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基因打靶技术研究及其应用
基因打靶技术是20世纪80年代发展起来的新技术,是一种利用DNA同源重组原理和胚胎干细胞(embryonic stemcells,ESCs)技术按定向组合的方式改变生物活体遗传信息的实验手段,具有定位性强、打靶后新的基因随染色体DNA稳定遗传的特点[1],其方法包括基因敲除、基因敲入、点突变、缺失突变、染色体组大片段删除等,相关的基因工程技术包括转基因、基因沉默和基因捕获等.
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FLT3 I836/M837位三碱基缺失的急性髓系白血病1例报告
FLT3属Ⅲ型受体酪氨酸酪激酶成员,对造血发育起重要调节作用.近年研究发现急性髓系白血病(AML)患者常带有FLT3突变,其中内部串联重复(FLTE-ITD)约占成人急性AML 20%,酪氨酸激酶结构域(TKD)点突变约占7.7%,常位于D835及其附近.关于FLT3D835/I836缺失突变国外偶见报道[1],国内尚未见报道.近发现1例AML-M4患者涉及ELT3 I836/M837位点三个碱基缺失,报告如下.
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Bartter综合征CLCNKB基因缺失突变1例报告
Bartter综合征(Bartter syndrome,BS)临床多表现低钾性碱中毒、血压正常或偏低、高肾素血症、高醛固酮血症,部分患儿出现高钙尿症导致肾脏钙化.其发病机制主要由控制肾小管离子通道的基因突变所致,据目前已知的基因突变将其分为I～V型BS和Gitelman综合征(Gitelman Syndrome,GS).本文报道1例确诊为CLCNKB基因缺失突变的BS.
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抗人TNF-α单克隆抗体抗原识别表位的初步研究
目的:确定抗人肿瘤坏死因子-α(hTNF-α)单克隆抗体(Z8)识别的抗原表位所在区域.方法:分别构建缺失hTNF-α不同部位的重组质粒,用IPTG诱导表达融合蛋白.对表达产物进行SDS-PAGE蛋白电泳及Western blot分析.结果:Z8特异性识别含有hTNF-α C端92-157位氨基酸在内的融合蛋白,而不识别GST及其与hTNF-α N端1-91位氨基酸所形成的融合体.结论:Z8抗体识别的抗原表位位于hTNF-α 92-157区.
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松花粉对衰老成纤维细胞线粒体DNA缺失突变的影响
目的 通过研究松花粉对衰老细胞线粒体(mt) DNA4977缺失突变的影响,探讨松花粉抗衰老的作用机制.方法 将细胞分为青年组、衰老细胞组、含240 mg/dl松花粉的衰老细胞处理组,三组细胞分别用不同培养基培养后,抽提线粒体DNA,进行PCR检测mtDNA4977缺失突变,以线粒体DNA中保守序列PCR扩增结果作为内参,比较各组mtDNA4977缺失突变在总线粒体DNA中的比例；同时对各组细胞进行β-半乳糖苷酶染色；并测定各组细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量.结果 松花粉能够改善衰老成纤维细胞的衰老变化,并能降低衰老细胞mtDNA4977的缺失突变,提高细胞SOD活性及降低其MDA含量(P＜0.05).结论 松花粉可能通过减轻成纤维细胞的氧化损伤,从而保护细胞mtDNA延缓成纤维细胞的衰老.
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乙型肝炎病毒小表面抗原各拓扑区段对其表达和分泌的影响
乙型肝炎病毒小表面抗原（small hepatitis B virus surface antigen ，SHB）在细胞内质网上表达，沿着细胞分泌途径分泌到胞外。为系统分析SHB拓扑结构对SHB表达和分泌的影响，首先通过生物信息学预测临床病毒株HBV C8和8种基因型（A～H ）代表株的SHB拓扑结构，发现这些SHB均为四次跨膜蛋白，拥有基本相同的拓扑结构。相对内质网膜而言，SHB的拓扑结构拥有3个内质网腔内区段（Inside1～ Inside3）、4个跨膜螺旋区（Tmhelix1～Tmhelix4）和2个内质网膜外区段（Outside1和Outside2）。6种基因型（基因型A、B、C、D、E和G）代表株与病毒株C8的SHB拓扑结构预测结果完全相同，而基因型F和H的SHB有4个区段与C8等不完全一致。通过对C8的SHB拓扑结构各区段进行缺失突变研究，发现Inside1区段不是SHB表达和分泌所必需的；Outside1、Tmhelix2和Inside2区段是SHB表达和分泌所必需的；Tmhelix1和Outside2不是SHB表达所必需的，但为SHB分泌所必需；Tmhelix3和Tmhelix4对SHB表达有重要影响，也是SHB分泌所必需的。进一步对Outside1和Outside2进行小片段（6个氨基酸）的缺失突变研究，发现小片段缺失基本不显著影响SHB的表达，但Outside1的氨基酸55～78及Outside2是SHB分泌所必需的。本研究首次系统性分析了SHB的拓扑结构各区段对SHB表达和分泌的影响，为深入探索SHB结构与功能的关系提供了线索。
关键词： 乙型肝炎病毒小表面抗原 缺失突变 表达 分泌 -
乙型肝炎病毒3022～1787核苷酸缺失突变体编码蛋白具有抗α干扰素作用
为证实乙型肝炎病毒(HBV) 3022～1787核苷酸缺失突变体编码蛋白TS′X′(源于DNA聚合酶读码框架,T为TP区,S′为部分缺失的spacer区,X′为截短的X蛋白)具有抗α干扰素(IFN-α)作用并确定其功能区域,用聚合酶链反应(PCR)扩增获得TS′X′全长及片段TS′(含TP区及部分缺失的spacer区),并克隆于pcDNA3.1/HisC载体.重组质粒以FuGENE6转染Huh7肝细胞,48 h后裂解细胞,以蛋白质印迹法(Western blot)证实目的蛋白可在Huh7肝细胞中表达.重组质粒及空载体pcDNA3.1/HisC分别与IFN-α反应报告质粒p6-16CAT按分子数5∶1、10∶1、15∶1、30∶1 共转染Huh7肝细胞,转染后48 h给予终浓度为100 IU/ml 的IFN-α2a刺激,作用24 h后裂解细胞,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测胞内氯霉素乙酰基转移酶(CAT)含量.结果显示,与空白载体相比,随着TS′X′及TS′重组表达质粒转染量的递增,Huh7胞内CAT值逐渐降低(n＝6,P<0.05),但TS′X′与TS′之间无显著差异(n＝6,P>0.05).本研究证实,HBV 3022～1787核苷酸缺失突变体编码的TS′X′蛋白可抑制Huh7细胞对IFN-α的反应性,其活性与其N端TP及部分缺失的spacer区有关.
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果蝇中整合素αPS3／βν介导吞噬细胞吞噬凋亡细胞和细菌
整合素是由2个跨膜α和β亚基组成的异源二聚体，具有各种细胞功能。整合素βν是果蝇整合素的β亚基，参与吞噬凋亡的细胞和细菌。该研究搜寻了与βν亚基形成复合物并共同作用的α亚基，通过RNAi感染动物模型检测发现，αPS3（而不是其他4个α亚基）是果蝇胚胎有效吞噬凋亡细胞所必需的。αPS3编码scb突变时，包括缺失突变、插入P元件或改变核苷酸序列，都能降低吞噬能力。这种降低作用能被过表达scb逆转。此外，用干扰RNA（RNAi）同时干扰苍蝇中αPS3和βν后，其吞噬能力与干扰任一个亚基相同。αPS3缺失也能降低幼虫血细胞吞噬金黄色葡萄球菌的能力。采用免疫共沉淀分析化学交联处理的果蝇细胞系发现，αPS3与βν具有物理相互作用。结果提示，整合素αPS3／βν是果蝇吞噬细胞吞噬凋亡细胞和细菌的受体。
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NF-κB结合位点突变对人NOD2基因启动子调控的影响
探讨NF-κB结合位点突变对人NOD2基因启动子调控的影响.采用PCR技术从人基因组DNA中扩增含有NF-κB结合位点的人NOD2基因启动子序列,并定向克隆入已切除启动子的表达载体pEGFP-N3中,构建含有NF-κB结合位点的人NOD2基因启动子驱动的绿色荧光蛋白(green fluorescent proteins,GFP)载体pEGFP-N3-NOD2wt,并构建NF-κB结合位点2个碱基缺失突变的载体,将构建的霞组质粒瞬时转染HEK293细胞,在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况.结果显示重组质粒转染HEK293细胞后,在倒置荧光显微镜下均能看到绿色荧光,其中pEGFP-N3-NOD2wt重组质粒在HEK293细胞中荧光表达较强,而突变质粒mpEGFP-N3-NOD2荧光强度明显减弱.说明NF-κB结合位点是驱动NOD2基因转录的重要元件,且在NOD2基因启动子的调控中发挥了正调节作用,为进一步研究NOD2基因表达及调控机制提供了新的思路.
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乙型肝炎病毒前S区缺失突变与乙型肝炎病毒相关肝细胞癌的关系
流行病学调查显示,慢性HBV感染是肝细胞癌(肝癌)发生的重要危险因子,但HBV的致癌机制至今不甚清楚.近年研究显示,HBV前S区缺失突变与肝病进展相关[1-2].本研究采用PCR测序法调查HBV相关肝癌患者和慢性乙型肝炎患者HBV前S区缺失突变频率,探讨前S区缺失突变与HBV相关肝癌的关系.
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广西地区一个早发性帕金森病家族Parkin基因的研究
目的:研究Parkin基因1～12号外显子缺失突变、点突变与一个早发性帕金森病(EOPD)家族的关系.方法:采用聚合酶链反应(PCR)扩增2例临床确诊为EOPD患者及其亲属的Parkin基因1～12号外显子;用琼脂糖凝胶电泳和单链构象多态性分析检测Parkin基因1～12号外显子缺失突变和点突变;将1例患者Parkin基因的1～12号外显子进行测序,对发现有异常的外显子,用斑点杂交、放射显影定性方法检测其亲属相应的外显子.结果:所有研究对象均未检测到Parkin基囚1～12号外显子缺失突变.结论:在2例患者及2名无临床症状亲属新发现7号外显子同义杂合点突变C869T,但此突变没有引起蛋白质序列改变(Arg256Arg).
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HPV16型E5基因对人永生化口腔上皮细胞E6、E7基因表达的影响
目的:研究HPV16型E5基因对人永生化口腔上皮细胞(human immortalized oral epithelial cell,HIOEC)E6、E7基因的影响.方法:HIOEC转染pLEGFP-E5基因反转录病毒载体,同时人为突变E5基因并转染HIOEC,通过PCR检测E5及各突变体在HIOEC中的表达.实时定量PCR检测E6、E7基因mRNA水平表达量的变化以及转染后HIOEC的细胞增殖能力,采用SPSS 13.0软件包对数据进行统计学处理.结果:构建了E5缺失突变体反转录病毒载体并成功转染人永生化口腔上皮细胞.转染后人永生化口腔上皮细胞的增殖行为实验表明,HPV16E5基因可促进人永生化口腔上皮细胞增殖(P<0.05),并对E6、E7基因mRNA表达具有正调控作用,但其缺失突变基因反转录病毒载体对人永生化口腔上皮细胞增殖及E6、E7表达无显著影响.结论:HPV16型E5基因可在一定程度上促进人永生化口腔上皮细胞增殖,并对E6、E7基因mRNA表达量有一定的间接上调作用.
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葡萄糖调节蛋白75基因突变体及其真核表达载体构建
葡萄糖调节蛋白75(glucose-regulated protein 75,Grp75)与细胞内的p53结合抑制其核移位,起到了保护细胞的作用.为研究Grp75和p53的结合与否是如何影响细胞活力,现构建Grp75缺失突变基因的真核表达载体.以SOE-PCR(genesplicing by overlap extension)法得到Grp75缺失突变基因,与pcDNA3.0真核表达载体连接,构建Grp75缺失突变的特异性表达载体pcDNA3.0/Grp75(△253-282),经酶切、测序鉴定Grp75缺失突变蛋白表达载体成功构建.用脂质体将pcDNA3.0/Grp75(△253-282)转染到PC12细胞株,以1 mg/mL浓度的G418筛选出稳定株,并命名为PC12/Grp75(△253-282)(+).半定量RT-PCR和Western blot结果显示PC12/Grp75(△253-282)(+)细胞组内Grp75的mRNA和蛋白的表达水平较PC12细胞组增高.对PC12细胞组、PC12/Grp75(△253-282)(+)细胞组和PC12/Grp75(+)细胞组(pcDNA3/Grp75真核表达载体已构建)分别缺糖0 h、3 h、9 h、18 h和36 h,MTT法检测各组细胞活力,Hoechst33324法检测细胞凋亡情况.结果显示PC12/Grp75(+)组细胞活力高于其它两组,PC12/Grp75(△253-282)(+)组高于PC12组,差异有统计学意义.Hoechst33324染色后,凋亡细胞的比率与MTT细胞活力检测结果基本一致.Western blot检测三种细胞内p53的表达量,PC12/Grp75(+)细胞内p53蛋白表达量低于另外两组,可能是由于Grp75蛋白量的增多部分抑制了p53的表达,提示Grp75对缺糖诱导细胞凋亡的抑制作用部分与p53的结合有关.以上结果表明Grp75基因的缺失突变在一定程度上降低了细胞的活力.
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帕金森病患者Parkin基因的研究
目的 研究Parkin基因缺失在早发性和晚发性帕金森病(PD)患者中的分布情况,探讨其在不同亚型PD发病机制中的可能作用.方法 对63例PD患者分为早发性PD组和晚发性PD组.以提取的基因组DNA为模板,扩增Parkin基因2～5号外显子,然后行琼脂糖电泳,观察外显子的缺失分布.结果 63例PD患者中发现外显子2、4缺失各1例,外显子3缺失2例,这些缺失均出现于早发性PD组.结论 Parkin基因外显子缺失可能是我国早发性PD患者的致病原因之一.
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中文文摘
1．线粒体基因7．4 kbp大片段缺失突变与侵袭性牙周炎的关系研究／郭园…／／实用口腔医学杂志．-2014，30（1）．-99-102
选取20例AgP患者（AgP组）和20例牙周健康者（对照组），收集外周血及牙周翻瓣术及牙冠延长术中切取的牙龈组织，同时收集10例慢性牙周炎者（CP组）牙周翻瓣术中切取的组织。采用长距离 PCR方法检测血样本和牙龈组织样本中 mtDNA 7．4 kbp 大片段缺失，比较3组间的差异。结果：AgP组20例牙龈组织中1例存在 mtDNA 7．4 kbp 大片段缺失，AgP组2例组织和 CP 组1例组织中检测到目前尚未报告过的 mtDNA 5537 bp 大片段缺失突变。所有血样和对照者牙龈组织中均未检测到大片段缺失突变。结论：AgP患者牙龈组织中存在 mtDNA 7．4 kbp大片段缺失，发现一种新的 mtDNA 5537 bp大片段缺失突变。 -
SynGAP(1-700aa)中670-685aa缺失突变质粒的构建及表达
目的:缺失突变SynGAP(1-700 aa)-Flag中的670-685aa片段,为后续实验中新的药物靶点的鉴定提供可靠理论依据.方法:以前期构建好的pCMV-SynGAP (1-700aa)-Flag质粒为模板,重叠延伸PCR技术缺失突变670-685aa片段,扩增出目的片段;限制性内切酶将载体线性化,然后分别纯化目的片段与线性化载体;利用同源重组技术连接目的片段与线性化载体,获取重组质粒;PCR技术鉴定重组质粒构建成功,测序进一步验证质粒碱基正确;将质粒转入293T细胞,免疫印迹鉴定能否成功表达.结果:重叠PCR成功缺失突变670-685aa片段,成功构建重组质粒,且测序正确.免疫印迹结果表明,SynGAP (1-700aa)缺失突变670-685aa片段后仍可成功表达.结论:成功缺失突变SynGAP(1-700aa)中的670-685aa片段,并且在细胞株中稳定表达.该质粒的成功构建,为我们的后续研究奠定实验基础.
关键词： SynGAP 重叠延伸聚合酶链式反应 缺失突变 -
1例家族性腺瘤性息肉病患者的 AP C基因突变诊断
目的：对1例家族性腺瘤性息肉病患者进行结肠息肉病致病基因（ adenomatous polyposis coli ，APC）的突变检测。方法从患者外周血中提取基因组DNA，用目标序列捕获结合二代测序技术对APC致病基因进行测序并用Sanger测序验证。结果患者的APC经分析后发现1个杂合的缺失突变c．3931＿3925delAAAAG（ p．Ile1307IlefsX6）；该突变引起APC基因的编码序列移码突变，产生一个提前终止的密码子，生成一截短的蛋白而影响蛋白功能。结论 APC基因编码区的缺失突变c．3931＿3925delAAAAG（p．Ile1307IlefsX6）为该患者的致病原因。
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老龄大鼠听功能下降与线粒体DNA4834bp缺失突变的关系
目的 探讨大鼠老年性耳聋与听觉器官线粒体DNA4834bp缺失突变的关系.方法 取SD大鼠按年龄随机分为对照组(3个月龄)与观察组(24个月龄),各10只.分别对2组大鼠进行听性脑干反应(ABR)测试听阈,采用PCR技术检测大鼠内耳耳蜗及蜗神经核组织线粒体DNA4834bp缺失突变情况,应用凝胶酶切电泳技术证实线粒体DNA缺失突变的存在.结果 对照组大鼠ABR平均听阈为(19.50±3.69)dB peSPL,观察组大鼠ABR平均听阈(46.00±3.94)dB peSPL,两组差异有统计学意义(P<0.05).线粒体DNA大片段缺失检出情况:对照组大鼠内耳组织及蜗神经核未发现线粒体DNA4834bp缺失,观察组大鼠内耳组织线粒体DNA4834bp缺失突变检出率为90.0％,脑蜗神经核线粒体DNA4834bp缺失检出率为100％.结论 老龄大鼠听觉器官(内耳组织和蜗神经核)线粒体DNA4834bp缺失突变检出率高,这种大片段缺失与老龄大鼠听功能下降密切相关.
关键词： 缺失突变 线粒体DNA4834bp 老年性耳聋 内耳 蜗神经核 -
线粒体DNA突变及其与衰老的关系
大量研究证实衰老与线粒体DNA缺失突变有密切关系.在衰老过程中,线粒体DNA的缺失突变随增龄而积累,使线粒体的生物学发生变化,从而影响线粒体的正常功能,促进衰老的进程,本文主要就以上内容作一综述.
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GFP/HBxn、 GFP/HBxc融合蛋白重组载体的构建和稳定表达细胞系的建立
目的 分别构建绿色荧光蛋白(GFP)与氨基端或羧基端缺失突变乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)的重组表达载体,建立稳定表达GFP/HBxn、GFP/HBxc融合蛋白的HepG2细胞系,以进一步研究HBx缺失突变对其生物功能的影响.方法 PCR法分别扩增氨基端缺失50aa的HBx及羧基端缺失50aa的HBx基因,用HindⅢ和KpnⅠ双酶切定向插入pEGFP-C1相应酶切位点并转化宿主菌DH5α,双酶切鉴定pGFP/HBxn、pGFP/HBxc;脂质体转染法转染HepG2细胞,G418筛选出抗性细胞克隆,荧光显微镜下观察GFP的表达,挑选抗性克隆细胞扩大培养并传代.RT-PCR法、Western blot法检测转染细胞HBxn、HBxc基因、蛋白的表达.结果 扩增的HBxn、Hbxc基因片段琼脂糖凝胶电泳显示符合预估大小.重组质粒pGFP/HBxn、pGFP/HBxc经HindⅢ和KpnⅠ双酶切后电泳,符合预估大小;转染pGFP/HBxn及pGFP/H Bxc的HepG2细胞可见抗性细胞克隆形成,并可见阳性克隆细胞均有GFP表达.RT-PCR与Western blot法检测到HBxn、HBxc的表达.结论 成功构建了GFP/HBxn、GFP/H Bxc真核重组表达载体pGFP/HBXn、pGFP/HBxc,获得了稳定表达GFP/HBxn、GFP/H Bxc融合蛋白的HepG2细胞系,为进一步研究HBx缺失突变对其生物功能的影响奠定了基础.
