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纳米SiO2对HaCaT细胞基因组DNA总体甲基化水平的影响
目的 检测纳米SiO2( nano-SiO2)暴露的体外培养的人皮肤表皮细胞(HaCaT)基因组DNA总体甲基化水平及DNA甲基转移酶DNMT1的表达改变.方法 应用5-甲基胞嘧啶免疫荧光法和流式细胞定量分析法检测nanoSiO2(0、2.5、5和10μg/ml)和10 μg/ml微米级二氧化硅(micro-SiO2)以及DAC组(10 μg/ml nano-SiO2+3μm DAC)暴露后细胞基因组DNA整体甲基化变化趋势,以Real-time Q-PCR和Western blot方法检测DNMT1的mRNA和蛋白的表达变化.结果 与对照细胞组相比,5-甲基胞嘧啶免疫荧光强度逐渐降低,在nano-SiO2致HaCaT细胞损伤的过程中,DNA的总体甲基化程度有随nano-SiO2浓度升高而降低的趋势,同剂量的纳米暴露组与溶剂对照组及微米级对照组相比具有更低的基因组DNA甲基化水平.流式细胞定量分析实验结果显示,溶剂对照组的平均荧光荧光强度为153.43,不同浓度的nano-SiO2处理细胞24h(2.5,5和10 μg/ml)后,其平均荧光强度分别为76.32,53.26和55.16,溶剂对照组和微米对照组( Micro-SiO2)的甲基化程度差异没有统计学意义.DNMT1的mRNA和蛋白表达水平一致,在细胞暴露于nano-SiO2过程中,DNMT1表达呈下降趋势.结论 本试验条件下,基因组DNA甲基化水平的降低可能与DNMT1水平降低有关.
关键词： nano-SiO2颗粒 HaCaT DNA甲基化 DNMT1 -
细胞复制性衰老及过氧化氢诱导的早衰过程中基因组DNA甲基化水平改变
目的 检测体外培养的人胚肺成纤维细胞复制性衰老及过氧化氢诱导的细胞早衰过程中基因组DNA甲基化及甲基转移酶DNMT1的表达改变.方法 应用5-甲基胞嘧啶免疫荧光法及[~3H]甲基掺人法检测细胞衰老不同阶段细胞基因组DNA整体甲基化变化趋势,以Q-PCR和Western Blot方法检测DNMT1的mRNA和蛋白表达变化.结果 细胞复制性衰老过程及早衰过程中,与年轻细胞组相比,5-甲基胞嘧啶免疫荧光强度逐渐降低,[~3H]甲基掺入实验结果显示,甲基化的CpG%分别为年轻细胞组68.2%,中年细胞组41.9%,复制性衰老组16.1%,而早衰起始组63.5%,早衰持续组18.0%.DNMT1的mRNA和蛋白表达水平一致,在细胞复制性衰老过程中,DNMT1表达呈下降趋势,复制性衰老细胞组表达水平低,而早衰起始组DNMT1表达显著升高,早衰持续组又降低至同复制性衰老组水平.结论 本试验条件下,在细胞复制性衰老及早衰过程中,基因组DNA甲基化水平逐渐降低,基因组低甲基化是衰老细胞的伴随状态,与DNMT1水平降低有关.
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DNMT1和DNMT3B基因多态性与食管癌发病风险的关联分析
目的 探讨DNMT1基因多态性位点(rs16999593,rs2228611)和DNMT3B基因多态性位点(rs2424908)的基因型与食管癌及其病理参数的关联.方法 采用病例对照研究,使用MassARRAY检测技术对258例食管癌患者和260例健康对照的3个多态性位点基因型分布进行分析.采用Logistic回归模型分析各基因型与食管癌发生的关系并比较不同基因型与食管癌病理参数的关系.结果 DNMT1基因rs16999593位点TC基因型(OR =0.69,95％ CI:0.47～1.00)和rs2228611位点GA基因型(OR =0.67,95％ CI:0.46 ～0.98)与食管癌的低风险相关,rs16999593 TC、CC基因型与食管癌分化程度相关(中分化:TC vs.TT:OR =0.53,95％ CI:0.33 ～0.86;低分化:CC vs.TT:OR=2.79,95％ CI:1.12～6.91),rs2228611 GA基因型与高分化食管癌(GA vs.GG:OR=0.47,95％ CI:0.25 ～0.88)和无周围淋巴结转移(GA vs.GG:OR=0.62,95％ CI:0.39 ～0.98)有关,DNMT3B基因rs2424908 CC基因型与肿瘤Ⅲ～Ⅳ分期(CC vs.TT:OR=0.38,95％CI:O.15～0.92)及远端淋巴结转移(CC vs.TT:OR =0.18,95％ CI:0.40 ～0.80)相关.结论 本研究发现rs16999593和rs2228611位点与食管癌的发生及分化程度相关,rs2228611和rs2424908位点和淋巴结转移相关,rs2424908位点和肿瘤分期有相关性.
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K562细胞中DNMT1与SHP-1启动子2甲基化关系的研究
目的:探讨慢性髓系白血病(CML)急变细胞系K562细胞中DNA甲基转移酶1(DNMT1)与造血细胞磷酸酶(SHP-1)基因表达及其启动子2的甲基化状态的关系.方法:分析NCBI数据库中SHP-1基因启动子2启动子区序列.将携带DNMT1 shRNA的psiHIV-mU6-shDNMT1和樱桃色荧光蛋白(mcherryFP) psiHIV-mU6-control 的慢病毒干扰载体感染K562细胞系.应用甲基化特异的聚合酶链反应(MSP)和亚硫酸氢盐修饰后测序法(BSP)检测K562细胞中SHP-1基因启动子2的甲基化状态,Western blot检测SHP-1、DNMT1蛋白的表达水平,SYBRGreen荧光定量PCR检测SHP-1 mRNA的表达.结果:SHP-1基因启动子2在-353 bp-+182 bp区有22个CpG岛,K562细胞中SHP-1基因启动子2异常高甲基化且SHP-1蛋白表达缺失.K562细胞转染psiHIV-mU6-shDN-MT1后DNMT1表达水平为0.48±0.06,较转染psiHIV-mU6-control组明显降低(1.33±0.19) (t=4.18,P=0.014).K562细胞中SHP-1蛋白表达缺失,转染psiHIV-mU6-shDNMT1后K562细胞SHP-1蛋白恢复表达,转染psiHIV-mU6-shDNMT1的K562细胞中SHP-1 mRNA相对表达水平(14.23±3.83)较转染psiHIV-mU6-control组(1.031±0.156)高(P=0.004).DNMT1基因沉默后SHP-1基因启动子2中CpG岛去甲基化.结论:K562细胞中DNMT1与SHP-1启动子2的异常甲基化及沉默相关.
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Runx3、Rassf1a基因启动子在胃癌组织中的高甲基化及Dnmt1的表达
目的:探讨人类相关转录因子3(human runtrelated transcription factor 3,Runx3)、Ras相关区域家族1A(ras-association domain family 1a,Rassf1a)基因启动子区的甲基化和甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1,Dnmt1)基因的表达与胃癌发生的关系及临床意义.方法:采用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation specific PCR,MSP)检测68例胃癌组织及其相应癌旁正常组织中Runx3、Rassf1a基因启动子区甲基化状态;同时应用实时荧光定量逆转录-多聚合酶链反应(real-time RTPCR)和免疫组织化学SP法分别检测基因的Runx3、Rassfla、Dnmt1 3个基因mRNA和蛋白的表达情况.结果:胃癌组织中Runx3、Rassf1a基因的甲基化阳性率较正常组织明显升高(45.59％ vs 10.29％; 64.70％ vs 7.35％).胃癌组织中Runx3 和Rassf1a mRNA阳性表达率明显低于正常组织(36.76％ vs 100％; 27.94％ vs 97.06％),而胃癌组织中Dnmt1 mRNA阳性表达率则明显高于正常组织(80.88％ vs 17.65％),差异均有统计学意义差异.胃癌组织与正常组织RUNX3、RASSF1a、DNMT1蛋白与mRNA表达基本相一致.Runx3 mRNA、Rassf1amRNA阴性表达的胃癌组织中其基因启动子的甲基化率较阳性表达者明显升高(72.09％vs0;85.71％ vs 2.94％),差异具有统计学意义.胃癌组织中RUNX3、RASSF1a与DNMT1蛋白的表达均呈负相关(r=-0.627,P＜0.0001;r=-0.477,P＜0.0001).结论:Runx3、Rassf1a基因启动子区的高甲基化及Dnmt1基因高表达可能与胃癌发生有关.
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烧伤创面愈合后瘢痕组织成纤维细胞 DNA 甲基化初步研究
目的 研究探讨烧伤创面愈合后不同时期瘢痕组织中成纤维细胞DNA甲基转移酶1(DNMT1)的表达及意义.方法 收集烧伤创面愈合后不同时期的瘢痕组织标本(早期、增生期、消退期、成熟期)和正常皮肤组织标本作为研究对象,采用免疫组织化学方法检测瘢痕组织及正常皮肤组织中成纤维细胞内DNMT1的表达,并比较各组之间的差异; 采用RT-PCR技术检测瘢痕组织及正常皮肤组织中成纤维细胞内DNMT1 mRNA的表达,并比较各组之间的差异.结果 瘢痕组织形成早期,成纤维细胞内DNMT1的表达水平逐渐升高(免疫组化评分: 8.57 ± 1.83),并于增生期达到高峰(10.41 ± 1.58),消退期(7.17 ± 1.19)及成熟期(4.90 ± 0.88)逐步降低,而正常皮肤组织中成纤维细胞的表达呈阴性或弱阳性(0.81 ± 0.87),组间差异具有统计学意义(P=0.000,P＜0.01); RT-PCR技术检测的DNMT1 mRNA的表达水平在各组中的差异与免疫组织化学方法的检测结果一致(P=0.000,P＜0.01).结论 成纤维细胞DNMT1在烧伤创面愈合后瘢痕组织的形成过程中发挥着重要作用,DNA甲基化可能参与了烧伤创面愈合后瘢痕的发展与演变.
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重组人DNMT1真核表达质粒对胆管癌细胞DNMT1基因mRNA水平及细胞生长曲线的影响
目的观察重组人DNMT1真核表达质粒转染对胆管癌细胞DNMT1基因mRNA表达水平和细胞生长曲线的影响.方法将构建好的正义和反义DNMT1真核表达质粒用脂质体转染入人胆管癌细胞株QBC-939,然后用G418进行筛选,得到阳性克隆细胞株后,用半定量RT-PCR检测DNMT1基因的mRNA水平的变化,用MTT法观察细胞生长曲线.结果正义DNMT1真核表达质粒能使QBC-939细胞中的DNMT1基因的mRNA水平增加,而反义DNMT1真核表达质粒则使其mRNA水平降低;正义质粒可使QBC-939细胞增殖速度加快,反义质粒使其增殖速度减慢.结论重组人DNMT1真核表达质粒转染能影响胆管癌细胞DNMT1基因的mRNA表达水平和细胞生长曲线.
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膀胱癌组织MAGE-A3表达变化机制研究
目的 膀胱癌是常见的恶性肿瘤之一,严重危害人类健康.本研究检测膀胱癌组织中黑色素瘤抗原3(mela-noma-associated antigen 3,MAGE-A3)的表达变化并探讨其内在机制,为膀胱癌的防治提供理论基础.方法 收集2013-06-01-2016-05-31武汉科技大学附属武昌医院泌尿外科膀胱癌患者120例,取术中切取的膀胱癌组织和正常膀胱组织(距离肿瘤边缘>3 cm).实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)和蛋白质印迹法检测膀胱癌组织和正常膀胱组织中MAGE-A3,DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)及常染色体组蛋白赖氨酸甲基转移酶2(euchromatic histone-lysine N-methyltransferase 2,EHMT2)mRNA和蛋白表达变化;巢式降落式甲基化特异性PCR(nested methylated specific PCR,nMS-PCR)检测膀胱癌组织和正常膀胱组织中MAGE-A3启动子区DNA甲基化水平变化;染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,CHIP)检测膀胱癌组织和正常膀胱组织中MAGE-A3启动子区组蛋白H3K9二甲基化(H3K9me2)水平.结果膀胱癌组织中MAGE-A3 mRNA相对表达量为5.41±0.85,蛋白相对表达量为0.76±0.08;正常膀胱组织中MAGE-A3 mRNA相对表达量为0.92±0.15,蛋白相对表达量为0.20±0.07,两组比较差异有统计学意义,t值分别为15.56和15.60,均P=0.001.膀胱癌组织中DNMT1 mRNA相对表达量为0.37±0.10,蛋白相对表达量为0.36±0.10;EHMT2 mRNA相对表达量为0.81±0.09,蛋白相对表达量为0.27±0.08.正常膀胱组织中DNMT1 mRNA相对表达量为1.02±0.25,蛋白相对表达量为0.91±0.15,RNA相对表达量为4.32±0.82,蛋白的相对表达量为1.09±0.17,两组比较差异有统计学意义,t值分别为5.95,9.16,11.58,11.08,均P<0.001.膀胱癌组织中MAGE-A3启动子区DNA甲基化水平为0.27±0.07,H3K9me2水平为0.25±0.13;正常膀胱组织MAGE-A3启动子区DNA甲基化水平为0.73±0.08,H3K9me2水平为0.61±0.24,两组比较差异有统计学意义,t值分别为7.189和3.860,均P<0.001.结论膀胱癌组织中MAGE-A3启动子区DNA甲基化及H3K9me2水平降低使MAGE-A3表达量升高,此机制可能参与膀胱癌的发生发展.
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胃癌组织runt相关转录因子3基因表达与其甲基化状态的关系
目的 探讨胃癌组织中DNA甲基化调控机制对runt 相关转录因子3(Runx3)基因表达的影响.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测70例胃癌组织及其配对的正常胃黏膜组织中Runx3 mRNA表达,Westen blot法检测Runx3蛋白表达,甲基化特异性PCR(MSP)法检测Runx3基因启动子的甲基化状态;应用RT-PCR法检测 DNA甲基转移酶1(Dnmt1)mRNA表达,分析Runx3基因甲基化与Dnmt1 mRNA表达之间的相关性. 结果胃癌组织中Runx3 mRNA表达(0.5740±0.3580)明显低于其配对的正常胃黏膜组织(1.7250±0.4080, P<0.05),胃癌组织Runx3蛋白表达亦明显低于其配对的正常胃黏膜组织(P<0.05).在Runx3 mRNA表达下调的56例胃癌组织中,有28例(50.0%)呈启动子高甲基化状态.胃癌组织中,Runx3甲基化阳性者的Dnmt1 mRNA表达量明显高于Runx3甲基化阴性者(P<0.05),Runx3基因启动子甲基化与Dnmt1转录表达呈正相关(r＝0.64,P<0.05).结论 Runx3基因启动子高甲基化是其基因表达下调的原因之一,可能参与胃癌的发生发展;Dnmt1高表达可能影响Runx3启动子区域甲基化改变.
关键词： 胃肿瘤 DNA甲基化 RUNX3 DNMT1 甲基化特异性聚合酶链反应 -
HMGA2与DNMT1在膀胱尿路上皮癌中的表达及临床意义
目的 探讨HMGA2与DNMT1在膀胱尿路上皮癌中的表达变化及临床意义.方法 利用免疫组化方法,以膀胱尿路上皮患者的癌组织及正常人的膀胱组织为研究对象,比较两组患者膀胱组织HMGA2与DNMT1的蛋白的表达水平变化.结果 HMGA2与DNMT1在膀胱尿路上皮癌组织中的阳性表达率分别为65.00％和60.00％,与相对应的对照的正常膀胱组织相比较,HMGA2与DNMT1的表达增高显著,具有显著的统计学差异(P＜0.05).结论 HMGA2与DNMT1基因在膀胱尿路上皮癌的组织当中的过量表达,通过检测和干扰HM-GA2与DNMT1基因可能为膀胱尿路上皮的早期诊断和制定治疗方案提供新依据.
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Dnmt1通过Cdkn1a甲基化调控脂肪分化的过程
表观遗传调控机制在脂肪细胞分化中发挥了重要的作用.为了研究DNA甲基转移酶Dnmt1在脂肪细胞分化中的作用,我们利用3T3-L1前脂肪细胞体外诱导分化模型,首先分析了该基因在脂肪细胞分化中的表达变化,发现Dnmt1的表达水平在分化起始阶段显著升高.如果在该过程中敲低Dnmt1的表达,则会显著影响细胞分化进程,抑制细胞脂质的生成.利用甲基化基因芯片分析,我们发现在分化起始阶段,Cdkn1a基因的启动子甲基化水平显著升高,并伴随基因表达水平的降低;而敲低Dnmt1的表达则能抑制Cdkn1a启动子的甲基化,提高基因的表达.这些研究结果表明,Dnmt1通过调控Cdkn1a启动子的甲基化,影响该基因的表达.进一步的研究发现,Dnmt1通过Cdkn1a启动子的甲基化调节脂肪细胞分化,表明Cdkn1a有可能在脂肪细胞分化、以及预防脂肪细胞增生中发挥关键的作用.
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DNA甲基转移酶DNMT1与EZH2在急性髓系白血病中的表达及相关性研究
目的 探讨DNA甲基转移酶DNMT1与EZH2在急性髓系白血病(AML)中的表达及其相关性.方法 采用荧光定量PCR技术检测50例AML患者骨髓细胞中DNMT1与EZH2 mRNA的表达水平,分析DNMT1表达水平与临床特征和预后的关系以及与EZH2的相关性.结果 50例AML患者骨髓细胞中DNMT1 mRNA的表达显著高于30例正常供者的(2.72 ±0.73vs 0.89 ±0.27,P＜0.01);EZH2的表达水平也显著高于正常供者的(4.39±1.06,1.87±0.33,P＜0.01);EZH2与DNMT1的表达水平呈显著正相关(r=0.51,P=0.002);DNMT1表达水平与外周血幼稚细胞比例≥60％(P＜0.05)、WBC≥50×109/L(P＜0.05)显著相关;DNMT1高表达组患者中位生存时间15个月(95％ CI:9 ～ 19个月),显著低于DNMT1低表达组患者的32个月(95％CI:27 ～40个月)(P=0.006).结论 DNMT1和EZH2在AML患者中均高表达,两者表达水平呈正相关,DNMT1与AML患者预后不良相关.
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miR-148a在5-aza诱导间充质干细胞心肌样分化中的调控作用及机制
目的:探讨miR-148a在5-aza诱导人骨髓间充质(hMSCs)成心肌样分化中的表达及miR-148a对hMSCs体外成心肌样分化的生物学作用.方法:免疫荧光检测5-aza诱导hMSCs分化后心肌细胞特异性标志物α-MHC表达水平;qRT-PCR和Western blot分别检测miR-148a和DNMT1在hMSCs成肌样分化中的表达水平.利用Lipofecttamine TM 2000将miR-148a mimics和miR-148a inhibitor分别瞬时转染hMSCs,Western blot检测心肌细胞特异性标志物α-MHC的蛋白表达水平.利用生物信息学技术预测miR-148a的靶基因结合位点利用双荧光素酶报告基因系统鉴定其对靶基因3'UTR的结合序列.通过DNMT1 shRNA和miR-148a inhibitors共转到hMSCs中,研究miR-148a在hMSCs成心肌样分化中的调控作用.结果:hMSCs经5-aza诱导分化后,心肌细胞特性标志物α-MHC蛋白水平明显上调.miR-148a在hBMSCs成肌样分化中显著性增加(P＜0.01),DNMT1表达水平显著降低.过表达miR-148a能提高hBMSC中心肌细胞特异性标志物α-MHC表达水平,而抑制miR-148a则能降低其水平(P＜0.01).DNMT1沉默可以阻断miR-148a对hMSCs的诱导成肌样分化作用.结论:miR-148a在hMCCs成肌样分化中表达上调,通过靶定和调控DNMT1基因的表达,并对hMSCs心肌向分化具有正向调控作用.
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EZH2在急性髓系白血病病程中的表达和对预后判断的意义研究
目的：探讨DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT1）与EZH2在急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）中的表达及其相关性。方法：采用荧光定量PCR（fluorescence quantitative PCR，FQ-PCR）检测大连医科大学附属第二医院2014年1月至2015年1月50例初治AML患者骨髓细胞中DNMT1与EZH2 mRNA的表达水平，分析DNMT1表达水平与临床特征和预后的关系以及与EZH2的相关性。结果：50例AML患者骨髓细胞中DNMT1 mRNA的表达显著高于30例正常供者（2.72±0.73 vs.0.89±0.27，P<0.01）；EZH2的表达水平也显著高于正常供者（4.39±1.06 vs.1.87±0.33，P<0.01）；EZH2与DNMT1的表达水平呈显著正相关（r=0.51，P=0.002）；DNMT1表达水平与外周血幼稚细胞比例≥60%（P<0.05）、WBC≥50×109/L（P<0.05）呈显著相关；DNMT1高表达组患者中位生存时间15个月（95%CI为9～19个月），显著低于DNMT1低表达组患者的32个月（95%CI为27～40个月，P=0.006）。结论：DNMT1和EZH2在AML患者中均高表达，两者表达水平呈正相关，DNMT1与AML患者预后不良相关。
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重组杆状病毒介导的DNMT1 siRNA对人胰腺癌细胞增殖影响的研究
目的:研究利用重组杆状病毒介导的DNMT1 siRNA对人胰腺癌细胞增殖的影响.方法:培养人胰腺癌细胞并分组如下:空白对照组、阴性对照组、病毒r-Bac-si-DNMT1-D1组(D1组)、r-Bac-si-DNMT1-D2组(D2组)、r-Bac-si-DNMT1-D3组(D3组).空白对照组仅加10%胎牛血清和DMEM培养基培养,阴性对照组、D1组、D2组、D3组加血清和DMEM培养基培养24h后依次加入空白载体r-Bac-CMV-EGFP和r-Bac-si-DNMT1-D1病毒、r-Bac-si-DNMT1-D2病毒、r-Bac-si-DNMT1-D3病毒150μl/孔,72h后分别收集各组细胞用MTT法测肿瘤细胞增殖的变化.结果:重组杆状病毒介导的DNMT1 siRNA感染的细胞存活率较空白对照组和阴性对照组明显降低(P<0.05).结论:杆状病毒介导的DNMT1 siRNA感染人胰腺癌细胞后能通过降低细胞存活率,从而影响胰腺癌细胞的增殖.
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PM2.5诱导BEAS2B细胞Dnmt1下调激活Foxp3表达分子机制
目的 探讨PM2.5激活人正常支气管上皮细胞(BEAS2B) Foxp3表达的分子机制.方法 实验设对照组(磷酸盐缓冲液)、PM2.5组(300 μtg/mL)、5-AzaC组(DNA甲基化转移酶抑制剂,5.0 μrnol/L)、TSA组(组蛋白去乙酰化酶抑制剂,0.2 μrnol/L)、PM2.5对照组;实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测BEAS2B细胞中Foxp3、HOXA1和HOXA2基因表达,蛋白印迹法(Western blot)检测Dnmts相关蛋白表达,甲基化特异性聚合酶链反应(MSP-PCR)检测DNA甲基化水平.结果 与对照组比较,PM2.5处理的BEAS2B细胞Foxp3表达量上升1.15倍,差异有统计学意义(P＜ 0.05);Dnmt1和Dnmt3b表达量分别下降0.51和0.38倍,Dnmt3a上升1.51倍,差异均有统计学意义(P＜ 0.05);5-AzaC或TSA处理后,Foxp3表达量分别上升1.61和1.20倍,差异均有统计学意义(P＜0.05),并伴随Foxp3启动子区DNA低甲基化及Dnmt1蛋白表达降低,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 PM2.5可能通过抑制Dnmt1表达激活Foxp3表达.
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DNMT1与UHRF1基因在胃癌细胞系中的表达特点及其与癌细胞DNA甲基化的关系
[目的]探讨DNMT1和UHRF1在胃癌的形成和转化中的表达特点和可能的生物学作用.[方法]提取CIMP型H(High)的胃癌细胞系HGC-27和CIMP型为L(low)的胃癌细胞系MGC803,BGC823及AGS的核酸样品进行UHRF1和DNMT1表达的分析.[结果]DNMT1在MGC823和HGC-27表达水平明显高于其他胃癌细胞系(P<0.01);UHRF1在HGC-27中有表达水平高于其他3个胃癌细胞系(P<0.01).[结论]胃癌细胞DNA的甲基化不但和DNMT1有关而且和UHRF1也有着密切关系.
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miR-148a通过DNMT1调控MSCs向心肌分化的内在作用机制研究
目的:验证DNA甲基转移酶1(DNMT1)是miR-148a直接调控的靶基因,探究miR-148a通过靶向DNMT1调控骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌分化的作用机制.方法:MSCs细胞经5′-氮胞苷(5′-aza)诱导向心肌分化后,使用miRNA芯片筛选出诱导前后表达差异的miRNAs.Targetscan软件分析异常表达的miR-148a的靶基因,将野生型或突变型DNMT1的3′-UTR区域克隆到荧光素酶报告基因的下游(DNMT1-wt或DNMT1-mut)并分别与miR-148a mimics(miR-148a模拟物)或scramble(miR-148a阴性对照)共转染,荧光素酶报告基因实验验证所预测的靶基因DNMT1,qRT-PCR和Western blot分别检测转染miR-638 mimics和scramble后,对DNMT1的mRNA和蛋白表达的影响.构建miR-148a慢病毒质粒,分别在转染到MSCs后的第1、7、14和28天后检测miR-148a对GATA结合因子4(Gata-4)基因上游DNA调控序列CpG甲基化水平的影响、qRT-PCR和Western blot分别检测转染miR-148a慢病毒质粒后对心肌特异蛋白:球蛋白重链(MHC)和心脏肌钙蛋白T(cTnT)、MSCs分化特征蛋白CD90和CD29表达的影响,以及对心肌特异转录因子心脏特异性同源盒基因(Nkx2.5)和Gata-4表达的影响.结果:miRNA芯片筛选5′-aza诱导MSCs向心肌分化后表达异常的miRNAs,包括miR-146a-5p、miR-148a、miR-539等,其中miR-148a表达明显上调.Targetscan、荧光素酶报告基因实验和qRT-PCR验证DNMT1是miR-148a直接调控的靶基因.miR-148a慢病毒感染MSCs细胞,证实在转染的不同时间,Gata-4上游基因甲基化水平发生改变,且随着转染时间延长,Gata-4甲基化水平呈不断降低趋势,MSCs细胞内MHC和cTnT表达提高,CD90和CD29表达降低,Nkx2.5和Gata-4表达提高,MSCs细胞出现向心肌分化.结论:miR-148a可通过靶向调控DNMT1而调控MSCs细胞的向心肌分化.
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浅谈甲基化抑制剂5-Aza-CdR对肺癌A549细胞株DNA甲基转移酶1及c-myc、MKi-67、p53基因表达的影响
目的 探究甲基化抑制剂5-氮杂-2'脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对肺癌A549细胞株DNA甲基转移酶1(DNMT1)及c-myc、MKi-67、p53基因表达的影响.方法 选取合适的肺癌A549细胞株作为研究对象,随机将这些细胞分为观察组和对照组,采用不同的方法进行处理,其中观察组采用5-Aza-CdR进行处理,在对照组的细胞株中不加任何的药物处理,经过3d的药物处理之后,主要采用FQ-PCR的检测技术研究5-Aza-CdR对肺癌A549细胞株DNMT1及c-myc、MKi-67、p53基因表达的影响.结果 研究发现观察组的DNMT1及c-myc、MKi-67mRNA与对照组相比,表达量明显的低于对照组,但p53 mRNA的表达量比对照组高,P<0.05有统计学意义.结论 采用甲基化抑制剂5-Aza-CdR明显的降低了肺癌A549细胞中的DNMT1及c-myc、MKi-67、p53基因表达量,使得p53基因表达量升高,主要的原因可能与基因启动子区域的去甲基化相关,为去甲基化的治疗提供了有利的线索及依据.
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姜黄素对人胰腺癌PANC-1细胞甲基化转移酶表达影响的体外研究
目的 探讨姜黄素对人胰腺癌PANC-1细胞甲基化转移酶(DNMTs)基因表达的影响及其作用机制.方法 将体外培养的PANC-1细胞分为对照组、吉西他滨组、姜黄素组和联合组.各组分别干预48 h后,采用CCK8法检测人胰腺癌PANC-1细胞的增殖情况,采用RT-PCR法检测DNMTs mRNA表达情况,采用Western blotting法检测DNMT1和Caspase-3蛋白表达水平.结果 ①联合组PANC-l细胞增殖抑制率高于姜黄素组和吉西他滨组(P＜0.05).②吉西他滨组、姜黄素组和联合组DNMT1及DNMT3mRNA表达均较对照组降低(P＜0.05);联合组低于吉西他滨组和姜黄素组(P＜0.05).③吉西他滨组、姜黄素组和联合组DNMT1蛋白表达均较对照组明显下调(P＜0.05,P＜0.01),Caspase-3蛋白表达均较对照组明显上调(P＜0.01);联合组与吉西他滨组和姜黄素组比较有显著差异(P＜0.05).结论 姜黄素可协同吉西他滨促进胰腺癌细胞的凋亡,其机制与调控胰腺癌PANC-1细胞癌基因的去甲基化作用有关.
