RNAi有效靶点,并设计用于体内转录形成以U6启动子的siRNA发夹结构的DNA.结果成功筛选出RNA干涉的有效序列14个,并设计出siRNA发夹结构的DNA.结论这种对人肝癌细胞N-ras基因的RNAi有效靶点的筛选为进一步研究奠定了理论基础.其工作的开展将在RNAi治疗、肝癌N-ras基因功能研究、新药开发等方面发挥重要作用.
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桦菌芝多糖G-F组对HePA小鼠抑瘤率、HepA.瘤细胞N-ras蛋白表达的影响
目的:研究桦菌芝多糖G-F组对移植型腹水型肝癌(HepA)小鼠抑瘤率、HepA瘤细胞N-ras蛋白表达的影响,为桦菌芝多糖抑瘤作用机制的揭示及临床应用提供实验依据.方法:采用移植型腹水型肝癌(HepA)小鼠,随机分为荷瘤对照组、桦菌芝多糖G-F低剂量组、桦菌芝多糖G-F中剂量组、桦菌芝多糖G-F高剂量组、猪苓多糖组.连续给药12d后,利用颈部脱臼方法处死小鼠,将剥离的各组肿瘤组织分别称重,计算其抑瘤率;用SP免疫组化染色技术及多媒体彩色病理图文分析系统测定HepA瘤细胞中Ras蛋白的表达.结果:桦菌芝多糖可明显抑制小鼠HepA瘤,抑瘤率可达40.60%;桦菌芝多糖G-F组、猪苓多糖组Ras蛋白的表达量均明显低于阴性对照组(P＜0.05).结论:桦菌芝多糖有明显抗肿瘤作用,其机制是降低Ras蛋白的表达,抑制HepA瘤细胞的增殖.
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原位杂交法检测树舌多糖GF对HepA瘤细胞N-ras基因mRNA表达的影响
目的:探明树舌多糖GF对HepA瘤细胞癌基因N-ras mRNA水平的影响.方法:应用地高辛标记探针原位杂交技术,检测树舌多糖GF对HepA瘤细胞中癌基因N-ras mRNA丰度的作用.结果:树舌多糖组、猪苓多糖组中mRNA表达量均显著低于模型组(P<0.01),树舌多糖组与猪苓多糖组无显著性差异.结论:树舌多糖GF可通过调节N-ras基因mRNA的表达,而抑制HepA瘤细胞的增殖.
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妊娠滋养细胞疾病N-ras基因的表达及临床意义
目的探讨N-ras基因在妊娠滋养细胞疾病(GTD)组织中的表达及临床意义.方法用地高辛标记的N-ras裸核探针与54例石腊包埋的GTD组织进行原位杂交.结果N-ras mRNA在葡萄胎、侵蚀性葡萄胎和绒癌组织中阳性表达率分别为88.9%、77.8%和44.4%.绒癌N-ras阳性表达率显著低于葡萄胎(P＜0.01)和侵蚀性葡萄胎(P＜0.05).N-ras基因在妊娠滋养细胞肿瘤Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期间表达无显著差异.结论N-ras基因为GTT发生的早期事件,N-ras基因表达与GTD病理类型及前次妊娠性质有关,与GTT的临床分期无关.
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多发性骨髓瘤患者中N-ras基因突变的检测及其意义
目的了解多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)患者中N-ras基因突变率及临床意义.方法采用聚合酶链反应-单链构象多态性银染法检测MM患者的N-ras基因突变,并结合临床分析.结果 14例MM患者中,4例在N-ras第61密码子,1例在第12、13密码子处发生突变,突变率为35.7%.突变者中4例已死亡,其中2例检测突变时已处于疾病终末期.结论 N-ras基因在MM中有较高的突变率,对其的检测有助于病程进展和预后的分析.
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RT-PCR法检测白血病干细胞F1t3和N-ras基因的表达
目的:采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测益气养阴方及其拆方后的扶正方组、祛邪方组急性白血病干细胞Flt3和N-ras基因的表达,以期阐明Flt3和N-ras基因表达与疾病发生、发展的关系.方法:RT-PCR法检测中药益气养阴方组、扶正方组、祛邪方组及对照组AML患者骨髓单个核细胞Flt3和N-ras基因表达的情况.结果:Flt3和N-ras基因表达阳性率益气养阴组、扶正组、祛邪组与对照组比较,差异有显著性意义(P均＜0.01);益气养阴组与扶正组和祛邪组比较,差异有显著性意义(P均＜0.01);扶正组与祛邪组比较,差异无显著性意义(P＞0.05);各FAB亚型AML间Flt3与N-ras表达阳性率比较,差异无显著性意义(P＞0.05).结论:中药益气养阴方可降低Flt3和N-ras基因在AML细胞的表达水平,抑制AML细胞的克隆性增殖,对AML具有治疗作用.
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肝癌中医证型与野生型p53mRNA、N-ras蛋白表达相关性研究
目的:观察肝癌中医证型与野生型p53mRNA、N-ras表达相关性.方法:选择肝癌脾虚证36例和湿热证患者24例,应用原位杂交和免疫组化方法分别检测其肝癌组织野生型p53mRNA和N-ras蛋白表达,比较2组之间的差异.结果:脾虚证组野生型p53mRNA表达水平显著低于湿热证组(P＜0.05);脾虚证组N-ras蛋白表达水平略低于湿热证组(P＞0.05).结论:野生型p53mRNA表达与肝癌中医证型有关,野生型p53 mRNA低表达是区别脾虚证和湿热证的特征之一.
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建立一种N-ras突变检测的“凸背”引物荧光PCR新技术
目的 建立一种简便、省时、有效的N-ras突变检测的“凸背”引物荧光PCR新技术.方法 对比“凸背”引物荧光PCR新技术和Sanger测序法:通过对混有不同比例的N-ras基因热突变G13D(GGT＞GAT)质粒的样本进行对照检测来比较两者的灵敏度;对97例急性髓细胞白血病(AML)患者的外周血的DNA进行N-ras的G13D突变检测,统计两者的符合率. 结果 “凸背”引物荧光PCR新技术能检测出混有5％突变质粒型的样本,其灵敏度达5％,高于Sanger测序法的10％ ～ 20％.在97例AML患者的外周血的DNA中,“凸背”引物荧光PCR新方法和Sanger测序法检测到N-ras基因G13D突变分别为19例和18例,符合率达94.7％. 结论 “凸背”引物荧光PCR新技术比测序法更为快速、简单,有更高的灵敏度,容易实现.
关键词： N-ras “凸背”引物荧光PCR新技术 Sanger测序法 -
大鼠肝癌湿热证、脾虚证与野生型p53mRNA、N-ras表达相关性研究
目的 探讨实验性肝癌湿热证、脾虚证与野生型p53 mRNA、N-ras表达的相关性,揭示中医证型分子水平的客观内涵.方法 通过建立实验性大鼠肝癌湿热证和脾虚证模型,并设正常对照组,采用原位杂交和免疫组织化学法分别检测肝癌组织野生型p53 mRNA及N-ras蛋白表达.结果 肝癌脾虚证组野生型p53 mRNA阳性表达率显著低于正常对照组(P＜0.05),肝癌湿热证组与正常对照组比较,及肝癌脾虚证组与肝癌湿热证组比较差异无显著意义(P＞0.05).肝癌脾虚证组和肝癌湿热证组N-ras蛋白阳性表达水平比正常对照组均显著升高(P＜0.05,P＜0.01),肝癌脾虚证组与肝癌湿热证组比较差异无显著意义(P＞0.05).结论 野生型p53 mRNA、N-ras异常表达与肝癌湿热证、脾虚证具有相关性,野生型p53 mRNA表达率显著降低是肝癌脾虚证的特征之一.
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mRNA-cDNA高敏感性原位分子杂交技术
目的:探讨效果更加满意的核酸分子杂交技术的方法.方法:采用原位分子杂交技术结合免疫组化SP法,在人肝癌组织石蜡切片上显示c-myc和N-ras基因的mRNA.结果:c-myc mRNA和N-ras mRNA杂交信号呈红色,清晰可见于细胞浆内,背景浅淡,效果满意.结论:此方法与以往的原位杂交方法相比,能明显放大杂交信号,提高检测的敏感性和稳定性.
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N-Ras、pERK1/2在非霍奇金淋巴瘤中的表达及临床意义
本研究检测了非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma,NHL)N-Ras和pERK1/2(extracellular signal regulated kinase,ERK)表达水平,探讨其临床意义.
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原位杂交法检测树舌多糖GF对HepA瘤细胞N-ras、C-myc基因mRNA表达的影响
目的:探明树舌多糖GF对HepA瘤细胞癌基因N-ras、C-myc mRNA水平的影响.方法:应用地高辛标记探针原位杂交技术,检测树舌多糖GF对HepA瘤细胞中癌基因N-ras、C-myc mRNA丰度的影响.结果:树舌多糖组、猪苓多糖组中mRNA表达量均显著低于模型组(P＜0.01),树舌多糖组与猪苓多糖组无显著性差异.结论:树舌多糖GF可通过调节N-ras、C-myc基因mRNA的表达,而抑制HepA瘤细胞的增殖.
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CCL18通过 N-Ras/c-myc/lin28下调乳腺癌细胞 miR98的表达
目的：探讨 CCL18是否参与了乳腺癌 miRNAs 的表达调控。方法采用 miRNAs 芯片筛查 CCL18处理前后乳腺癌细胞 miRNAs 的表达差异,QRT-PCR 和 Luciferase Reporter Assay 对芯片结果进行验证。瞬时转染法分别改变乳腺癌细胞 miR98和 c-myc 的表达,应用 QRT-PCR 和 Western blot 检测 c-myc 和 lin28 mRNA 和蛋白的表达。结果miRNAs 芯片结果显示 CCL18处理后乳腺癌细胞共20种 miRNAs 发生变化,QRT-PCR 和 Luciferase Report-er Assay 证实 CCL18下调乳腺癌细胞 miR98的表达。CCL18可上调乳腺癌细胞 c-myc 和 lin28 mRNA 和蛋白的表达,转染 c-myc siRNAs 可逆转 CCL18调控 lin28和 miR98表达的功能。CCL18通过 miR98转录后调控乳腺癌细胞N-Ras 蛋白的表达。结论CCL18通过 N-Ras/c-myc/lin28通路下调 miR98,下调的 miR98通过 转 录 后 调 控 增 加N-Ras蛋白的表达,从而进一步激活 c-myc/lin28通路,维持 miR98的持续降低,形成了一个正反馈环路。
