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NT-3基因转染对庆大霉素耳毒性的拮抗作用
目的探讨NT-3基因转染对豚鼠庆大霉素耳中毒的保护作用.方法采用阳离子脂质体介导的方法,将携带外源性基因NT-3的重组质粒pIRES2-EGFP-NT-3与阳离子脂质体复合物10 μl注入豚鼠左侧耳蜗(设为Ⅰ组),术后3 d开始给予庆大霉素肌肉注射(120 mg/kg),连续注射14 d,分别于停药后1 d、2 w进行ABR及DPOAE测试,随即处死动物,耳蜗取材,观察耳蜗毛细胞受损情况,并在透射电镜下观察耳蜗传入神经超微结构改变.实验同时设空载体组(Ⅱ组)及正常对照组(Ⅲ组).结果庆大霉素停药1 d时,与正常对照组相比,空载体组DPOAE幅值显著下降(P<0.05), 停药2 w时,DPOAE幅值下降更显著,尤其在1、1.4及6 kHz处幅值下降明显(P<0.05);NT-3转染组在停药1 d时,仅高频DPOAE幅值下降(P<0.05),停药2 w时,DPOAE幅值下降减缓(P>0.05);各实验组ABR阈值与DPOAE幅值改变相似;荧光显微镜下见庆大霉素停药1 d时,NT-3转染组第一排外毛细胞出现部分缺失,庆大霉素停药2 w时,第一排外毛细胞缺失加重,并出现少量第二、三排外毛细胞及个别内毛细胞的缺失;空载体组在庆大霉素停药1 d时,即出现第一排外毛细胞严重缺失,少量第二、三排外毛细胞及个别内毛细胞的缺失,停药2 w时外毛细胞缺失进一步加重;透射电镜下见庆大霉素停药1 d时,空载体对照组Ⅰ型及Ⅱ型神经纤维轴索内微管排列出现紊乱,少量崩解,髓鞘板层结构尚可,Ⅰ、Ⅱ型神经元细胞胞体内偶可见少量髓鞘样结构,停药2 w时,传入神经退行性改变明显加重,神经纤维崩解,神经元出现大量空泡化.而NT-3转染组在损伤的早期,传入性神经从末梢到神经元仅出现轻微的改变,在庆大霉素停药2 w时,神经退行性改变略加重,但仍显著轻于对照组.结论阳离子脂质体介导的NT-3基因转染可减轻庆大霉素对豚鼠耳蜗外毛细胞、传入神经及螺旋神经节细胞的毒性作用.
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稳定表达NT-3的NIH3T3细胞对小鼠耳蜗螺旋神经节细胞生长的影响
目的通过体外共培养观察NT-3对耳蜗螺旋神经节细胞生长的影响.方法建立能够稳定表达、分泌NT-3蛋白的NIH3T3细胞系;选择出生2～4 d的BALA/CA小鼠,进行耳蜗螺旋神经节细胞原代培养并分为3组,其中Ⅰ组与稳定分泌NT-3的NIH3T3细胞共培养,Ⅱ组与传染空载体NIH3T3细胞共培养,Ⅲ组与NIH3T3细胞共培养,共培养2周后,观察各组螺旋神经节细胞的数量及轴突长度的变化.结果共培养2周后,与对照组相比,NIH3T3-NT-3共培养组SGC的数量以及突起的长度均显著高于对照组.结论NT-3可显著减轻耳蜗螺旋神经节神经的退行性改变.
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目标导向液体治疗对老年胃肠道肿瘤患者肠道运动功能的影响
目的:探讨围术期目标导向液体治疗对行胃肠道手术的老年患者术后肠道运动功能的影响及应用价值.方法:选取本院择期行胃肠道手术患者(65~80岁)60例,ASAⅡ~Ⅲ级,男38例,女22例.随机分为对照组(n=30)、目标导向组(n=30).对照组行常规外科补液法,依据MAP、CVP、尿量补液;目标导向组采用微截流(Vigileo)监测系统,根据SVV、CI、SVR、CVP、MAP将SVV<13%作为目标指导补液,观察两组术中和术后血流动力学、肠道内环境、营养代谢及肠功能恢复情况.结果:与对照组比较,目标导向组围术期和术后组织灌注、组织氧供、组织营养代谢及肠道甘丙肽、神经营养因子-3(NT-3)差异均有统计学意义(P<0.05);目标导向组术后肠道排气时间短、住院时间短、补液和失液量少,其差异具有显著性(P<0.05).结论:围术期目标导向液体治疗有利于老年人胃肠道肿瘤手术术后胃肠道运动功能的恢复,对于临床麻醉管理具有指导意义.
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NT-3真核过表达载体的构建及其在大鼠MSCs中的表达
目的 构建pCDNA3.1-NT-3真核过表达载体,鉴定其在大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)中的表达.方法 从SD大鼠脑中提取并扩增NT-3基因,并将其克隆入pCDNA3.1中,构建pCDNA3.1-NT-3真核载体;原代培养大鼠间充质干细胞,将pCDNA3.1-NT-3通过Lip2000介导转染至大鼠MSCs;用RT-PCR、免疫荧光法、Western blot法检测NT-3在MSCs中的表达.结果 扩增的NT-3基因序列正确,并成功连接到真核载体pCDNA3.1中;转染MSCs后,RT-PCR、免疫荧光、Westernblot结果显示MSCs中过表达NT-3的mRNA和蛋白.结论 pCDNA3.1-NT-3真核载体构建成功,转染MSCs后能在细胞中正确过表达,为进一步NT-3基因修饰的MSCs治疗癫痫的研究奠定了实验基础.
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利用稳定表达神经营养因子的神经干细胞治疗脊髓损伤的实验研究
目的 利用转基因技术将大鼠NT-3基因转入神经干细胞,获得稳定表达NT-3的细胞株,注入脊髓损伤大鼠模型的损伤部位进行治疗,观察外源细胞对脊髓的修复情况.本研究为脊髓损伤的干细胞治疗提供新的实验依据,为采用转基因技术提高脊髓损伤治疗效果奠定理论基础.方法 ①取孕14天大鼠胚胎皮层细胞,磁珠分选Nestin阳性(神经干细胞特异性标记)细胞群进行体外细胞培养至形成细胞克隆.将大鼠NT-3高表达载体转入神经干细胞,G418筛选出稳定表达NT-3的细胞继续培养.Western Blot检测证实得到的细胞可以稳定表达NT-3.②40只成年雌性Wistar大鼠麻醉后撞击锤损伤脊髓成脊髓损伤后九天,实验组大鼠每只注入5 μL细胞(稳定表达NT-3)悬液(10000 个/μL),对照1组动物每只注入5μL细胞培养基,对照2组动物每只注入5μL未经转染处理的细胞悬液(10 000个/μL),皮肤缝合后放回动物房常规饲养.③移植后一周起,采用斜板试验和BBB (Basso-Beattie-Bresnahan)评分观察大鼠后肢运动功能恢复情况.结果 ①神经干细胞可以稳定高表达(NT-3);②高表达NT-3的神经干细胞移植后可以改善实验性脊髓损伤大鼠模型各项检测指标,对脊髓损伤具有潜在的治疗价值.结论 NT-3转染神经干细胞后对于实验动物的脊髓损伤治疗效果显著提高,是提高临床脊髓损伤疗效的潜在可行途径.
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Sox2在NT-3促进大鼠神经干细胞分化中的作用
目的 探讨Sox2在神经营养因子3(neurotrophin-3,NT-3)促进原代大鼠神经干细胞(neural stem cells,NSCs)分化中的作用及其机制.方法 选取孕14～15 d SD胎鼠,培养原代脑源性NSCs.观察NT-3对NSCs中Sox2表达及NSCs分化的影响:采用不同浓度NT-3(25、50、100 ng/mL)刺激NSCs24 h后,检测Sox2、DCX、Olig2、GFAP蛋白的表达量.探索NT-3对Sox2产生影响的机制:使用PI3K/AKT通路阻断剂(10 μmol/L LY294002)选择性阻断NT-3的作用后,检测AKT、p-AKT和Sox2在蛋白水平表达量的变化.结果 随着NT-3浓度的升高,NSCs中Sox2蛋白水平的表达明显上调(P＜0.05),各NT-3处理组的NSCs向神经元前体细胞分化的比例明显增加(P＜0.05),100 ng/mL NT-3组效果强,呈现出明显的剂量依赖性;与对照组相比,100 ng/mL NT-3组的p-AKT及Sox2蛋白水平显著上调(P＜0.05),且LY294002可阻断此作用(P＜0.05).结论 NT-3能够上调NSCs中Sox2的表达,后者进而诱导NSCs向神经元方向分化,其可能是通过激活PI3 K/AKT信号通路起作用.
关键词： NT-3 SOX2 神经干细胞 分化 PI3K/Akt信号通路 -
树突状细胞通过NT-3/TrkC信号通路调控神经干细胞存活的体外研究
目的 研究共培养状态下树突状细胞(dendritic cell,DC)对神经干细胞(neural stem cell,NSC)存活的影响及其作用机制.方法 体外分离、纯化SD大鼠原代DC和NSC,将二者用Transwell技术共培养,用NT-3特异性抗体中和NT-3的表达；然后采用qRT-PCR方法检测DC中神经营养素-3(neurotrophin-3,NT-3)的mRNA水平,流式细胞术检测NSC凋亡；同时用免疫荧光、Western blot技术确定NSC表面NT-3特异性受体TrkC的表达.结果 与DC单独培养组相比,共培养体系中,DC表达NT-3水平显著性增强(P＜0.05)；同时共培养能显著增加NSC存活,该效应能被NT-3特异性中和性抗体阻断；共培养能够增加NSC中NT-3特异性受体TrkC表达(P＜0.05),并上调TrkC磷酸化水平,而NT-3特异性抗体能够抑制TrkC表达和磷酸化上调(P＜0.05).结论 DC和NSC共培养能够增加DC中NT-3表达,高表达的NT-3则通过NSC膜上的TrkC受体促进NSC的存活.
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体外树突状细胞通过NT-3上调P-ERK1/2的表达促进神经干/祖细胞分化
目的 观察树突状细胞(dendritic cells,DCs)对神经干/祖细胞(neural stem/progenitor cells,NSPCs)分化的影响,探讨神经营养素-3(Neurotrophin-3,NT-3)在DCs调控NSPCs分化中可能的作用机制.方法 实验共设5组,分别为NSPCs组、NSPCs/DCs组、NSPCs+ NT-3组、NSPCs/DCs+抗NT-3组和DCs组.共培养24、48、72 h后,ELISA法检测各组上清液中NT-3含量；7d后荧光免疫细胞化学法检测各组NSPCs分化情况.Western blot检测各组NSPCs磷酸化的细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK1/2)表达.结果 NSPCs/DCs组上清液中NT-3含量较NSPCs组、NSPCs/DCs+抗NT-3组和DCs显著升高(P＜0.05).NSPCs/DCs组和NSPCs+ NT-3组β-tubulin-Ⅲ阳性细胞数较NSPCs组和NSPCs/DCs+抗NT-3组显著增高(P＜0.05),而NSPCs组和NSPCs/DCs+抗NT-3组GFAP阳性细胞较NSPCs/DCs组和NSPCs+ NT-3组显著增高(P＜0.05).NSPCs/DCs组和NSPCs+ NT-3组NSPCs中的p-ERK1/2的表达较其余两组增高(P＜0.05).结论 NSPCs与DCs共培养能显著促进NSPCs分化为神经元,可能与共培养后NT-3表达量增高,通过其特异性受体TrkC激活下游信号通路MEK-ERK有关.
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大鼠脊髓全横断后脊髓内NGF、NT3表达的变化
目的 探讨大鼠脊髓全横断后不同时相(3、7、14、21天)脊髓内NGF,NT3表达的变化.方法 采用免疫组织化学ABC法及阳性神经元计数,来检测脊髓全横断后不同时相NGF、NT-3的表达.结果 (1)脊髓全横断后脊髓腹、背角NGF阳性细胞数均较正常增多(P＜0.05),尤以7天明显;脊髓全横断后脊髓腹、背角NT-3阳性细胞数均较正常增多(P＜0.01),尤以7天明显.结论 NGF、NT-3表达的变化可能与脊髓可塑性有关.(2)NGF、NT-3阳性细胞数在各时相均比正常增多,说明NGF、NT-3在脊髓全横断后呈持续性表达增加.
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神经营养因子、凋亡相关因子和轴突导向因子在大鼠神经管畸形发育中的表达
目的 探讨神经营养因子(NT-3,CNTF,IGF-1,PDGF)、凋亡相关因子(Caspase-3,Bcl-xl)、轴突导向因子(Netrin)的mRNA在大鼠神经管畸形发育中的表达变化.方法 选取孕鼠随机分为正常组(不作任何处理)、对照组(按50 mg/kg橄榄油于E10d时一次性胃饲孕鼠)和(按50 mg/kg溶于橄榄油的维甲酸于E10d时一次性胃饲孕鼠).正常组、对照组和实验组又各自分为E15d、E16d、E17d、E18d、E19d、E20d组,每组5只胎鼠,用于RT-PCR实验.结果 (1)实验组的胎鼠中66％发生了死胎、脊髓脊柱裂、无尾畸形、下肢不发育等； (2)神经营养因子(NT-3,CNTF,IGF-1,PDGF)、凋亡相关因子(Caspase-3,Bcl-xl)、轴突导向因子(Netrin)在E15 d～E20 d正常及畸形大鼠神经管发育过程中,均有表达.其中,IGF-1在E16d与正常组比较表现为表达减少的趋势；实验组内比较IGF-1表达有先增加后减少再增加的趋势.CNTF在E17d时与正常组比较表达有减少.以上变化均具有统计学意义(P＜0.05).凋亡因子(Caspase-3,Bcl-xl)和导向因子(Netrin)均无统计学意义.结论 神经营养因子(NT-3,CNTF,IGF-1,PDGF)、凋亡相关因子(Caspase-3,Bcl-xl)、轴突导向因子(Netrin)在E15 d～E20 d正常及畸形大鼠神经管发育过程中有重要作用.IGF-1、CNTF的mRNA变化均较正常组有不同程度减低,可能是维甲酸通过干扰此三类神经营养因子等大分子物质在发育过程中的形成和分布,在某种程度上改变了大鼠神经胚发育的进程和方式,以此也就干扰了神经元的正常的分化增殖发育过程.
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NT-3在挤压伤脊髓背角表达的时相变化
目的:了解NT-3在挤压伤脊髓背角表达的变化.方法:制作成年SD大鼠T13-L1节段脊髓挤压伤模型并设正常对照组,分别于术后24 h,7 d,21 d处死动物,取L3节段脊髓制作20μm厚冰冻连续切片,用抗NT-3抗体行免疫组织化学ABC法染色.观察NT-3在背角的表达,记录其免疫反应强度,计数其免疫阳性神经元数和胶质细胞数.结果:NT-3的阳性反应物主要分布于脊髓背角的神经元和胶质细胞挤压伤后NT-3的表达从术后24 h至术后7 d进行性减少,而术后21 d时则增加并高过正常者水平.结论:NT-3不仅参与脊髓的正常生理活动,而且可能与脊髓挤压伤的早期修复有关并具有双向效应.
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挤压伤脊髓腹角神经元NT-3表达的变化
运用免疫组化ABC法探讨了脊髓挤压伤后不同时间腹角NT-3表达的变化.结果:对照组可见NT-3免疫反应阳性细胞分布于腹角的大神经元和少量小神经元,胞核、胞浆均染色.此外,亦见少量阳性胶质细胞.脊髓挤压伤后24h,神经元内NT-3免疫反应强度较正常时为深(P＜0.05).挤压后7d,NT-3免疫反应强度及阳性细胞数目均较正常及24h组者有显著增加(P＜0.05).提示,NT-3不仅可能参与了正常脊髓腹角神经元的生理过程,而且可能在脊髓损伤修复中发挥作用.
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NT-3在挤压伤脊髓背角表达的时相变化
目的:了解NT-3在挤压伤脊髓背角表达的变化.方法:采用本室建立的成年SD大鼠(T13-L1)脊髓挤压伤模型,分别于术后24h,7h,21h处死动物并设正常对照组,取L3节段脊髓制作20μm厚冰冻连续切片,用抗NT-3抗体按ABC法行免疫组织化学染色.观察NT-3在挤压伤位点尾侧端(L3)背角的表达,记录其免疫反应强度,计数其免疫阳性神经元数和胶质细胞数.结果:NT-3的阳性反应物主要分布于脊髓背角的神经元和胶质细胞.挤压伤后24h,背角NT-3的免疫阳性神经元和胶质细胞数及其反应强度均较正常者明显降低(P<0.05),术后7h者又较术后24h者明显降低(P<0.01),而术后21h时又显著升高且高过正常者水平(P<0.01).结论:NT-3在挤压伤位点尾侧端背角的表达从术后24h至术后7h进行性减少,而术后21h时则增加并高过正常者水平.提示NT-3可能与脊髓挤压伤的早期修复有关并具有双向效应.
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真核表达载体pIRES2-EGFP-NT3的构建及在豚鼠耳蜗成纤维细胞中的表达
目的构建真核表达载体pIRES2-EGFP-NT3, 并观察其在豚鼠耳蜗成纤维细胞中的表达及分布.方法用RT-PCR法, 从人肝脏组织中克隆NT3-cDNA基因, 构建真核表达载体pIRES2-EGFP-NT3, 并经PCR及EcoR I/BamH I双酶切鉴定.用脂质体介导的方法, 将用真核表达载体pIRES2-EGFP-NT3瞬时转染豚鼠原代耳蜗成纤维细胞. 转染48 h后,分别在荧光显微镜下及用免疫组化法观察转染细胞中NT-3的表达.结果人NT-3 cDNA的PCR产物约为744 bp.序列测定结果用BLAST软件进行同源性比较, 同源性为100%.经EcoR I/BamH I双酶切证实, NT-3 cDNA已成功地克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP中.用脂质体介导法,将pIRES2-EGFP-NT3瞬时转染豚鼠原代耳蜗成纤维细胞, 在荧光显微镜下观察到呈绿色荧光的成纤维细胞. NT-3免疫组化染色结果显示,转染NT-3基因的成纤维细胞胞浆呈棕黄色着色; 而转染空载体的成纤维细胞免疫组化染色呈阴性.结论成功地构建真核表达载体pIRES2-EGFP-NT3, 并在豚鼠耳蜗原代成纤维细胞中表达, 为NT-3基因转染治疗致聋豚鼠耳蜗动物试验奠定了基础.
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BDNF,NGF和NT-3的mRNA和蛋白在猫左侧腰第六背根节共表达的不同方式
本实验研究了脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF),神经生长因子(nerve growth factor,NGF)和神经营养因子-3(neurotrophin-3,NT-3)的mRNA和蛋白在猫左侧腰第六背根节(dorsal root ganglion,DRG)共表达的不同方式,并探讨了共表达的机制,为阐明神经营养因子的表达与脊髓可塑性的关系提供依据.本实验所使用的为未接受任何处理的健康猫.猫的左侧腰第六DRG被取出,行免疫组织化学染色与原位杂交方法结合的双重标记,确定是否有BDNF,NGF和NT-3的蛋白与mRNA共表达.实验结果显示BDNF,NGF和NT-3的蛋白与mRNA在猫DRG均有表达,但这三种神经营养因子mRNA和蛋白共表达的方式是不同的.免疫组化结果显示:BDNF阳性产物主要分布于细胞质和细胞核,细胞核的染色颜色较细胞质浅;NGF阳性产物主要分布于细胞核;NT-3阳性产物主要分布于细胞质.原位杂交结果显示:BDNF和NGF阳性信号主要分布于细.胞质;NT-3阳性信号在细胞质和细胞核都有分布.由此可见,BDNF,NGF和NT-3的mRNA和蛋白在猫左侧腰第六DRG有不同的共表达方式,提示它们可能存在与脊髓可塑性有关的自分泌和/或旁分泌机制.
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外周血氧化应激因子、IL-6、S100-β、NT-3与精神分裂症症状的相关性研究
目的 探讨精神分裂症(SP)患者临床症状与外周血氧化应激因子、IL-6、S100-β、NT-3的相关性.方法 研究对象为2015年12月～2016年12月我院50例SP患者以及30例体检正常人员,分别设为观察组与对照组.通过SP精神症状(PANSS)评分将观察组分为阳性症状组与阴性症状组,检测相关外周血氧化应激因子水平,并检测血清相关蛋白因子的水平,并进行相关性分析.结果 阳性症状组一般症状评分与阴性组无显著性差异(P＞0.05),PANSS总分、阳性评分、阴性评分均差异显著,有统计学意义(P＜0.05);阳性症状组除脂质过氧化物(LPO)、还原型谷胱甘肽(GSH)外均与阴性组具有显著性差异,有统计学意义(P＜0.05),SOD、GSH-Px、NO、IL-6、S100-β、NT-3均无显著性差异;阳性症状组与阴性症状组血清钙结合蛋白(S100-P)、神经营养因子3(NT-3)无显著性差异(P＞0.05),阳性症状组与阴性症状组白细胞介素6(IL-6)显著低于对照组,有统计学意义(P＜0.05);所有指标中,一氧化氮(NO)浓度与SP患者PANSS总分、一般症状分成负相关(P＜0.05)、SOD与SP患者PANSS总分、一般症状分成正相关(P＜0.05),NT-3与阳性症状组患者一般症状分成正相关(P＜0.05),其余指标均无相关性(P＞0.05).结论 精神分裂的发生及发展可能与氧化应激因子、IL-6、S100-3、NT-3有关,且精神症状与SOD、NO以及NT-3具有密切的相关性.
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SD仔鼠雪旺细胞的体外培养及转染NT-3基因的实验研究
目的体外培养雪旺细胞并转染NT-3基因,观察转染后细胞的生物学行为.方法用预涂有10%多聚赖氨酸的培养瓶体外原代和传代培养SD仔鼠雪旺细胞并用抗S-100多抗鉴定细胞性质,原代培养12小时后加入10-5 M阿糖胞苷,72小时后换成100μg/ml的G-418,连续作用5天后加入2μM氟丝扣林继续培养.用脂质体法转染入质粒pIRES2-EGFP-NT-3,免疫细胞化学检测NT-3的表达并用图象分析法定量,观察转染NT-3细胞的形态和细胞周期的变化.结果体外成功培养了SD仔鼠雪旺细胞,免疫细胞化学证实成功转染了NT-3基因,转染NT-3组有丝分裂期细胞数量较未转染组增高,但是细胞形态未见明显变化.结论细胞转染NT-3基因后,细胞的有丝分裂增快,细胞增殖增快.
