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Tet调控的乳腺癌耐受蛋白表达细胞系的建立及功能研究
背景与目的:乳腺癌耐受蛋白(breast cancer resistance protein,BCRP)是1998年发现的新的ATP结合盒式(ATP binding cassette,ABC)跨膜转运蛋白超家族成员.本研究拟建立Tet调控的具有功能的BCRP表达细胞系,为研究BCRP介导的药物耐受机制和探寻耐受逆转方法提供理想的实验平台.方法:利用Tet-on基因表达调控系统,先后将调控质粒pTet-on和反应质粒pTRE-BCRP转染人PA317细胞,并用G418和潮霉素分别进行二轮筛选,挑取6个单细胞克隆并扩增培养;不同浓度的强力霉素(doxycycline,Dox)诱导后,用RT-PCR和Western blot检测并选取BCRP表达量与Dox剂量具有较好量-效关系的PA317/Tet-on/TREBCRP细胞克隆;采用MTT方法检测米托蒽醌(mitoxantrone)对不同浓度Dox诱导下的PA317/Tet-on/TRE-BCRP克隆细胞的杀伤作用;采用BCRP特异性抑制剂Ko143的干扰试验来检测PA317/Tet-on/TRE-BCRP细胞对米托蒽醌的药物敏感性;米托蒽醌处理不同BCRP表达量的细胞后,利用流式细胞仪检测细胞内存留米托蒽醌所释放出来的荧光强度.结果:发现5号PA317/Tet-on/TRE-BCRP克隆细胞BCRP表达量与Dox诱导剂量具有较好的量-效关系;其药物耐受性与BCRP表达量呈正相关(r=0.995,P=0.002);Ko143能显著增强PA317/Tet-on/TRE-BCRP细胞对米托蒽醌的药物敏感性(P＜0.05);流式细胞术进一步证实在A317/Tet-on/TRE-BCRP细胞内不同浓度Dox诱导的BCRP不同表达能引起细胞内米托蒽醌存留量的变化.结论:成功地建立了Tet调控的具有功能的乳腺癌耐受蛋白(BCRP)表达细胞系,为进一步研究BCRP提供了理想的实验平台.
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RU486调控的红色荧光蛋白真核载体的构建及表达
目的 构建一种带有DsRed红色荧光蛋白报告基因并可经RU486诱导的真核表达载体,并在体外验证其调控表达作用.方法 利用分子生物学技术,将DsRed基因和启动子,以及RU486系统构建成真核可凋控载体pRSl7.RUDsRed.在转染MFC细胞后,运用荧光显微镜和流式细胞技术检测该载体的调控表达.结果 PCR和限制性酶切及测序均证实了载体的正确性.没有RU486时,几乎没有红色荧光蛋白的表达,加入诱导剂RU486后,可以实现红色荧光蛋白的高效表达.结论 成功构建了带有红色荧光蛋白报告基因并可经RU486诱导的真核表达载体,实现了对目的 基凶表达的有效调控,为进一步的基因调控研究和和基因治疗奠定了基础.
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微囊藻毒素和脂多糖对鲢鱼和草鱼肝脏去毒相关基因活体诱导表达的影响
采用50μg·(kg体质量)-1的微囊藻毒素·LR(MC-LR)、2 mg·(kg体质量)-1的脂多糖(LPS)和50μg·(kg体质量)-1 MC-LR+2 mg·(kg体质量)-1 LPS分别活体腹腔注射鲢鱼、草鱼,采用实时荧光定量PCR方法测定MC-LR和LPS对鲢鱼、草鱼肝脏alpha-谷胱甘肽S-转移酶(GSTA)、rho-谷胱甘肽S-转移酶(GSTR)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和解偶联蛋白2(UCP2)等去毒相关基因活体诱导表达的影响.结果表明,鲢鱼、草鱼GSTA和GSTR的不同诱导变化除与两种淡水鱼类对毒素的耐受性相关外,还与毒索剂量、诱导时间等因素相关.LPS对GSTA和GSTR基因组成型、诱导型的不同作用,可能与调制因子LPS对不同生态习性淡水鱼类肝脏GST基因表达水平的调制作用不同有关.UCP2与GPX也分别在抑制过量ROS发生方面与肝脏抗氧化胁迫等方面起重要作用.
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tTS/rtTA系统下调目的基因基础表达的细胞模型研究
[目的]构建带有肝脏特异性启动子和tTS沉默子的四环素调控系统,观察其在人HepG2细胞内的表达,建立严密型四环素调控系统的HepG2细胞模型.[方法]通过二次分子克隆构建重组真核表达质粒载体pliv7-rtTA-tTS-Neo,用脂质体法将质粒pliv7-rtTA-tTS-Neo及pliv7-rtTA-Neo转染人HepG2细胞,经G418筛选后的克隆用有限稀释法进行单克隆化,克隆扩增后瞬时转染pTRE-Luc质粒,强力霉素(1 mg/L)诱导表达后检测荧光素酶活性,挑选出低背景和高诱导表达的HepG2细胞克隆.[结果]带有tTS的细胞株其诱导倍数明显高于不带有tTS的细胞株(192:21),其中克隆9的诱导倍数高(256),获得1株高表达、低背景的HepG2/pLiv7-rtTA-tTS-Neo细胞株.[结论]荧光素酶活性检测结果验证了tTS对四环素调控系统的内在泄露问题有一定的抑制作用,使四环素调控系统的开关具有真正意义上的严密性.
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诱导热休克蛋白70对感染后肠易激综合征小鼠的影响
目的 探讨诱导热休克蛋白70(HSP70)对感染后肠易激综合征(P[-IBS)小鼠的影响.方法 将84只雌性C57BL/6小鼠随机分为对照组、PI-IBS组、诱导+PI-IBS组、诱导组,每组21只.PI-IBS组给予旋毛虫感染;诱导+ PI-IBS组先给予热预处理,再给予旋毛虫感染;诱导组只给予热预处理,正常对照组不给予处理.Western blot检测肠道HSP70蛋白表达量,观察肠组织病理学表现,对肠组织行炎症评分,观察腹壁撤退反射(AWR)以评估内脏敏感性,观察肠道传输时间及粪便Bristol评分以评估肠道动力,ELISA检测肠道炎症细胞因子浓度.结果PI-IBS组、诱导组HSP70表达量较正常对照组明显升高(P＜0.01),诱导+PI-IB组较PI-IBS组亦明显丹高(P＜0.01).PI-IBS组肠道炎症评分明显高于正常对照组(P＜0.01),而诱导+PI-IBS组明显低于PI-IBS组(P＜0.01),诱导组与正常对照组差异无统计学意义(P＞0.05).PI-IBS组AWR评分明显高于正常对照组(P＜0.01),诱导+ PI-IBS组明显低于PI-IBS组(P＜0.01),诱导组与正常对照组差异无统计学意义(P＞0.05).PI-IBS组肠道传输时间比正常对照组明显缩短(P＜0.01),而诱导+P[-IBS组明显长于PI-IBS组(P＜0.01),诱导组与正常对照组差异无统计学意义(P＞0.05);PI-IBS组Bristol评分比正常对照组明显升高(P＜0.01),而诱导+ PI-IBS组明显低于PI-IBS组(P＜0.01),诱导组与正常对照组差异无统计学意义(P＞0.05).与正常对照组比较,PI-IBS组IL-10浓度明显降低(P＜0.01),而IL-17、IFN-γ、TNF-α浓度均明显升高(P＜0.01);与PI-IBS组比较,诱导+PI-IB组IL-10浓度明显升高(P＜0.01),而IL-17、IFN-γ、TNF-α浓度均明显降低(P＜0.01);诱导组与正常对照组IL-10、IL-17、IFN-γ、TNF-α浓度差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 诱导肠道HSP70可通过调节肠道炎症细胞因子平衡来改善PI-IBS时的炎症状态.
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人pcsk9基因原核表达载体的构建及诱导表达
目的 构建人前蛋白转化酶枯草溶菌素9(pcsk9)的原核表达载体,优化pcsk9诱导表达条件.方法 聚合酶链式反应扩增人工合成的pcsk9 cDNA序列.扩增产物经双酶切、连接,构建pET-28b-pcsk9表达载体;将重组质粒转化入大肠杆菌表达菌BL21(DE3)的感受态细胞中,分别在不同条件下对其进行诱导,获得pET-28b-pcsk9的佳诱导表达条件.结果 成功构建了pET-28b-pcsk9重组表达载体,其佳表达条件为菌液光密度值取0.6,诱导温度取30℃,诱导剂终浓度取1.0 mmol/L,诱导时间取8 h.结论 该重组表达载体构建成功,在大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中可有效地表达,对诱导所用的温度和时间相对比较敏感.
关键词： 人前蛋白转化酶枯草溶菌素9 表达载体 诱导表达 优化条件 -
结直肠癌中肿瘤干细胞和肿瘤血管新生的研究进展
结直肠癌是胃肠道中常见的恶性肿瘤，目前临床治疗方案是以手术切除为主，但效果不甚理想。其癌变为人正常细胞经过一系列细胞及表观遗传改变，逐步转变为恶性增殖细胞的多阶段进程［1］。新研究发现，结直肠癌具有2个显著的病理特点：肿瘤干细胞的无限增殖及血管新生，而两者的形成都与肿瘤微环境有关［2］。肿瘤微环境由血管周围的肿瘤相关成纤维细胞（ cancer associated fibroblasts ， CAF ）、巨噬细胞、淋巴细胞、周细胞、炎症细胞、正常上皮细胞及间质干细胞（ mesenchymal stem cell ， MSCs ）等形成， CATALANO等［3］研究发现，肿瘤微环境的刺激可导致癌症细胞中干细胞样细胞的诱导表达；QUANTE等［4］认为肿瘤微环境对血管的生成起到了至关重要的促进作用。因此，了解肿瘤微环境中的肿瘤干细胞及血管新生，是研究结直肠癌的发生过程和开展针对性治疗的基础。国内关于结直肠癌与肿瘤微环境、肿瘤干细胞、肿瘤微环境的综述文章，都是针对三者中的一种来阐述，目前，还没有系统的把结直肠癌与三者之间的关系表述出来的文章。本综述总结了目前关于肿瘤干细胞和肿瘤血管新生在结直肠癌中的相关研究进展，为未来制订个性化治疗方法，提高患者存活率，改善生存环境及降低化疗药物带来的不良反应提供参考。
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艰难梭菌毒素B受体结合区CDB3融合蛋白诱导表达条件优化及其纯化
目的：优化艰难梭菌毒素B受体结合区CDB3融合蛋白诱导表达条件，在获得高表达融合蛋白后对其进行纯化，为艰难梭菌毒素B受体结合区CDB3单克隆抗体的制备奠定基础。方法以诱导前菌液600 nm处的光密度值（OD600）、诱导温度、诱导剂异丙基-β-D巯基半乳糖苷（IPTG）浓度和诱导时间为单变量，分别诱导融合蛋白的表达，在此基础上采用正交试验对融合蛋白的诱导表达条件进行优化，通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳半定量分析融合蛋白的表达量及表达形式，以Western blot对融合蛋白进行鉴定，以GST 亲和层析柱对融合蛋白进行纯化。结果融合蛋白诱导表达的佳条件为诱导前菌液OD6000．8、IPTG浓度0．6 mmol/L、诱导时间12 h、诱导温度30℃，融合蛋白以可溶性蛋白表达形式为主，经纯化后，融合蛋白纯度超过90％。结论本研究成功优化了艰难梭菌毒素B受体结合区CDB3融合蛋白的诱导表达条件，获得大量表达，并成功对其进行了纯化，为后续单克隆抗体的制备奠定了基础。
关键词： 艰难梭菌 毒素B 异丙基-β-D巯基半乳糖苷 诱导表达 -
重组人肝再生增强因子的纯化及生物学活性研究
对经大肠杆菌表达的重组人肝再生增强因子进行纯化并观察其对肝损伤小鼠模型的促修复作用。1. 方法：pBV-hALR/JM109工程菌由本室构建，30℃培养至A600＝0.6，42℃诱导表达5h，收集不同诱导时间菌体鉴定rhALR的表达水平。包涵体的洗涤变性，复性后经CM-Sepharose FF离子交换柱层析，收集洗脱峰，行SDS-PAGE，结果经UVP labwork扫描处理软件分析测定rhALR纯度，N端氨基酸分析采用手工Edman降解法。
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人S100A2-GST融合蛋白原核表达和纯化
目的:制备人S100A2-GST融合蛋白(Human S100A2-GST fusion protein,hS100A2-GST),为进一步研究人hS100A2蛋白的功能及其与其它因子或系统的相互作用奠定基础.方法:从pHAHA-hS100A2中双酶切获取hS100A2基因,亚克隆至原核表达载体pGST-moluc,构建pGST-moluc-hS100A2,转化BL21后酶切鉴定,IPTG诱导重组菌表达融合蛋白hS100A2-GST,再经过Glutathion-Sepharose 4B球珠分离纯化、SDS-PAGE及Western Blot鉴定,Bradford法蛋白定量.结果:Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切该重组质粒后获得2个片段,分别约300 bp和5 kb,提示pGST-moluc-hS100A2构建正确;重组菌株经过IPTG诱导后,表达分子量约为36 kD的蛋白,产率达5 mg/L菌液;Glutathion-Scpharose 4B球珠纯化后,该融和蛋白纯度达92%;Western Blot显示该蛋白可以被S100A2的抗体特异识别,证实其为hS100A2-GST融合蛋白.结论:成功构建了hS100A2-GST原核表达质粒pGST-moluc-hS100A2;该质粒可在大肠杆菌中诱导表达hS100A2-GST融合蛋白,产率高;应用Glutathion-Sepharose 4B球珠可获得纯度达92%的该蛋白.为后续有关hS100A2的研究打下了基础.
关键词： 人S100A2-GST融合蛋白 诱导表达 蛋白纯化 蛋白鉴定 -
重组人C反应蛋白在甲醇酵母中的分泌表达及鉴定
目的：构建重组人C反应蛋白（rhCRP）甲醇酵母分泌表达菌株，表达、纯化rhCRP并鉴定其免疫反应性。方法将人工设计合成的rhCRP基因克隆到甲醇酵母表达载体pPICZαA上，经SacⅠ线性化得到重组质粒pPICZαA/rhCRP后转化至甲醇酵母X-33中，利用甲醇诱导进行分泌表达，并用组氨酸标签进行亲和层析纯化 rhCRP。采用SDS-PAGE、Western blotting检测表达、纯化的目的蛋白，通过间接酶联免疫吸附试验（ELISA）鉴定其免疫反应性和稳定性。结果成功构建人CRP的重组甲醇酵母表达载体pPICZαA/rhCRP ，重组酵母菌株成功诱导分泌表达23×103的 rhCRP ；一步纯化即得纯度为90．42％的目的蛋白，间接ELISA法检测表明，纯化产物rhCRP具有特异的免疫反应性和一定的稳定性。结论利用甲醇酵母表达系统，成功获得了较高纯度的具有免疫反应性的rhCRP ，为下一步制备抗人CRP抗体及自主研发人CRP检测试剂提供重要的实验基础。
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LPS、rh-TNFα刺激PBL诱导TRAIL表达的初步研究
选择人PBL作为人TRAIL基因的来源,抽提细胞在LPS 和rh-TNF α刺激2、10、18h的总RNA,通过RT-PCR观察TRAIL基因转录mRNA的水平,然后用PCR扩增TRAIL基因,并用免疫印迹法分析TRAIL mRNA翻译蛋白的水平.结果发现:在LPS和rh-TNFα刺激细胞并进一步诱导细胞凋亡可能与诱导表达TRAIL有关.本实验得到了TRAIL基因,为重组表达TRAIL打下了基础.
关键词： 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 LPS rh-TNFα 诱导表达 -
微环DNA诱导表达方法的优化和体内表达
目的 通过对微环DNA的表达步骤进行优化来提高微环DNA的诱导表达量以及降低诱导表达后的母环污染,并利用微环DNA构建一个能进行体内活体成像的表达系统.方法 通过改变诱导培养基中加入L-阿拉伯糖的次数以及改变培养时间来提高DNA表达量、降低母环污染.通过Furin和2A将靶基因和萤火虫素酶基因(luciferase)连接到微环DNA中,再利用高压水流动力学注射的方法使目的基因在小鼠体内表达,通过活体成像检测萤火虫素酶的表达信号来监控和检测目的基因的表达.结果 成功提高了微环DNA的表达量,降低了质粒的母环污染,建立可通过活体成像系统鉴定靶基因表达的系统.结论 通过对微环DNA表达过程的优化大大提高了DNA的表达量,并且可以通过构建的微环DNA系统来监测靶基因在体内的表达情况.
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HIV-1整合酶酶联免疫吸附试验的建立和应用
目的:建立一种检测人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)整合酶的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,用于筛选HIV-1整合酶抑制剂.方法:将质粒F185K/C280SIN1-288转化到大肠杆菌中,经IPTG诱导表达,柱亲和层析纯化,获得HIV-1整合酶融合蛋白,建立酶联免疫吸附试验(ELISA)方法.与3H同位素标记方法比较,检测其生物学活性,并用ELISA方法测定了已知HIV-1整合酶抑制剂,验证方法的可靠性.结果:SDS-PAGE电泳分析显示相对分子量31000上方有HIV-1整合酶融合蛋白条带出现.
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重组肌氨酸氧化酶的制备和鉴定
测定血清中肌酐的浓度是临床上诊断肾功能的一项重要指标.在利用偶联酶法测定的过程中,一种关键酶——肌氨酸氧化酶(SOX)(EC 1.5.3.1)的质量控制是我们首先要解决的一个重要问题.本文利用乳糖诱导重组肌氨酸氧化酶(r-SOX)基因在E.coli中高效表达,经300 L发酵罐发酵培养,菌体终密度达到OD600值22,菌体湿重达30 g/L,湿菌体含活性20 U/g.重组肌氨酸氧化酶表达量占菌体可溶性蛋白的25％左右.菌体破碎液经55℃选择性热变性处理和Ni-Sepharose FF层析二步纯化,经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析酶的纯度达97％以上,比活力达25 U/mg,纯化倍数为14.4,活性收率为92.4％.纯化的酶经SDS-PAGE和分子筛层析法测定,其分子量分别为53 kD和55 kD,提示该酶结构为单一肽链.纯化的酶液和冻干粉均呈黄色,经三氯乙酸和热变性处理,发现其与核黄素以共价键的方式结合.此外,对该酶的稳定性和其中的干扰酶过氧化氢酶也做了进一步的考察.以上所取得的研究结果为此酶的开发和利用奠定了基础.
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高纯度诊断用重组甘油激酶的制备和鉴定
用乳糖诱导重组甘油激酶(r-GK)在E.coli中高效表达,经300 L发酵罐发酵培养,建立了高效、低成本的r-GK发酵生产工艺.发酵菌体终密度OD600值达到42,r-GK表达量占菌体可溶性蛋白的30％左右.菌体破碎液经选择性热变性处理,Ni Sepharose FF层析二步纯化,产物纯度大于97％.经梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳(Gradient PAGE)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,r-GK分子量为120 kDa,由分子量相同的2个亚基组成.甘油激酶中2种NADH氧化酶和过氧化氢酶干扰酶未被检出.保存稳定性实验表明纯化后酶液在4℃条件下保存30d可保留约85％的活性,而冻干粉剂在4℃条件下保存1年活性仍可保留93％以上.
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激活蛋白2α在人肺腺癌细胞环氧合酶2表达中的作用
前列腺素(PGs)是一类脂性介质,参与多种生理和病理生理过程.环氧合酶(COX)是花生四烯酸(AA)合成前列腺素的限速酶,有两种同工酶:COX-1和COX-2.COX-1主要为基础表达,与正常生理过程的维持有关;COX-2主要为诱导表达,在炎症因子如白细胞介素-1β(IL-1β)、生长因子及细菌脂多糖(LPS)等刺激下表达增加,与炎症、肿瘤的发生发展有关[1].
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PEP-1-VP3融合蛋白的分离纯化与初步鉴定
目的 构建融合蛋白PEP-1-VP3的原核表达质粒,并进行诱导表达和蛋白纯化.方法 通过PCR方法自PGEX-6P-1/TAT-VP3质粒中扩增VP3基因,运用靶向克隆酶,将VP3基因插入到线性载体pET15b-PEP-1中,构建重组表达质粒pET15b-PEP-1-VP3,经测序证实构建成功后转化E.coli Rosetta,表达PEP-1-VP3融合蛋白,经Ni-NTA树脂亲和层析,进行SDS-PAGE及Western Blot分析鉴定.结果 成功构建PEP-1-VP3融合蛋白原核表达载体,表达并纯化了17.6kD的PEP-1-VP3融合蛋白.结论 所构建的PEP-1-VP3融合蛋白为体内抗肿瘤研究提供了理论基础.
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卡介苗对人肺腺上皮细胞表达Fall-39 mRNA及抗菌活性的影响
目的探讨卡介苗能否增强Fall-39在人肺腺上皮SPC-A-1细胞中的表达,分离鉴定卡介苗刺激作用的有效胞壁蛋白组份,并检测其抗菌活性.方法根据GenBank中人Fall-39的cDNA序列资料,设计特异性引物,应用RT-PCR法检测SPC-A-1 细胞Fall-39 mRNA的表达,采用超声破碎细胞、蔗糖密度梯度离心、Sephadex G-75柱层析等方法分离卡介苗胞壁蛋白质组份;采用琼脂糖弥散杀菌法检测SPC-A-1细胞培养上清的抗菌活性.结果卡介苗刺激SPC-A-1细胞Fall-39 mRNA的表达明显增强,而且这种诱导增强表达在一定范围内具有刺激物剂量和时间依赖性.卡介苗胞壁蛋白层析所得6个组份中,组份4(相对分子质量范围约21～29×103)诱导SPC-A-1细胞Fall-39 mRNA的表达增强约8.5倍,其培养上清的抗菌活性显著增强.结论BCG胞壁蛋白是Fall-39基因的激活因子,可诱导其基因的上调表达.
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莱姆病螺旋体重组质粒pBX1的DNA序列分析及其在大肠杆菌中的诱导表达
目的为莱姆病血清学诊断和基因工程亚单位疫苗研制提供靶抗原。方法采用377型DNA自动测序仪对莱姆病螺旋体重组质粒pBX1的插入片段进行DNA序列测定，并通过计算机软件对其进行限制性内切酶酶谱分析。然后将重组质粒pBX1在大肠杆菌中进行诱导表达，并对其表达产物进行免疫印迹分析。结果①重组质粒pBX1插入片段大小为477bp，其核苷酸序列与文献报道的p83基因全序列相应区段相比较仅有一个碱基的变异，②成功绘制了该插入片段的限制性内切酶酶谱；③重组质粒在大肠杆菌中诱导表达后获得了29kd的融合蛋白；④Western-blotting分析表明该融合蛋白能与莱姆病多价抗血清呈强阳性印迹反应。结论该研究成功地对莱姆病螺旋体83kd抗原蛋白特异性区段进行了基因重组和表达，为进一步研究其在莱姆病血清学诊断和基因工程亚单位疫苗研制中的应用奠定了基础。
