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N-乙酰半胱氨酸对氟诱导睾丸支持细胞内质网应激的作用
目的 探讨N-乙酰半胱氨酸对氟化钠(NaF)介导睾丸支持细胞内质网应激的抑制作用.方法 将原代培养大鼠睾丸支持细胞进行分组:0 μg/ml NaF(对照组)、6 μg/ml NaF组、12μg/ml NaF组、24μg/ml NaF组、N-乙酰半胱氨酸(2 mmol/LNAC)组、6μg/ml NaF+2 mmol/L NAC组、12μg/ml NaF+2 mmoL/L NAC组和24 μg/ml NaF+2 mmol/L NAC组,各组以相应药物孵育24 h.四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定各组细胞生长活性;荧光探针法分析各组细胞内活性氧(ROS)水平;免疫印迹法(Western blot)检测内质网应激相关蛋白GRP78、PERK和CHOP的表达.结果 2 mmol/L NAC有效提高了细胞存活率(P＜0.01);NAC明显抑制了NaF介导的细胞内ROS水平的升高,与NaF组相比,各NAC组的ROS水平均显著降低(P＜0.01);NaF诱导内质网应激相关蛋白GRP78、PERK和CHOP表达明显上调,经2mmol/L NAC处理后,其有效拮抗了GRP78、PERK和CHOP蛋白表达的上调(P＜0.01).结论 ROS激活了内质网应激相关信号通路,而NAC通过减少ROS的产生,拮抗了NaF介导的睾丸支持细胞内质网应激.
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氟对原代培养大鼠睾丸支持细胞氧化应激和凋亡的影响
目的 研究氟化钠对大鼠睾丸支持细胞氧化应激和凋亡水平的影响.方法 采用原代细胞培养方法,将大鼠睾丸支持细胞暴露于0、6、12和24 μg/ml的氟化钠中,24 h后检测支持细胞内活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)含量,超氧化物歧化酶(SOD)活性,线粒体膜电位及凋亡率水平.结果 氟可降低睾丸支持细胞活力(P＜0.01);与对照组相比,各氟化钠处理组的ROS水平均显著上升(P＜0.01),12和24 μg/ml氟化钠组的MDA含量显著上升(P＜0.01).同时,各氟化钠处理组的SOD活性均显著低于对照组(P ＜0.05或P＜0.01).随着氟化钠剂量的增高,各氟化钠处理组的线粒体膜电位均显著下降,细胞早期凋亡率均显著升高(P＜0.01).结论 氟可致睾丸支持细胞氧化应激水平及凋亡率升高.
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抗苗勒管激素在女性生殖领域的研究进展
抗苗勒管激素(anti-Müllerian hormone,AMH)为二聚体糖蛋白,是转化生长因子β(TGF-β)超家族成员之一,人类AMH基因位于19号染色体,主要通过其Ⅱ型受体(AMHRⅡ)发挥生物学效应[1].初发现AMH是由睾丸支持细胞产生的,其生理功能是抑制雄性苗勒管的发育,参与睾丸的分化和发育.在雌性个体的早期卵巢中仅存在微量的AMH mRNA,因此胚胎的苗勒管分化为输卵管、子宫和阴道上段[2].
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壬基酚对离体培养大鼠睾丸支持细胞苗勒抑制物mRNA表达的影响
壬基酚(nonylphenol,NP)是具有雌激素样活性的环境内分泌干扰物,广泛暴露于洗涤剂等生活品.苗勒管抑制物(mullerian inhibiting substance,MIS)可由睾丸支持(sertoli)细胞分泌.研究证实MIS可调控雄性生殖管道分化,使雄性生殖系统正常发育[1].而NP经证实可致精子、生殖管道发育畸形等[2],但NP对于MIS表达的影响,尚未见报道.本实验通过研究NP对大鼠sertoli细胞MIS表达的影响,探讨NP致雄性生殖障碍的机制.
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葛根素对钴60-γ射线致小鼠睾丸支持细胞急性损伤的保护作用
目的 探讨中药单体葛根素对钴60(60Co)-γ射线致小鼠睾丸支持细胞急性损伤的保护作用及机制.方法 40只健康雄性Wistar小鼠随机分为正常组,模型组及低、高剂量组,每组10只.模型组及低、高剂量组给予60Co-γ8.0 Gy下腹部均匀照射517 s.造模24h后,低、高剂量组分别给予葛根素230、450mg/(kg·d)灌胃,正常组和模型组给予等量生理盐水灌胃,均每天1次,连续2周.观察小鼠睾丸组织形态学变化；采用酶联免疫吸附法测量血清卵泡刺激素( follicle-stimulating hormone,FSH)、促黄体生成素(luteinizing hormone,LH)及抑制素β(Inhibinβ)水平；应用实时定量PCR法测定睾丸组织中Inhibinβ mRNA相对表达量.结果 模型组小鼠睾丸支持细胞和生精细胞发生不同程度的损伤,低、高剂量组小鼠有不同程度的改善,以高剂量组改善为明显.与正常组比较,模型组血清FSH水平显著提高,血清Inhibinβ水平及睾丸组织Inhibinβ mRNA表达水平显著降低,差异均有统计学意义(P＜0.05).与模型组比较,低、高剂量组小鼠血清FSH、Inhibinβ水平及睾丸组织Inhibinβ mRNA表达显著改善(P＜0.05),以高剂量组改善明显(P ＜0.01,P＜0.05).结论 中药单体葛根索对60Co-γ射线致小鼠睾丸支持细胞急性损伤有一定的保护作用.
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抑制素测定的临床意义
抑制素(inhibin, INH)是一种多肽糖蛋白, 在男性主要由睾丸支持细胞(steroli细胞)分泌, 女性主要由卵巢颗粒细胞分泌.INH在反馈调节垂体前叶合成分泌卵泡刺激素(FSH)方面具有重要作用, 并参与多种生殖内分泌、旁分泌及自分泌的调节.INH有两种活性形式, 分别称为抑制素-A(inhibin A, INH A)和抑制素-B(inhibin B, INH B), 它们都有2个亚基, 一个叫α亚基, 另一个叫β亚基, 通过二硫键连接而成.INH A(αβA)和INH B(αβB)的α亚基完全相同, 但β亚基不同.INH的β亚基可以形成二聚体称为ACT.人INH的α亚基与猪INH的α亚基约85%相同, βA亚基的全部, βB亚基的98%氨基酸残基与猪INH相同[1].
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大鼠睾丸支持细胞对体外共微囊化肝细胞的双重保护作用
目的 观察大鼠睾丸支持细胞(Sertoli cell)对混合共微囊化肝细胞的营养支持和免疫豁免(immune privilege)的双重保护作用.方法 气流法制备含不同比例肝细胞与Sertoli细胞混合的微囊进行体外培养,测定培养上清中白蛋白、尿素的含量,结合形态学判断肝细胞的功能和活性,并选择细胞佳混合比例.CCK-8法测定Sertoli细胞对肝细胞引起的脾细胞增殖的影响.结果 与纯肝细胞微囊组相比,一定比例的Sertoli细胞可促进共微囊化肝细胞的白蛋白和尿素合成(P＜0.01),肝细胞存活时间也相应延长.其中,肝细胞和Sertoli细胞以20:1混合时即可达佳效果.在脾细胞增殖反应中,与对照组相比,微囊化肝细胞仍可引起明显的脾细胞增殖(P＜0.01),而Sertoli细胞可显著抑制这一反应.结论 Sertoli细胞与肝细胞混合共微囊化能明显改善囊内肝细胞的形态、功能与寿命,并使后者得到一定的免疫豁免保护作用.
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小鼠睾丸支持细胞对大脑皮质细胞的体外营养作用
目的 通过观察睾丸支持细胞(SCs)对大脑皮质细胞体外的营养作用,探讨移植的SCs在体内对神经组织营养作用的方式.方法 将原代分离的小鼠大脑皮质细胞单独培养(对照组)或与小鼠SCs共培养(实验组),比较两组中神经元、神经干细胞(NSC)及神经胶质细胞的生长情况.结果 实验组的神经元数及其突起数、神经元特异性烯醇化酶光密度(P＜0.01)和神经胶质细胞数均较对照组高,两组各时期的神经元胞体面积也不相同(P＜0.05),实验组于第3天出现NSC的集落形成.结论 SCs在体外对大脑皮质的神经元、NSC和神经胶质细胞均有较强的营养作用,在中枢神经系统疾病的细胞移植治疗中将具有很大的应用价值.
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睾丸支持细胞促进体外培养神经元生长的研究
目的探讨睾丸支持细胞(SC)对体外培养神经元生长发育的促进作用. 方法将SCs制备成饲养层和SCs条件培养液(SCM)后与神经元共培养,观察培养细胞的存活数和突起数,并应用图像分析仪观察细胞的面积. 结果 SCs饲养层及SCM培养神经元的存活数、突起数和胞体面积明显高于对照组(P<0.01). 结论SCs对体外培养的神经元具有显著的促生长作用.
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睾丸支持细胞的功能及其应用的探讨
睾丸支持细胞(sertoli cell, SC)及其结构是由德国人Enricol Sertoli在1865年首先描述.多年来SC的功能被认为是生精细胞的支架,为生精细胞提供必需的营养物质,能合成与分泌雄激素结合蛋白(androgen binding protein, ABP),为生精细胞提供高浓度的雄激素环境等.近年来SC生物特性的研究揭示了SC还能分泌多种物质,而且众多研究者在SC的应用性方面开始进行探索.
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RNA 的 m6A 甲基化受 microRNAs 调控并促进细胞多能性重编程
m6 A 是普遍存在于 mRNA 的转录后修饰，约50％的核糖核酸甲基化修饰为 m6 A，指腺苷酸上6位 C 上连的氨基中的一个H 被甲基取代。已有研究表明 m6 A 甲基化形成缺陷可以影响昼夜节律、细胞减数分裂和胚胎干细胞增殖从而参与各种病理生理过程，然而 m6 A 形成的调控和参与细胞重编程的机制尚不清楚。作者为了探究这一过程，对四种不同分化潜能的小鼠ESC（胚胎干细胞），iPSC（诱导多能干细胞），NSC（神经干细胞）和 Sertoli cell（睾丸支持细胞）使用 anti-m6 A 抗体免疫沉淀甲基化的 mRNA，再通过 RNA 测序得到全基因组甲基化富集分布图谱。基因注释（gene ontology，为基因参与的生物过程进行注释的数据库）分析表明在四种细胞类型中稳定表达的转录本中，m6 A 富集于介导基本生物过程如细胞周期（cell cycle），RNA加工（RNA processing）的转录本；而介导蛋白的合成和功能的转录本中 m6 A 分布少。对转录本中 m6 A 分布的位置进行分析，发现 m6 A 在编码区和翻译终止区的富集是保守的。通过对细胞特异的 m6 A 甲基化富集分析，发现 m6 A 多分布在四种细胞特异的标记基因，参与细胞特异的生物过程如细胞干性维持和发育调控。
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大鼠睾丸支持细胞对骨髓间充质干细胞免疫抑制作用的影响
目的：探索睾丸支持细胞（Sertoli细胞）对骨髓间充质干细胞（BMSC）免疫抑制作用的影响，为二者在移植免疫中的联合应用提供思路。方法二步酶解法处理大鼠睾丸，分离Sertoli细胞；Percoll法分离大鼠BMSC；Ficoll法分离淋巴细胞；刀豆蛋白A（ConA）刺激进行T细胞转化试验；将Sertoli细胞、BMSC和Sertoli细胞＋BMSC分别加入未经ConA处理的静止淋巴细胞培养体系和经ConA处理后的T细胞转化体系，MTT法测定淋巴细胞增殖情况，观察BMSC、Sertoli细胞或二者共培养对T细胞活化、增殖的影响。结果 BMSC、Sertoli细胞以及二者共培养对静止的淋巴细胞无明显作用。 BMSC、Sertoli细胞及二者共培养对 T细胞的活化、增殖均有明显的抑制作用，且Sertoli细胞与BMSC共培养时抑制作用呈现一定的协同性。结论 BMSC和Sertoli细胞均具有负性免疫调节作用，二者共培养可以进一步增强BMSC的免疫抑制效应。
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睾丸免疫豁免机制的研究进展
精子的产生、分化的过程是在机体的免疫系统成熟之后,却并未引起机体的免疫排斥反应,这种独特的自我免疫耐受现象的出现是对机体免疫系统的一种挑战.初,人们观察到某些染料不能被睾丸生精上皮细胞吸收,随后进行的超微及生化实验证实睾丸支持细胞之间的高度特化的紧密连接能够限制大的亲水分子尤其是蛋白分子通过细胞间隙.依据这些初步的研究结果,人们将睾丸的免疫豁免现象简单地认为是由于存在血睾屏障的缘故,血睾屏障可保护自体生殖细胞及植入睾丸内的移植组织免受免疫排斥反应.然而近来研究发现,睾丸的免疫豁免机制是一个多因素参与的复杂体系.其中物理因素和免疫因素对于建立并维持这种免疫耐受环境尤为重要.
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人脐带间充质干细胞与sertoli细胞共培养下向男性生殖细胞分化的研究
目的 探讨用睾丸支持细胞(SCs)模拟的睾丸微环境,通过共培养技术诱导人脐带间充质干细胞(HUMSCs)向男性生殖细胞分化的可能性,为男性不育治疗寻求一种新的途径.方法 采用差异贴壁法分离、培养、扩增出HUMSCs,从新生昆明小鼠的睾丸中分离培养出SCs,制备SCs饲养层,将HUMSCs加入SCs饲养层中共培养,显微镜观察诱导前及诱导后第7d、14 d细胞的形态学变化;RT-PCR、细胞免疫荧光检测男性生殖细胞相关标记DAZL、VASA及Stella的表达.结果 HUMSCs在共培养体系中逐渐失去细小成纤维样的形状,形成类似精原细胞样的圆形细胞菌落,诱导7d、14 d后,RT-PCR、细胞免疫荧光均可以检测到男性生殖细胞特异性标记VASA、DAZL及Stella的表达.结论 在睾丸SCs模拟的睾丸微环境,HUMSCs不仅发生形态学的变化,而且能表达生殖细胞的特异生物学特性,表明在特定的微环境中,细胞与细胞间的相互接触是微环境中控制HUMSCs向男性生殖细胞方向分化的必不可少的因素.SCs与HUMSCs的直接接触诱导其向男性生殖细胞分化的诱导研究,为迫切需要的男性不育治疗提供了一个新的实验参考系统.
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龙葵碱损伤睾丸支持细胞诱导生精障碍的研究
目的:通过龙葵碱对睾丸支持细胞的损伤研究,阐释龙葵碱诱导生精障碍的途径.方法:选取小鼠睾丸的支持细胞进行实验,体外实验观察流式细胞仪检测细胞的周期变化,CyclinA和CDK2蛋白的表达;激光共聚焦检测细胞早期凋亡形态;免疫组化法测定支持细胞波形蛋白表达;体内实验Western blot法测定雄激素结合蛋白(ABP蛋白)表达.结果:龙葵碱引起支持细胞S期周期阻滞;降低睾丸支持细胞内Cycli-nA和CDK2蛋白的表达量;细胞出现早期凋亡的形态学特征;龙葵碱使支持细胞波形蛋白解聚消失;ABP蛋白的表达显著下降(P＜0.01).结论:龙葵碱通过周期阻滞诱导睾丸支持细胞出现凋亡,同时对支持细胞的骨架和分泌功能产生影响造成生精障碍.
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雷公藤甲素对TM4细胞氧化应激及PI3K/AKT通路的影响
目的:探讨雷公藤甲素(triptolide,TP)对TM4小鼠睾丸支持细胞氧化应激、凋亡的影响及相关分子信号调控机制.方法:不同浓度雷公藤甲素对TM4细胞染毒24 h;细胞增殖实验检测雷公藤甲素对TM4细胞增殖的抑制作用;通过2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(6-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein diacetate,DCFH-DA)探针检测TM4细胞内活性氧水平的变化;Annexin V/PI双染检测雷公藤甲素诱导TM4细胞凋亡变化;Western blot免疫印迹法分别检测凋亡标志蛋白cleaved-PARP和PI3 K/Akt通路相关蛋白表达情况.结果:细胞增殖实验提示雷公藤甲素对TM4细胞有显著抑制作用,呈浓度梯度上升[10 nmol/L:(73.77±20.95)％,100 nmol/L:(51.60±10.43)％,500nmol/L:(44.34±5.78)％];雷公藤甲素处理使细胞内活性氧水平上调(P＜0.01),呈浓度依赖性;给药组TM4细胞早期凋亡和晚期凋亡比例均上调[对照组:(3.84±1.50)％,100 nmol/L:(13.04±2.03)％,200 nmol/L:(16.24±1.34)％,400 nmol/L:(18.76±3.45)％],各给药组cleaved-PARP表达上调(P＜0.01);给药组TM4细胞中Akt、p70S6K磷酸化水平上调(P＜0.01),mTOR磷酸化水平未见显著变化(P＞0.05).结论:在体外培养条件下,雷公藤甲素可抑制TM4睾丸支持细胞增殖,并诱导TM4细胞凋亡增加,呈浓度依赖性;雷公藤甲素同时可引起TM4细胞中氧化应激水平上调,这可能是其细胞毒性机制之一;雷公藤甲素可导致Akt和p70S6K的激活,磷酸化水平升高,提示PI3K/Akt信号通路可能参与雷公藤甲素诱导的TM4细胞氧化应激反应,激活PI3K/Akt信号通路可能是其分子调控机制之一.
关键词： 雷公藤甲素 睾丸支持细胞 氧化应激 细胞凋亡 PI3K/Akt信号通路 -
睾丸sertoli细胞免疫抑制及营养作用的研究进展
睾丸支持细胞( sertoli cell,SC)的结构首先由意大利组织学家Enricol sertoli在1865年进行了描述,多年以来,SC作为生精细胞的支架,为生精细胞提供免疫屏障及营养支持的作用已经得到人们的认可,随着免疫学及分子生物学的不断深入研究,各种免疫特殊组织,如睾丸、眼前房、脑、胎盘滋养层等,受到人们的广泛关注,特别是近代人们通过对凋亡机制和各种信号传导通路的研究,加深了对SC细胞特殊免疫状态及营养作用在分子水平的认识,近研究发现SC免疫豁免的功能和营养作用可应用与某些细胞的培养与移植,SC可以延长某些移植物的存活时间及功能状态,同时SC还可以和某些细胞在体外共培养,改善细胞的生存状态和功能.
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基因芯片技术在睾丸支持细胞方面的应用进展
当前,基因芯片技术凭借其高通量、高敏感度、高度自动化和高效快速等特点,在不同领域得到了广泛应用和迅速发展.就男性不育的研究中,芯片技术可以直接快速、精准的反映与精子发生等相关的差异表达基因,并进一步利用QT-PCR、Western blot、RNAi等技术进行深入研究,取得了很多突破性进展.以往研究证实睾丸支持细胞的结构和功能与精子发生关系密切,故本文主要综述基因芯片技术在睾丸支持细胞方面的研究现状进展,并试图利用基因芯片技术探索睾丸支持细胞在不同情况下的基因改变,找出影响精子发生的关键基因或信号通路,为临床或基础在男性不育方面的研究提供新的靶向和依据.
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微囊藻毒素对大鼠睾丸支持细胞凋亡相关蛋白表达的影响
目的 利用体外培养的大鼠睾丸支持细胞研究微囊藻毒素-LR(MC-LR)对细胞中凋亡相关蛋白表达水平的影响.方法 大鼠睾丸细胞分别染毒0(对照)、0.5、1、10、20 μg/ml MC-LR溶液后培养24和48 h,采用MTT法检测细胞活性.调整细胞密度为4×106～5×106/ml,分别染毒含0(对照)、1、10 μg/ml MC-LR无血清培养液后培养24和48 h,采用Western blot法检测细胞中凋亡相关蛋白[p53基因调节蛋白(P53)、B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(Bcl-2)、前凋亡蛋白(Bax)]表达水平的变化.结果 与对照组比较,10和20 μg/ml MC-LR染毒24和48 h后大鼠睾丸支持细胞活性均降低(P＜0.05).与对照组相比,1、10 μg/ml MC-LR染毒24 h以及10 μg/ml MC-LR染毒48 h时大鼠睾丸支持细胞中P53蛋白相对表达量均显著升高(P＜0.05),10 μg/ml MC-LR染毒24、48 h大鼠睾丸支持细胞中Bax蛋白相对表达量均显著升高(P＜0.05),Bcl-2相对表达量显著降低(P＜0.05).结论 较高剂量MC-LR能明显抑制支持细胞活性,凋亡相关蛋白P53、Bcl-2、Bax参与调控MC-LR诱导的支持细胞凋亡.
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乙酸铅和氯化镉暴露对小鼠睾丸支持细胞乳酸水平的影响
目的 探究乙酸铅、氯化镉单独或联合染毒对小鼠睾丸支持细胞(15P-1细胞)乳酸(LD)水平的影响.方法 将15P-1细胞分设对照(空白培养基)组和乙酸铅(0.05～160 μmol/L)单独染毒组、氯化镉(0.05～160μmol/L)单独染毒组,染毒24 h后,测定细胞存活率.后续实验分别设对照(空白培养基)组和乙酸铅(1～60μmol/L)单独染毒组、氯化镉(0.5～30μmol/L)单独染毒组及乙酸铅(1、10、20μmol/L)+氯化镉(0.5、5、10 μmol/L)联合染毒组,染毒24 h后,测定细胞内葡萄糖摄取量、乳酸脱氢酶(LDH)活力以及细胞内、外LD浓度和pH值.结果 与对照组比较,2.5～160μmol/L乙酸铅和2.5～160 μmol/L氯化镉分别单独染毒组15P-1细胞存活率均降低(P＜0.05).与对照组比较,0.5～10 μmol/L氯化镉染毒15P-1细胞内的葡萄糖摄取量较高(P＜0.05).与相同浓度乙酸铅+氯化镉染毒组比较,仅0.5 μmol/L氯化镉单独染毒组细胞内葡萄糖摄取增加(P＜0.05).与对照组比较,1、10 μmol/L乙酸铅染毒、各浓度氯化镉染毒及10 μmol/L乙酸铅+5 μmol/L氯化镉染毒组15P-1细胞内的LD浓度较高,而20～60 μmol/L乙酸铅染毒及20 μmol/L乙酸铅+10 μmol/L氯化镉染毒组15P-1细胞内的LD浓度较低(P＜0.05);与对照组比较,1～30 μmol/L乙酸铅染毒及15、30 μmol/L氯化镉染毒15P-1细胞外的LD浓度均较低,而0.5、5μmol/L氯化镉染毒及1μmol/L乙酸铅+0.5 μmol/L氯化镉染毒组15P-1细胞外的LD浓度较高(P＜0.05).与对照组比较,10～60 μmol/L乙酸铅染毒及5～15 μmol/L氯化镉染毒15P-1细胞内的pH值较低(P＜0.05).与对照组比较,20～60 μmol/L乙酸铅染毒及各浓度氯化镉染毒15P-1细胞外的pH值较高(P＜0.05).与对照组比较,各浓度乙酸铅+氯化镉染毒组15P-1细胞内、外的pH值均较高(P＜0.05).与相同浓度乙酸铅+氯化镉染毒组比较,1、10、20 μmol/L乙酸铅单独染毒组及0.5、5、10 μmol/L氯化镉染毒组细胞内pH值较高,而1、10、20 μmol/L乙酸铅单独染毒组及0.5、10 μmol/L氯化镉单独染毒组细胞外pH值较高(P＜0.05).与对照组比较,各浓度乙酸铅染毒15P-1细胞内的LDH活力较低,而各浓度氯化镉染毒15P-1细胞内的LDH活力较高(P＜0.05).与对照组比较,各浓度乙酸铅+氯化镉染毒组15P-1细胞内LDH活力均较高(P＜0.05).与相同浓度乙酸铅+氯化镉染毒组比较,1、10、20 μmol/L乙酸铅单独染毒组及5、10 μmol/L氯化镉单独染毒组细胞内的LDH活力较高(P＜0.05).结论 乙酸铅对生精系统的损伤可能通过降低细胞内LDH活力进而抑制细胞内乳酸生成来实现,而氯化镉则可能通过抑制细胞内LD转运到细胞外供给精子发生需要的能量来实现.
