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小窝与血管内皮通透性
小窝(caveolae)是调控血管肉皮跨细胞通透性的关键分子,通过Cav-1的表达和磷酸化、Src激酶的激活及细胞旁转运调节血管的高通透性.caveolae及Cav-1参与低密度脂蛋白的跨细胞转运,调节血脑屏障,干预肿瘤病理性的血管新生及肺内皮屏障功能,有望为动脉粥样硬化和脑卒中等心脑血管疾病及某些癌症提供新的治疗靶点.
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多药耐药相关蛋白4对脂多糖诱导的内皮细胞通透性及细胞骨架的影响
目的 探讨多药耐药相关蛋白4 (MRP4)对脂多糖(LPS)诱导的大鼠肺微血管内皮细胞(PMVECs)通透性及细胞骨架的影响.方法 PMVECs细胞株培养3至6代后随机分为4组,对照组(细胞不做任何处理)、LPS组(细胞仅接受LPS刺激)、shMRP4重组腺病毒组(Ad-shMRP4,将针对大鼠MRP4基因设计的短发夹RNA构建腺病毒载体上,通过腺病毒感染细胞+LPS刺激)、shRNA重组腺病毒组(Ad-shRNA,带绿色荧光蛋白基因空白的重组腺病毒载体感染细胞+ LPS刺激).通过荧光显微镜观察细胞感染率,Western botting检测MRP4的表达水平,Transwell小室法检测单层细胞通透性,激光共聚焦显微镜观察细胞内纤维肌动蛋白(F-actin)形态及分布情况.多组间差异采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验,以P＜0.05为差异有统计学意义.结果 与对照组比较,LPS组及Ad-shRNA组MRP4的表达水平显著上调(P＜0.05)、单层细胞通透性显著增加(2、6、12、24h分别为:0.28±0.02和0.41±0.04、0.32±0.02;0.30±0.01和0.53±0.04、0.39±0.03;0.33±0.04和1.12±0.17、0.70±0.07;0.32±0.03和0.79±0.02、0.57±0.05,P＜0.05),F-actin分布紊乱、重构以及应力纤维形成.与LPS组比较,Ad-shMRP4组MRP4的表达水平明显下调(P＜0.05)、单层细胞通透性明显降低(2、6、12、24 h分别为:0.41±0.04和0.32±0.02;0.53±0.04和0.39±0.03;1.12±0.17和0.70±0.07;0.79±0.02和0.57±0.05,P＜0.05),F-actin重构以及应力纤维形成显著减少.结论 MRP4基因沉默显著增减轻LPS诱导的内皮细胞通透性增高及细胞骨架破坏,对内皮细胞屏障发挥保护作用.
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高迁移率族蛋白1对人脐静脉内皮细胞骨架蛋白及通透性的影响
高迁移率族蛋白1(high mobility group box 1 protein,HMGBl)是一种重要的晚期炎症因子[1],参与急性胰腺炎的全身炎症反应[2],而急性胰腺炎患者血管内皮通透性增加是导致全身毛细血管渗漏、液体正平衡的直接原因.
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动态增强MRI在肝脏恶性肿瘤疗效评估中的临床应用
原发性肝癌严重威胁人类生命和健康，治疗手段包括外科手术切除、经肝动脉灌注栓塞化疗、消融治疗、放射治疗和中医治疗等［1］。无论采用何种治疗方法，早期、准确及定量评估疗效都具有重要临床意义［2］。目前，评价肝癌疗效的标准，如实体瘤疗效评价标准（ response evaluation criteria in solid tumors，RECIST），主要基于病变的影像形态径线改变进行判断［3］。随着对肝癌分子机制的认识，分子靶向治疗方法应运而生。研究表明，分子靶向治疗可显著延长肝癌患者的生存时间，且较手术、放疗和化疗等传统治疗手段，具有特异性强、疗效显著和不良反应小等优点［4-5］。分子靶向治疗通过抑制肿瘤新生血管生成或破坏肿瘤新生血管，从而抑制肿瘤生长，达到治疗目的，肿瘤治疗后可能并无径线改变。因此，如果使用传统的RECIST标准评价疗效，存在较大的局限性［6］。因而，有必要发展新的肿瘤疗效评价标准，从而可早期、准确及定量评估分子靶向药物的疗效［7］。动态增强MRI（dynamic contrast-enhanced MRI，DCE-MRI）是一种基于追踪及定量分析血管内注射的低分子量对比剂药代动力学特征的方法，可评估肿瘤组织的微环境，反映肿瘤组织内的血容量、血流量和内皮通透性等微观特征，能在肿瘤解剖学形态改变前定量评估肿瘤治疗的疗效，且还可用于预测预后［8］。笔者主要对DCE-MRI的基本原理、数据采集及分析方法，及DCE-MRI在评估肝脏肿瘤治疗反应中的应用进行综述。
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血脂异常与冠心病及其调脂治疗
经过多年的以及众多的大型临床实验研究证实:血脂异常是动脉粥样硬化、冠心病和脑血管疾病的重要致病因素.血浆高胆固醇(TC)、高甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)升高和高密度脂蛋白(HDL)降低可造成血管内皮细胞功能受损,内皮依赖性舒张功能降低,内皮通透性增加,加速动脉粥样硬化的发展;内皮细胞功能受损后,单核巨噬细胞向血管壁的浸润性增加,同时在高脂血症的影响下,单核巨噬细胞表面受体被修饰,吞噬脂质的作用增加,导致大量脂质和胆固醇聚集在浸入于血管内皮下的巨噬细胞之中,形成泡沫细胞,终形成内膜乃至中膜层中大量脂质和胆固醇的堆集.
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氢气对内皮-单核细胞黏附及内皮通透性的调节作用
目的 观察富氢液对脂多糖(LPS)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)与单核细胞的黏附及对血管内皮通透性的调节.方法 内皮细胞接种于6孔板,数字表随机分为4组(n=42):正常对照组(A组)、富氢液组(B组)、LPS组(C组)和LPS+富氢液组(D组),B、D组为饱和含氢培养液.待内皮细胞融合成单层后的6、12和24 h,分别加入单核细胞共培养90 min,瑞姬氏染色观察细胞黏附情况,酶联免疫吸附法(ELISA)测定细胞上清液血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)和E-选择素的浓度,蛋白印迹法检测血管内皮钙黏连蛋白(VE-cadherin)的表达,免疫荧光法检测24 h时VE-cadherin的分布.结果 与A组比,C组单核-内皮细胞黏附增多(P<0.05),E-选择素和VCAM-1浓度显著升高(P<0.05),VE-cadherin表达量明显减少(P<0.05);相比C组,D组细胞黏附减少(P<0.05),VCAM-1和E-选择素的水平下降(P<0.05),VE-cadherin表达量增加(P<0.05),3个时间点变化趋势相同.24 h荧光结果显示,与A组比,C组VE-cadherin在细胞连接处不完整;与C组比,D组VE-cadherin在细胞连接处较均匀完整.结论 富氢液可减少LPS诱导的黏附分子释放,抑制单核-内皮细胞黏附,并影响VE-cadherin的表达和分布,参与调节血管内皮通透性.
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百草枯所致血管内皮损伤与p120连环蛋白的关系及芒果苷的保护作用
目的 探讨百草枯中毒导致的内皮屏障功能障碍与p120连环蛋白(p120-ctn)的关系,以及芒果苷对p120-ctn的调节作用.方法 采用二室弥散模型培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC),并分为对照组(给予含10％胎牛血清的DMEM培养液)、百草枯组(给予终浓度为0.05 μmol/L的百草枯培养液)和芒果苷干预组(百草枯培养基孵育30 min后加入终浓度为20 μmol/L的芒果苷继续孵育).各组分别培养6、12、24、48、72 h后测定细胞通透性;采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)测定p120-ctn异构体p120-ctn 1A、p120-ctn 3A的mRNA表达及p120-ctn蛋白表达;采用免疫荧光分析并镜下观察p120-ctn的分布.结果 与对照组比较,百草枯组和芒果苷组细胞通透性均随时间延长呈增加趋势,于72 h达峰值[(29.86±3.98)％、(24.39±2.79)％比(11.71±1.67)％,均P＜ 0.05];而芒果苷组各时间点细胞通透性均显著低于百草枯组(均P＜0.05).百草枯处理6 h p120-ctn 1A、p120-ctn 3A的mRNA表达(灰度值)及p120-ctn蛋白表达(灰度值)即较对照组明显降低(p120-ctn 1A mRNA:0.150±0.024比0.433±0.024,p120-ctn 3A mRNA:0.316±0.043比0.701±0.020,p120-ctn蛋白:0.485±0.031比0.763±0.038,均P＜0.01);而芒果苷组p120-ctn 1A、p120-ctn 3A的mRNA表达及p120-ctn蛋白表达于干预6h即较百草枯组明显增加(p120-ctn 1AmRNA:0.281 ±0.021比0.150±0.024,p120-ctn 3A mRNA:0.602±0.042比0.316±0.043,p120-ctn蛋白:0.675±0.031比0.485±0.031,均P＜0.01),并均随时间延长呈增加趋势,于72 h达峰值(p120-ctn 1A mRNA:1.376±0.128比0.150±0.024,p120-ctn 3A mRNA:1.251±0.059比0.316±0.043,p120-ctn蛋白:0.844±0.050比0.485±0.031,均P＜0.01).荧光显微镜下观察,对照组p120-ctn主要分布在胞膜上,胞质内略有表达,胞核无表达;百草枯组随时间延长,细胞膜上p120-ctn表达逐渐减少,胞质和核内表达增多,细胞膜边缘模糊,细胞间隙增宽;芒果苷组相应时间点细胞膜上p120-ctn表达有所改善,胞质和核内表达减少.结论 p120-ctn下调与百草枯中毒后内皮通透性增加的机制相关,芒果苷可通过保护p120-ctn而减轻内皮损伤.
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多药耐药相关蛋白4过表达对脂多糖诱导血管内皮高渗透性的影响及其机制
目的 探讨多药耐药相关蛋白4(MRP4)基因过表达对脂多糖(LPS)诱导大鼠肺微血管内皮细胞(PMVECs)渗透性的影响及其分子机制.方法 体外培养PMVECs细胞,待细胞传至3~6代后分为3组:LPS组无血清培养基培养24 h后,用10μg/mL LPS刺激细胞;Ad-shRNA组用腺病毒空白载体转染细胞2 h,无血清培养基培养24 h后,用10μg/mL LPS刺激细胞;Ad-MRP4组用携带MRP4的重组腺病毒载体转染细胞2 h,无血清培养基培养24 h后,用10μg/mL LPS刺激细胞.于LPS刺激2、6、12、24 h采用Transwell小室法检测单层细胞渗透性;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞内环磷酸腺苷(cAMP)水平;激光共聚焦荧光显微镜下观察细胞内纤维型肌动蛋白(F-actin)形态及分布情况.于LPS刺激12 h收集细胞,采用蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测PMVECs中MRP4、β-连环蛋白(β-catenin)、血管内皮-钙黏蛋白(VE-cad)和紧密连接蛋白(ZO-1)的表达水平.结果 ①LPS刺激后PMVECs细胞渗透性及细胞内cAMP水平逐渐增加,12 h达到高峰,24 h开始下降.用携带MRP4的重组腺病毒载体转染PMVECs后,细胞渗透性较LPS组及Ad-shRNA组显著增加〔12 h渗透性(A值):1.88±0.06比1.12±0.17、1.10±0.18〕,细胞内cAMP水平显著降低〔12 h cAMP(μg/L):2.39±0.02比2.97±0.01、3.00±0.02,均P<0.05〕;而LPS组与Ad-shRNA组各时间点各指标差异均无统计学意义(均P>0.05).② 激光共聚焦荧光显微镜下显示,3组细胞均出现F-actin重构、应力纤维形成,但Ad-MRP4组细胞破坏程度较LPS组和Ad-shRNA组更加严重.③ 与LPS组和Ad-shRNA组比较,Ad-MRP4组PMVECs中MRP4蛋白表达显著上调(灰度值:0.76±0.03比0.44±0.02、0.43±0.02,均P<0.05),β-catenin、VE-cad和ZO-1蛋白表达显著下调〔β-catenin(灰度值):0.14±0.03比0.23±0.04、0.23±0.03;VE-cad(灰度值):0.21±0.01比0.34±0.02、0.35±0.04;ZO-1(灰度值):0.14±0.02比0.37±0.06、0.33±0.07,均P<0.05〕;而LPS组与Ad-shRNA组间各蛋白表达差异无统计学意义(均P>0.05).结论 MRP4基因过表达可降低细胞内cAMP水平,下调细胞间连接蛋白表达,从而增加LPS诱导的血管内皮渗透性.
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血管内皮通透性调节机制新进展
血管内皮是沿着血管内侧生长,调节液体和溶质在血液和周围组织之间流动的半渗透屏障.它是由血管内皮细胞通过细胞间的连接而形成的单细胞层屏障,覆盖于所有的血管和淋巴管的内表面,将血管与周围的组织隔开并控制着两者之间的物质运输.这种控制物质运输的能力即为血管内皮的通透性,这种通透性依存于血管内皮的完整性.
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不均一性核糖核蛋白A2/B1在脂多糖诱导的血管内皮细胞通透性增加中的作用
目的 探讨不均一性核糖核蛋白A2/B1(heterogeneous ribonucleoprotein A2/B1,hnRNP A2/B1)在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)通透性中的作用.方法以HUVECs为研究对象,筛选出具有hnRNP A2/B1基因沉默作用的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),按不同处理方法实验分为转染阴性对照siRNA组(NC siRNA组)、 转染hnRNP A2/B1 siRNA组(hnRNP A2/B1 siRNA组)、 转染阴性对照siRNA组并进行LPS干预组(NC siRNA组-LPS组)、转染hnRNP A2/B1siRNA组并进行LPS干预组(hnRNP A2/B1 siRNA组-LPS组),分别给予或不给予LPS(1 mg/L)刺激,检测不同时间点(0、6、12、24 h)各组细胞跨膜电阻抗(transendothelial electrical resistance,TEER)值,检测LPS刺激12 h后细胞表面血管内皮钙黏蛋白(vascular endothelial cadherin,VE-cadherin)及细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)蛋白表达变化.结果在相同剂量LPS诱导下,hnRNP A2/B1 siRNA-LPS组HUVECs的TEER在12 h低于NC siRNA-LPS组(P<0.05);在LPS刺激12 h后,hnRNP A2/B1 siRNA-LPS组HUVECs表面VE-cadherin表达明显低于NC siRNA-LPS组,ICAM-1表达明显高于NC siRNA-LPS组(P<0.05).结论hnRNP A2/B1可能通过调节VE-cadherin及ICAM-1蛋白表达影响血管内皮细胞的通透性,发挥血管内皮屏障保护功能.
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Caveolae介导的跨细胞转运与血管内皮通透性
由小凹(Caveolae)介导的白蛋白跨细胞转运在生理及病理状态下均起重要作用.非受体型蛋白酪氨酸激酶(Src)是这一转运过程的"分子开关",Src激酶将糖蛋白60(Gp60)、小凹蛋白-1(Caveolin-1,Cav-1)及发动蛋白-2(Dynamin-2)磷酸化,启动内吞过程;炎症状态下,中性粒细胞通过细胞间黏附分子-1(ICAM-1)激活Src激酶,从而促进Caveolae介导的白蛋白转运.
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丙泊酚抑制H2O2诱导的内皮细胞通透性增加
目的 探讨丙泊酚对H2 O2诱导的内皮通透性增加的影响.方法 实验一:分别用0、0.2、0.4、0.6和0.8 mmol/L H2O2刺激人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)后通过测量跨细胞电阻(TER)以观察H2O2对HUVECs通透性的影响.实验二:随机分为对照组(C组,无处理)、PBS组(等体积PBS)、丙泊酚1组(P1组,丙泊酚20 μmol/L)、丙泊酚2组(P2组,丙泊酚50 μmol/L)、丙泊酚3组(P3组,丙泊酚100μmol/L)及脂肪乳剂组(工组,等体积脂肪乳剂).按实验设计预处理30 min后,选用0.6mmol/L H2O2刺激HUVECs 60 min(C组无处理),然后分别以TER、免疫荧光染色、western blot检测内皮细胞通透性、细胞肌动蛋白(F-actin)形态学、ERK1/ERK2及p38磷酸化水平.结果 与0mmol/L H2 O2比较,0.4、0.6、0.8 mmol/LH2O2刺激后30～180 min HUVECs TER明显减少(P＜0.05),刺激60 min HUVECs TER明显减少并达到峰值,而后均呈恢复趋势,而且0.6、0.8mmol/L H2O2刺激后HUVECs TER明显低于0.4mmol/L H2O2 (P＜0.05).与C组比较,0.6mmol/L H2O2刺激后15～60 min PBS组、P1组、Ⅰ组和刺激后45、60 min P2组、P3组HUVECs TER明显减少(P＜0.05).与PBS组比较,刺激后30～60min P2组、P3组HUVECs TER明显增加(P＜0.05).与P2组比较,刺激后30～60 min P1组、Ⅰ组HUVECs TER明显减少(P＜0.05).C组F-actin集中分布在内皮细胞周边,无应力纤维形成;PBS组F-actin在细胞内非极性排列成束,应力纤维形成;P2组H2O2诱导的F-actin细胞内束集及应力纤维形成明显得到改善;Ⅰ组应力纤维形成.与C组比较,PBS组、P2组和Ⅰ组内皮细胞ERK1/ERK2及p-38磷酸化水平明显升高(P＜0.05).与PBS组比较,P2组内皮细胞ERK1/ERK2及p-38磷酸化水明显降低(P＜0.05).结论 丙泊酚可以抑制H2 O2诱导HUVEC通透性增高,其分子机制可能与抑制p38及ERK1/2信号通路激活有关.
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Rho GTP酶调节肺血管内皮屏障的研究进展
血管内皮是由单层连续的内皮细胞( endothelial cells, EC)和基膜组成的一层半选择性通透屏障,它决定血管内外溶质和液体的交换,并影响肺泡的有效气体交换及血管新生等生理过程。许多炎性介质,如组胺、凝血酶、血管内皮生长因子等均可损伤血管内皮屏障功能,导致其通透性增高,血浆蛋白渗出,引起组织、器官水肿和功能障碍。血管内皮屏障功能障碍是炎症的主要特征之一,并参与肿瘤转移、免疫反应及多器官功能障碍的发生。 Rho GTP酶在细胞的信号转导过程中作为信号转换器,通过调控细胞骨架,在血管通透性增高的疾病中发挥重要作用,本文就Rho GTP酶调节血管内皮屏障功能的研究进展作一概述。
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Rho/Rho激酶信号通路与血管内皮通透性的研究
Rho/Rho激酶信号通路是体内普遍存在的一条信号通路,它通过调节细胞内肌动蛋白骨架的聚合状态而扮演着"分子开关"的角色,参与细胞形态维持、细胞粘附与迁移、细胞增殖与凋亡、基因转录、平滑肌收缩等多种生物学行为.Rho/Rho激酶信号通路在血管内皮通透性的病理生理过程中发挥了重要作用,抑制Rho/Rho激酶信号通路取得了显著的内皮保护作用.
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辛伐他汀对不同氧供条件下大鼠脑微血管内皮细胞跨内皮电阻及MMP-9表达的影响
目的:观察在常氧、短暂缺氧、持续缺氧及复氧条件下,辛伐他汀对大鼠脑微血管内皮细胞(BMECs)跨内皮细胞电阻(TEER)及基质金属蛋白酶-9 (MMP-9)表达的影响.方法:原代分离培养SD大鼠BMECs,随机分为常氧组、短暂缺氧组、持续缺氧组、复氧组,各组均实施辛伐他汀0.1μmol/L、1.0μmol/L、10μmol/L 3种浓度预处理.观察各组细胞形态学及增殖活性变化;采用TEER评估各组通透性;免疫细胞荧光化学法测定MMP-9蛋白表达.结果:短暂缺氧、持续缺氧及复氧条件下大鼠BMECs 细胞受损逐渐加重,MMP-9表达逐渐增加,TEER 及细胞增殖活性逐渐下降.辛伐他汀干预能不同程度提高TEER并抑制MMP-9蛋白的表达,使细胞增殖活性提高.但这种抑制MMP-9的作用对短暂缺氧大鼠BMECs的TEER值及细胞增殖活性无显著改善.结论:辛伐他汀能通过抑制MMP-9蛋白的表达来提高持续缺氧及复氧条件下大鼠BMECs的TEER,而对短暂缺氧后TEER的改善作用不明显.
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自噬减轻模拟缺血／再灌注微环境中肺微血管内皮细胞损伤
目的：观察体外模拟缺血／再灌注（ ischemia／reperfusion，I／R）微环境下人肺微血管内皮细胞（ hu-man pulmonary microvascular endothelial cells，HPMVECs）的自噬变化，研究自噬在维持I／R条件下HPMVECs细胞存活及内皮屏障完整性中的作用。方法：用雷帕霉素（ rapamycin，RAP）预处理HPMVECs，在缺糖缺氧／恢复糖和氧供（ oxygen-glucose deprivation／oxygen-glucose restoration，OGD）模拟的I／R微环境中孵育细胞。应用Western blot及透射电镜法检测细胞自噬变化，用流式细胞术检测细胞凋亡，通透性小室法检测HPMVECs通透性。结果：OGD条件下HPMVECs的自噬水平明显升高，RAP预处理进一步上调了OGD条件下的细胞自噬。 OGD组细胞凋亡率明显增高，细胞通透性增加。 RAP预处理不仅降低了OGD引起的细胞凋亡率，而且减轻了OGD条件下细胞通透性。结论：自噬在I／R诱发的肺微血管内皮细胞损伤中发挥保护性作用，提高自噬水平有助于减少I／R条件下细胞凋亡并维持内皮屏障完整性。
