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地高辛抑制豚鼠心室肌细胞Na+,K+-ATP酶和人胚肾上皮细胞系HERG钾通道电流
强心苷类药对Na+,K+-ATP酶的作用在低浓度时为兴奋、在高浓度时呈抑制作用[1].应用膜片钳技术观察地高辛(Digoxin)对豚鼠心室肌细胞Na+,K+-ATP酶电流(Ip)的作用还未见报道.此外,由于很多药物的心脏不良反应是通过抑制人ether-a-go-go-related基因(HERG)编码的快速激活的延迟整流钾通道(Ikr)而引起QT间期延长和尖端扭转性室速(TdP)[2].本研究初步探讨地高辛对豚鼠心室肌细胞Ip电流和对人胚肾上皮细胞系(human embryonic kidney cell line,HEK-293)上HERG/Iκr钾通道的影响及地高辛治疗心功能不全和引起心脏毒性反应的机制.1材料与方法1.1动物、细胞系、质粒来源及地高辛配制:普通级豚鼠,8～12周龄,体质量250 ～ 300 g,雌雄不拘,由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供[合格证号SCXK(鄂)2004-007].HEK-293细胞,中国科学院上海生科院细胞资源中心.编码Ikr的HERG基因的真核细胞表达载体pcgi-EGFPHERG(南京师范大学生命科学院张朝教授馈赠).地高辛(郑州大学药学院药物化学研究所提供)溶于二甲基亚砜中配制成10 mmol/L的母液.
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原代培养大鼠肝细胞的基因转染
目的:研究原代培养大鼠肝细胞的基因转染的方法.方法:采用胶原酶灌注法获取原代培养大鼠肝细胞.利用脂质体转染法将含有绿色荧光蛋白(GFP)和Neo基因的真核细胞表达载体(pEGFP-N3)转染原代培养大鼠肝细胞.用荧光显微镜观察和Neo基因原位杂交染色方法检测肝细胞内基因表达情况.结果:获取的原代大鼠肝细胞活细胞率达95%.荧光显微镜下观察可见转染基因的细胞可发出绿色荧光,原位杂交显示有Neo基因的表达.结论:pEGFP-N3基因可转入大鼠肝细胞并获得表达,可用于标记原代培养的大鼠肝细胞,有利于研究肝细胞移植后移植的肝细胞在体内的分布及功能.
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C6胶质瘤细胞多药耐药基因启动子靶向的双自杀基因表达载体的构建及鉴定
目的克隆多药耐药基因(MDR1)启动子,构建并鉴定MDR-1启动子靶向的CD、TK双自杀基因表达载体.方法提取耐药胶质瘤细胞株C6/ADR的基因组DNA,通过PCR方法选择性扩增多药耐药MDR1启动子片段,连接到T载体上,酶切后定向克隆入pcDNA3.TK载体上的CMV启动子位置,然后从pcDNA3.CD.TK上酶切下CD片段并插入上述载体形成pcDNA3.MDR1P.CDTK,通过电泳及DNA测序对其进行鉴定.结果通过PCR方法扩增出了MDR1启动子片段,并连接到T载体上,然后成功克隆入pcDNA3.TK中,形成pcDNA3.MDR1P.TK,将pcDNA3.CD.TK上的CD基因切下后插入pcDNA3.MDR1P.TK,电泳及DNA测序证实连接准确.结论成功构建了含正确MDR1启动子靶向的双自杀基因表达载体pcDNA3.MDR1P.CDTK,为今后靶向治疗耐药肿瘤构建载体提供了实验基础.
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成肌细胞在肌肉骨骼系统疾病基因治疗中的应用研究进展
基因治疗,就是利用分子生物学的方法将目的基因转入靶细胞内,通过靶细胞表达目的基因产物治疗疾病的方法.基因治疗主要有两种途径:即in vivo 及ex vivo 方式.in vivo 途径即体内基因治疗,是将外源基因装配于特定的真核细胞表达载体,直接导入体内.ex vivo 途径也称"回体基因治疗",是将含有外源基因的载体在体外导入自体或异体(异种)细胞,经体外细胞扩增后,输回自体.此方法易于操作,并且使用自体细胞有利于解决安全性问题.
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短发夹高迁移率族蛋白B1真核细胞表达载体通过HOXA9下调人脐静脉血管内皮细胞表达E-选择素
目的：探讨高迁移率族蛋白B1（HMGB1）基因表达对人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）激活表达E-选择素的分子机制。方法将同源盒转录因子（HOXA9）小干扰RNA（siRNA）短序列转染至对数生长期的HUVEC，采用实时荧光定量聚合酶链反应（实时qPCR）和蛋白质免疫印迹试验（Western Blot）检测其对HOXA9 mRNA和蛋白表达的影响；另设空白对照组和无意序列nonsilence阴性对照组。取已经稳定转染pRNA-u6.1/Neo-HMGB1 shRNA质粒的HUVEC（低表达HMGB1的HUVEC），采用实时qPCR法检测HOXA9和E选择素的mRNA表达；另设nonsilence转染组作为阴性对照。将HOXA9 siRNA转染至低表达HMGB1的HUVEC中作为共同转染组，采用实时qPCR法检测E-选择素的mRNA表达；以HMGB1 shRNA组和HOXA9 nonsilence组作为对照。结果①空白对照组HOXA9 mRNA（2-ΔΔCT）和蛋白（积分A值）表达分别为1.094±0.115和1.031±0.060。与无意序列nonsilence转染组比较， HOXA9 siRNA转染组可显著降低HUVEC细胞中HOXA9的mRNA和蛋白表达〔HOXA9 mRNA（2-ΔΔCT）：0.257±0.030比1.035±0.091，t＝14.010，P＝0.002；HOXA9蛋白（积分A值）：0.278±0.042比0.975±0.014，t＝27.310，P＝0.002〕。②与nonsilence转染组比较， HMGB1 shRNA转染上调了HUVEC中HOXA9 mRNA（2-ΔΔCT）表达（2.519±0.278比0.856±0.063，t＝10.100， P＝0.001），同时下调了E-选择素mRNA（2-ΔΔCT）表达（0.311±0.046比1.080±0.201，t＝7.415，P＝0.000）。③与HOXA9 nonsilence组及HMGB1 shRNA组比较，HMGB1 shRNA和HOXA9 siRNA共同转染后HUVEC细胞中E-选择素 mRNA（2-ΔΔCT）表达明显升高（3.445±0.428比1.085±0.212、1.004±0.104，t1＝8.507， t2＝9.603，均P＜0.001）。结论 HMGB1在HUVEC细胞核内可能通过HOXA9调节E-选择素的表达。
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外源性p53基因对人卵巢癌细胞的生物学行为及化疗放疗敏感性的影响
p53基因是至今发现与人类恶性肿瘤相关性高的基因, 约50%的人类恶性肿瘤中存在p53基因的异常[1].近年还发现p53功能异常与肿瘤对化疗、放疗的不敏感有关[2,3].因此在基因治疗的研究中p53基因的地位十分突出.卵巢肿瘤是妇科常见的恶性肿瘤,难于早期诊断,死亡率高.已发现45%～80%的卵巢肿瘤伴有p53基因的异常[4,5].因此我们构建了人野生型p53基因的真核细胞表达载体并转染人卵巢癌SKOV-3细胞,观察其对卵巢癌细胞的生物学行为及化疗、放疗敏感性的影响.1 资料与方法1.1 一般资料1.1.1 酶及主要试剂限制性内切酶及T4连接酶购于美国Promega公司.G418(geneticin)及脂质体(lipofectin)购于美国GIBCO公司.p53单克隆抗体(DO-1)及辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗购于北京中山生物技术公司.1.1.2 基因、载体和受体菌质粒pGEX-p53含有人野生型p53cDNA由起始至终止密码的序列.真核表达载体pcDNA3为本室所有,受体菌为DH5α.
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HMGB1基因真核细胞表达载体的构建及其在人脐静脉血管内皮细胞中的表达
目的 构建HMGB1基因真核细胞表达载体并检测其在真核细胞中的表达.方法 提取人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)总RNA,反转录为cDNA.PCR扩增HMGB1全长编码基因,构建成pcDNA-3.1-myc-his-B-HMGB1真核细胞表达载体.转染HUVEC,Western blot检测转染后HMGB1基因的表达改变.结果 构建HMGB1全长基因真核细胞表达载体成功,酶切鉴定及测序鉴定表明载体构建正确,转染HUVEC后可检测到外源性蛋白的表达,对照组无外源性蛋白表达.结论 成功构建了HMGB1全长基因真核细胞表达载体并可转染至HUVEC中.
关键词： 高迁移率族蛋白1基因 人脐静脉血管内皮细胞 真核细胞表达载体 转染 -
淋球菌孔蛋白基因克隆及其在真核细胞中的表达
在许多发展中国家,淋病仍然是一种常见性病,加强淋球菌疫苗研制等预防措施的研究显得非常迫切[1].由于淋球菌自然感染诱导非保护性免疫,早期全细菌疫苗实验的免疫效果不理想,促使人们用纯化淋球菌抗原作进一步研究.淋球菌孔蛋白(porin)具有较强的免疫原性和相对缓慢的抗原变异性,是目前淋球菌疫苗研究的热点.我们克隆了淋球菌孔蛋白全长基因,并成功构建真核细胞表达载体.
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WWOX基因真核细胞表达载体的构建与鉴定
目的 构建人WWOX基因真核细胞表达载体.方法 采用RT-PCR方法 ,从人新鲜卵巢组织的总RNA中扩增出1245 bp的人WWOX cDNA片段, 然后用Hind III和Eco RI双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA 3.1中,用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒.结果 WWOX基因的序列测定结果 与文献报道完全一致,其真核细胞表达载体被成功构建.结论 成功克隆出WWOX基因,并成功构建其真核细胞表达载体.
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HBV全基因C区突变株在永生化B淋巴母细胞系中的稳定表达
目的构建携带V60、G87和L97突变位点的HBV全基因组真核表达载体,转染慢性HBV感染者永生化B淋巴母细胞系(LCLs).方法用定点突变技术将HBVp3.8Ⅱ质粒C基因区3个氨基酸V60、G87、L97进行突变(p3.8Ⅱ-V60,G87,L97),转化E.coli.XL1-Blue感受态细胞扩增筛选,用限制性内切酶SacⅠ和Kpn Ⅰ分别将野生型和突变型p3.8Ⅱ质粒进行双酶切,插入EBV-plpp真核细胞表达载体,转染LCLs,潮霉素稳定筛选后,鉴定目的基因在转染细胞能够稳定表达.结果与结论 DNA序列分析表明,野型HBV DNA核心区第60、87、97位氨基酸发生了预期的突变,Western Blotting和微粒子免疫荧光法证明转染的LCLs能稳定表达HBV抗原,证实成功构建了预期细胞模型.
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RNA干扰EGFR基因家族真核表达载体的构建
目的:构建针对表皮生长因子受体(Epidermal growth factor recepter,EGFR)家族的小分子发夹状RNA(Small hairpinRNA,shRNA)干扰质粒表达载体,为本课题下一步研究提供有力_T具.方法:选择放疗不敏感的卵巢癌细胞SKOV3中高表达的EGFR家族同源性基因为靶基因,根据shRNA的设计原则,设计实验组及对照组shRNA.体外合成2段编码短发夹RNA序列的DNA单链,退火,克隆到相应载体pGensil-1的polⅢ启动子下游.结果:经酶切和DNA测序鉴定成功构建了EGFR家族同源性基因的RNA干扰表达载体,分别命名为pGensil-1-E及pGensil-1-C.为下一步体外、体内实验奠定了基础.
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抗菌及中和内毒素蛋白葛佬素的克隆、表达
目的:观察人工设计葛佬素的Cdna序列表达产物是否具有抗菌及中和内毒素作用.方法:采用统计学方法,统计同种族蛋白质的Cdna序列氨基酸的偏爱密码子,并以此为基础设计葛佬素的Cdna序列,将合成的葛佬素Cdna插入真核细胞表达载体Pcdsi中后转染CDS7细胞,对转染的COS7细胞上清进行杀菌及中和内毒素活性的检测.结果:转染的COS-7细胞上清进行杀菌及中和内毒素活性.结论:人工设计葛佬素的Cdna序列设计正确,其表达产物具有抗菌及中和内毒素作用.
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定点诱变HBcAg质粒在人永生化B淋巴母细胞系中的稳定表达
目的:构建携带V60, G87, L97突变位点的HBV全基因组真核细胞表达载体,转染慢性HBV感染者永生化B淋巴母细胞系(LCL),建立相同HLA背景下的慢性HBV感染CTL应答的刺激细胞和靶细胞.方法:用定点突变技术在HBVp3.8Ⅱ质粒C基因区3个氨基酸V60, G87, L97位置进行突变(p3.8Ⅱ- V60, G87, L97),转化E. coli XL1-Blue感受态细胞扩增筛选,用限制性内切酶SacⅠ和KpnⅠ分别将野生型和突变型p3.8Ⅱ质粒进行双酶切, 插入EBO-plpp真核细胞表达载体,转染LCL,潮霉素稳定筛选后,鉴定目的基因在转染细胞是能够稳定表达.结果:DNA序列分析表明,野型HBV DNA核心区第60, 87, 97位氨基酸发生了预期的突变,Western Blot和微粒子免疫荧光法证明,转染的LCL能稳定表达HBV 抗原.结论:定点诱变HBcAg质粒在人永生化B淋巴母细胞系中可稳定表达.
