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苦参碱对AngⅡ诱导的大鼠心肌成纤维细胞的影响及其机制研究
目的：研究苦参碱对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导大鼠心肌成纤维细胞增殖和胶原合成的影响，探讨其抑制纤维化的机制。方法以AngⅡ诱导大鼠心肌成纤维细胞为研究对象，0.25～1.0 mmol/L浓度的Mat作用24 h后，采用四氮唑盐（MTT）法检测Mat对心肌成纤维细胞增殖的影响；羟脯氨酸测定胶原合成量；ELISA 法测定血管紧张素Ⅱ1型受体（AT1-R）、血管紧张素Ⅱ2型受体（AT2-R）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、转化生长因子β1（TGF-β1）和结缔组织生长因子（CTGF）的含量变化。结果 Mat以浓度依赖性方式抑制AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞增殖和胶原合成（P＜0.01），并显著抑制AT1-R和CTGF的表达（P＜0.01）。结论 Mat能够显著降低AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞中AT1-R和CTGF的含量，从而抑制细胞增殖和胶原合成增加，发挥出抗心肌纤维化的作用。
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TGF-β1 mRNA和CTGF mRNA在大鼠原代培养肺成纤维细胞中的表达
目的：检测原代培养大鼠肺纤维化的成纤维细胞中转化生长因子-β1（TGF-β1）mRNA和结缔组织生长因子（CTGF） mRNA的表达。方法12只Wistar大鼠，随机分为28 d正常组（生理盐水组）和28 d模型组（博莱霉素A2组），于实验第28天将大鼠处死，行HE和VG染色。分离大鼠肺组织用于体外原代培养成纤维细胞，传代后的成纤维细胞通过细胞爬片核酸原位杂交检测TGF-β1 mRNA和CTGF mRNA的表达情况。结果HE染色显示28 d模型组肺泡结构破坏并伴有成纤维细胞灶形成，VG染色示28 d模型组肺间质可见大量红色的胶原纤维沉积。波形蛋白（vimentin）免疫组化鉴定所培养细胞为成纤维细胞。TGF-β1 mRNA和CTGF mRNA细胞爬片原位杂交结果显示，28 d模型组大鼠肺成纤维细胞胞质中可见棕黄色颗粒，两种因子均呈阳性表达，28 d正常组胞质内几乎未见黄色颗粒，两种因子均呈阴性表达。结论原代培养大鼠肺成纤维细胞中TGF-β1 mRNA和CTGF mRNA均在28 d模型组呈阳性表达，提示TGF-β1和CTGF参与了肺纤维化的发病过程。
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生物素-链霉亲和素ELISA检测血清CTGF方法的建立及其初步应用
目的 建立生物素-链霉亲和素ELISA检测血清CTGF的方法(简称“系统ELISA血清CTGF法”),初步评估CTGF在诊断慢性肝炎(CHB)患者肝纤维化的临床价值.方法 用生物素化抗CTGF单克隆抗体和多克隆抗体建立生物素-链霉亲和素ELISA方法,测定CHB患者血清CTGF水平.264例CHB患者根据肝穿刺病理诊断结果分为无或轻度肝纤维化组(S0 ～ S1,108例)和明显纤维化组(S2～S4,156例).用ROC曲线分析CTGF诊断CHB纤维化的敏感度、特异度及符合率,并与肝纤维化标志物HA、PCⅢ、CⅣ、LN、APRI比较；多组间比较用方差分析和秩和检验,多个样本间的两两比较分别采用t检验或Mann-Whitney U检验,不同肝纤维化分期比较采用Spearman相关分析.结果 自建系统ELISA血清CTGF法测定CTGF的灵敏度为0.2 μg/L,检测范围为0～64 μg/L.用该法检测高、低浓度2份不同CTGF标准品的批内CV分别为4.5％、9.8％；批间CV分别为10.1％、12.8％.S0 ～ S1组、S2～S4组CTGF血清浓度分别为6.7(3.1 ～10.1)、16.1(11.8 ～27.2) μg/L,两组间差异有统计学意义(U=1 217,P＜0.001)；且与肝纤维化分期明显相关(r=0.689,P＜0.001).其区分CHB明显纤维化和轻度纤维化的ROC曲线下面积(AUC)为0.841 (95％ CI:0.762 ～0.920),CTGF在临界值为10.3 μg/L时,其敏感度、特异度分别为70.5％、82.4％.CTGF平行联合APRI诊断CHB肝纤维化的敏感度为96.1％,高于单项HA( 75.6％)、PCⅢ(70.5％)、CⅣ(63.6％)、LN(79.5％)、APRI( 86.3％).其特异度为65.5％,低于单项HA( 72.5％)、PCⅢ(76.5％)、CⅣ(78.4％)；CTGF系列联合PCⅢ的特异度为95.9％,高于单项HA、PCⅢ、CⅣ、LN(64.7％)、APRI(66.1％),但其敏感度为67.7％,低于单项HA、PCⅢ、LN(64.7％)、APRI (66.1％)的敏感度.结论 建立的系统ELISA血清CTGF法具有较高的敏感度、特异度和灵敏度.血清CTGF与肝纤维化分期明显相关,血清CTGF可能是预测肝纤维化分期一个较好的指标,CTGF平行联合APRI可用于CHB纤维化的筛查,CTGF系列联合可作为CHB纤维化的诊断指标.
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母体缺氧上调胎兔颈动脉生长因子及细胞外基质表达
目的 研究母体缺氧对新西兰胎兔颈动脉生长因子、细胞外基质表达及血管形态学的影响.方法 同期怀孕的新西兰母兔[足月(30±1)d]随机分为对照组(21％O2,n=5)、缺氧组(12％O2,n=5),缺氧组于妊娠第10天开始采用缺氧箱进行缺氧暴露,每天2次,上、下午各4h,至妊娠第29天结束.妊娠第29天,母兔麻醉,剖宫取出胎兔,分离胎兔颈动脉,液氮中速冻后转移至-70℃保存备检,另保存胎兔颈动脉用于免疫组织化学检查和Masson染色.用免疫印迹检测缺氧诱导因子1α(HIF-1α)、转化生长因子β1(TGF-β1)、Smad3和结缔组织生长因子(CTGF)蛋白表达;实时聚合酶链反应(Real-time PCR)检测HIF-1α、TGF-β1和CTGF mRNA表达水平;免疫组织化学技术检测颈动脉TGF-β1、CTGF、Ⅰ型胶原蛋白(Coll Ⅰ)、Ⅲ型胶原蛋白(CollⅢ)表达;Masson染色检测颈动脉胶原纤维含量及内中膜厚度.结果 与对照组比较,母体缺氧组胎兔颈动脉HIF-1α(0.26±0.05比0.07±0.04)、TGF-β1 (0.68±0.08比0.51±0.11)、Smad3(0.47±0.04比0.26±0.02)和CTGF(0.81±0.09比0.53±0.12)蛋白表达增多,HIF-1α(1.62±0.37比1.00±0.18)、TGF-β1(1.90±0.35比1.00±0.12)和CTGF(1.82±0.42比1.00±0.21)mRNA水平升高,及Coll Ⅰ (0.35±0.02比0.27±0.02)、CollⅢ(0.26±0.02比0.22±0.03)表达增多(P＜0.05或P＜0.01);而Masson染色结果提示:胶原纤维含量、内膜和中膜厚度在两组之间的差异无统计学意义(均P＞0.05).结论 母体缺氧上调胎兔颈动脉TGF-β1、CTGF、Coll Ⅰ、CollⅢ的表达.
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结缔组织生长因子诱导大鼠心肌细胞肥大的作用及其与细胞外信号调节激酶1/2的关系
目的 观察结缔组织生长因子(CTGF)诱导大鼠心肌细胞肥大的作用,探讨其作用与细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)的关系.方法 以培养的新生Sprague-Dawley(SD)大鼠心肌细胞为实验模型,用图象分析法测定心肌细胞表面积,用[3H]-亮氨酸掺入法测定心肌细胞蛋白合成速率,用考马斯亮兰法测定心肌细胞蛋白含量,用蛋白免疫印迹法(Western blot)测定心肌细胞总ERK1/2(t-ERK1/2)与磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)的蛋白表达水平.结果 (1)随着CTGF浓度的增加,心肌细胞表面积呈剂量依赖性增加,其中10、25、50、100 μg/L的CTGF组心肌细胞表面积分别为(929.9±132.2)、(1411.3±129.2)、(1732.0±153.0)、(2040.6±205.4)μm2,均明显高于对照组心肌细胞表面积[(606.3±72.7)μm2,P均＜0.01];100 μmol/L的PD98059明显减少CTGF诱导的心肌肥大(P＜0.01).(2)随着CTGF浓度的增加,心肌细胞蛋白合成速率与蛋白含量呈剂量依赖性增加,CTGF组心肌细胞[3H]-亮氨酸掺入率明显高于对照组(P＜0.01);ERK1/2抑制剂PD98059明显减少CTGF诱导的心肌细胞[3H]-亮氨酸掺入率及蛋白含量(P＜0.01).(3)随着CTGF浓度的增加,心肌细胞p-ERK1/2表达呈剂量依赖性增高,5、10、25、50、100 μg/L的CTGF组的心肌细胞p-ERK1/2表达明显高于对照组,而t-ERK1/2在各组表达差异不明显.结论 CTGF可诱导心肌细胞肥大,该作用可能是通过ERK1/2的磷酸化来实现的.
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螺内酯、厄贝沙坦单用或联用对肾血管性高血压大鼠心肌纤维化的影响及其机制
背景国外研究发现醛固酮能诱导血清和糖皮质激素诱导的蛋白激酶(SGK)+/+大鼠、结缔组织生长因子(CTGF)的表达和心肌纤维化,但在SGK-/-大鼠中醛固酮诱导的心肌纤维化过程完全被阻断,说明SGK1是醛固酮诱导心肌纤维化的必需条件.螺内酯与厄贝沙坦能否抑制心肌组织SGK1的表达,尚不清楚.目的 观察螺内酯和厄贝沙坦单用或联合应用对肾血管性高血压大鼠(RHR)心肌纤维化的疗效,观察心肌SGK1、CTGF表达的变化,探讨螺内酯、厄贝沙坦抑制心肌纤维化的可能机制.方法 采用两肾一夹法在SD大鼠中建立肾血管性高血压大鼠模型.随机分为5组:假手术组(n=8)、肾性高血压组(RHR组,n=8)、螺内酯组[20 mg/(kg·d),n=8]、厄贝沙坦组[50 mg/(kg·d),n=8]及联合用药组[联用组,螺内酯20 mg/(kg·d)+厄贝沙坦50 mg/(kg·d),n=8],每两周测定尾动脉收缩压.连续给药8周后测定左室心肌羟脯氨酸含量、心肌血管周围胶原面积(PVCA)/管腔面积、心肌胶原容积分数(CVF)等.放免法检测血浆及心肌中醛固酮水平,Western Blot法测定心肌中SGK1和CTGF蛋白的表达.结果 RHR血压显著升高,心肌羟脯氨酸含量、PVCA/管腔面积、CVF及心肌组织中SGK1、CTGF蛋白表达明显增加,药物治疗8周后螺内酯组收缩压稍降低,但差异无统计学意义(P>0.05),厄贝沙坦组与联用组收缩压显著降低(P<0.01);各治疗组心肌羟脯氨酸含量、PVCA/管腔面积、CVF及心肌组织中SGK1、CTGF的蛋白表达均降低,其中联用组效果优于单用药组(P<0.01或P<0.05),且心肌及血浆中醛固酮的含量降低.结论 螺内酯和厄贝沙坦联合应用改善肾血管性高血压大鼠心肌纤维化的作用明显优于单用药组,可能与调节醛固酮水平、减少心肌组织中SGK1和CTGF蛋白表达有关.
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RNA干扰选择性下调心肌成纤维细胞结缔组织生长因子
目的 研究RNA干扰技术能否选择性下调乳鼠心肌成纤维细胞结缔组织生长因子(CTGF)及其诱导的下游纤维化成分的表达.方法 利用差速贴壁法分离培养乳鼠心肌成纤维细胞.用携带U6启动子和CTGF特异性短发夹RNA(shRNA)编码序列的质粒载体CTGF-shRNA,及含非特异性shRNA编码序列的对照质粒CTGF-con以lipofectamine TM2000为载体转染原代培养的乳鼠心肌成纤维细胞.加入含G418的DMEM培养液培养一月筛选后获得稳定转染的细胞.通过半定量RT-PCR检测细胞内转化生长因子(TGF-β1),CTGF及其下游纤维化成分纤维连接蛋白(FN)的表达,Western-blot法检测细胞内CTGF及其下游纤维化成分纤维连接蛋白(FN)的表达.结果 CTGF在心肌成纤维细胞中有基础表达,并在转化生长因子β1(TGF-β1)刺激下其含量增加,CTGF-shRNA使心肌成纤维细胞CTGF的mRNA和蛋白质的表达分别降低65%和78%,FN的mRNA和蛋白质的表达分别降低81%和63%,而TGF-β1mRNA的表达上调32%.转染对照质粒组较空白对照组与脂质体组CTGF,FN表达量差异无统计学意义.结论 RNA干扰技术能选择性下调乳鼠心肌成纤维细胞CTGF及下游纤维化成分FN的表达,进一步为拮抗心肌纤维化的基因治疗提供了依据.
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RNA干扰靶向抑制结缔组织生长因子对心肌纤维化的影响
背量 心肌纤维化是心脏重塑的重要特征,结缔组织生长因子具有刺激成纤维细胞增殖及促进细胞外基质合成的生物学功能,是一种重要的促纤维化细胞因子,然而其对心肌纤维化的作用还没有得以系统研究.目的 研究RNA干扰技术靶向抑制结缔组织生长因子(CTGF)对自发性高血压大鼠心肌组织纤维化指标的影响.方法 20只自发性高血压大鼠随机分为未干预的SHR组和CTGF RNA干扰(RNAi)组,并设置WKY组大鼠为正常对照.在RNA干扰结束后,处死大鼠获取血液和心脏标本,计算左室质量/体质量(LVM/BM),ELISA法检测血浆纤维连接蛋白(FN)和层黏蛋白(LN)浓度;逆转录PCR和Western blot检测心肌组织CTGF及FN的mRNA和蛋白表达,免疫组化技术分析CTGF及FN的表达.天狼星红染色及羟脯氨酸测定分析心肌组织胶原类型及代谢水平.结果 RNA干扰组血压水平和LVM/BM较SHR组无明显差异(P>0.05),RNA干扰使CTGF和FN mRNA表达分别下调60%和54%(P<0.01),蛋白表达分别下调30%和44%(P<0.01);免疫组化显示了同样的抑制效应,CTGF主要存在于心肌细胞,而FN主要在心肌间质表达.天狼星红染色显示RNA干扰组胶原沉积减少,偏光显微镜下观察到RNA干扰主要抑制了I型胶原的合成;心肌组织羟脯氨酸含量和心肌组织胶原容积分数(CVF)在RNA干扰组分别显著减少36%和30%(P<0.01).结论 靶向抑制CTGF可以显著抑制细胞外基质在心肌间质的沉积,CTGF靶向性RNA干扰的抗心肌纤维化效应与降压无关.
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阿托伐他汀对自发性高血压大鼠早期心室重构的影响
背景 心肌细胞凋亡和心肌组织结缔组织生长因子(CTGF)表达的异常参与高血压心室重构的形成,阿托伐他汀能改善自发性高血压大鼠(SHR)左室重构,但其机制尚不完全明确.目的 观察阿托伐他汀早期应用对SHR左室重构、心肌细胞凋亡和心肌CTGF表达的影响,探讨阿托伐他汀对SHR左室重构的影响及其可能机制.方法 8周龄雄性SHR 16只,随机分为2组:蒸馏水灌胃组(n=8)和阿托伐他汀组[50 mg/(kg·d),n=8],同周龄同性别的WKY大鼠作为对照(WKY组,n=8).用药12周,期间观察血压.12周后,以左室质量、左室质量与体质量比值、心肌细胞横径和心肌间质纤维沉积百分比评价左室重构;Western blot方法测定心肌组织CTGF蛋白表达水平;TUNEL法检测心肌细胞凋亡率.结果 与WKY组和蒸馏水灌胃组相比,阿托伐他汀治疗显著降低SHR血清总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇和收缩压水平;与蒸馏水灌胃组相比,阿托伐他汀组SHR左室质量与体质量比值显著降低[(4.0±0.4)比(4.7±0.4)mg/g]、心肌细胞横径减小[(16.2±2.8)比(19.0±1.0)μm]、心肌间质纤维沉积显著减少[(3.3±2.1)%比(4.5±1.8)%,均P<0.05];蒸馏水灌胃组[(1.9±0.3)%]的心肌细胞凋亡率显著低于WKY组[(4.7±0.7)%],而阿托伐他汀治疗12周的SHR心肌细胞凋亡率[(5.2±0.6)%]显著高于蒸馏水灌胃组[(1.9±0.3)%,P<0.05],与WKY组无显著差异;SHR心肌组织CTGF蛋白表达水平上升,阿托伐他汀治疗对该蛋白表达有显著抑制作用.结论 SHR存在明显的左室重构,早期给予阿托伐他汀治疗可部分预防SHR左室重构,其机制可能与诱导心肌细胞凋亡、抑制心肌组织CTGF蛋白表达有关.
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EGCG对肝纤维化大鼠TGF-β1和CTGF表达的影响
目的:研究表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)的抗肝纤维化作用及其机制.方法:运用腹腔注射CCl4构建大鼠肝纤维化模型,观察EGCG对大鼠肝纤维化的影响.运用HE染色、Massion三色染色检测肝纤维化的变化;生化检测血清丙氨酸转移酶(ALT)及天冬氨酸转移酶(AST);同时检测肝组织的羟脯氨酸、还原型谷胱甘肽(GSH)和硫代巴比妥酸反应底物(TBARS)含量.免疫组织化学法观察α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达;分别运用RT-PCR和Western blot法检测转化生长因子β1(TGF-β1)及结缔组织生长因子(CTGF)mRNA和蛋白质表达.结果:EGCG对CCl4诱导的大鼠肝纤维化程度具有显著的抑制作用.EGcG对肝细胞具有显著的保护作用,与纤维化模型组比较,EGCG干预组血清ALT、AST水平降低(138.4±45.8vs 234.6±63.2,96.4±20.5 vs 186.2±36.6,均P<0.05).EGCG显著抑制肝组织α-SMA的表达.EGCG通过抑制TBARS的形成和提高GSH含量,显著改善CCl4诱导的肝纤维化大鼠肝脏的氧化状态.同时EGCG显著抑制肝组织TGF-β1及CTGF的mRNA和蛋白质的表达(均P<0.05).结论:EGCG能够显著抑制肝纤维化的进展,其机制与EGCG改善大鼠肝脏的氧化状态及抑制TGF-β1和CTGF的表达有关.
关键词： 表没食子儿茶素没食子酸酯 肝纤维化 转化生长因子β1 结缔组织生长因子 -
全反式维甲酸对慢性酒精性肝损伤大鼠肝脏TGF-β1、CTGF和Col1a1表达的影响
目的:通过观察全反式维甲酸对慢性酒精性肝损伤大鼠肝脏TGF-β1、CTGF和Colla1表达的影响,探讨该药物对酒精性肝纤维化形成的作用.方法:大鼠24只随机分为3组:酒精组(J组),给予酒精-玉米油混悬液灌胃;治疗组(A组),给予上述混悬液灌胃8 wk后加用0.15 mg/(kg·d)的全反式维甲酸灌胃;对照组(N组),给予等量的生理盐水和玉米油灌胃.16 wk后处死大鼠.光、电镜下观察肝组织病理改变,高压液相色谱法(HPLC)测肝组织中维甲酸的含量,免疫组化法检测肝组织中转化生长因子β1(TGF-β1)和结缔组织生长因子(CTGF)的蛋白水平,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测肝组织中TGF-β1、CTGF和Ⅰ型胶原前胶原α1(Colla1)的mRNA水平.结果:光镜下酒精组及治疗组均呈不同程度的酒精性肝炎改变,电镜下酒精组肝细胞线粒体肿胀,内质网扩张,脱颗粒,而治疗组改变轻于酒精组.肝组织中维甲酸含量:酒精组低于正常组,治疗组接近对照组水平.Colla1的mRNA表达在酒精组中较对照组明显增高(0.18±0.03 vs 0.10±0.02,P＜0.01),治疗组较酒精组表达下降(0.14±0.03 vs 0.18±0.03,P＜0.05).TGF-β1的mRNA及蛋白表达在酒精组中增高(0.53±0.17 vs 0.34±0.05,105.93±10.12 vs 149.27±10.17,P＜0.01),治疗组相对于酒精组有所下降(0.41±0.06 vs 0.53±0.17,130.80±6.23 vs 105.93±10.12,P＜0.05).CTGF的mRNA及蛋白表达在酒精组中增高(0.41±0.13 vs 0.17±0.05,130.84±5.72 vs 158.37±6.64,P＜0.05),治疗组对于酒精组有所下降(0.30±0.04 vs 0.41±0.13,149.23±6.65 vs 130.84±5.72,P＜0.05).结论:小剂量全反式维甲酸通过降低慢性酒精性肝损伤大鼠肝脏致纤维化因子TGF-β1,CTGF和Colla1的表达抑制早期酒精性肝纤维化的形成.
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靶向CTGF锤头核酶对TGF-β1作用下人肝星状细胞合成Ⅰ型胶原的作用
目的:探讨靶向结缔组织生长因子(CTGF)的锤头核酶抑制TGF-β1作用下人肝星状细胞(HSC)Ⅰ型胶原(Col Ⅰ)合成及其细胞周期进程的作用.方法:构建含有人CTGF锤头核酶cDNA序列的重组质粒pTriCTGF-Rz.将空质粒pTriEx2和重组质粒pTriCTGF-Rz分别转染人肝星状细胞系(LX-2)细胞.细胞分为4组:pTriEx2转染组,pTriEx2转染加TGF-β1组,pTriCTGF-R2转染加TGF-β1组和pTriCTGF-Rz转染组.采用半定量RT-PCR测定LX-2细胞CTGF mRNA和Col Ⅰ mRNA转录水平,采用ELISA和流式细胞仪分别用于LX-2细胞Col Ⅰ分泌功能和LX-2细胞周期进程的检测.结果:TGF-β1可明显提高LX-2细胞CTGFmRNA和Col Ⅰ mRNA的转录水平及分泌Col Ⅰ蛋白功能(t=11.14,14.36,7.17,均P＜0.01);pTriCTGF-Rz转染LX-2细胞既能降低基础CTGF mRNA和Col Ⅰ mRNA水平及Col Ⅰ蛋白水平(t=2.86,3.06,2.97,均P＜0.05),又能部分拮抗TGF-β1诱导LX-2细胞CTGF mRNA和Col Ⅰ mRNA转录和Col Ⅰ蛋白分泌的增加(t=2.99,3.09,3.02,均P＜0.05).TGF-β1对LX-2细胞周期进程无影响.结论:CTGF是TGF-β1作用下人肝星状细胞合成Col Ⅰ的下游介导者,TGF-β1对HSC周期进程无影响,靶向CTGF有可能成为肝纤维化基因治疗的新靶点.
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LAPTM4B-35、CTGF蛋白在食管胃交界部腺癌中的表达及其意义
目的 探讨溶酶体相关4次跨膜蛋白β(lysosomeassociated protein transmembrane-4β,LAPTM4B)基因-35及结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)蛋白在食管胃交界部腺癌组织中的表达及其意义.方法 采用免疫组织化学染色及蛋白印迹分析检测137例食管胃交界部腺癌组织中LAPTM4B-35及CTGF蛋白的表达情况,分析蛋白表达与患者临床病理参数的关系及对患者预后的影响.结果 LAPTM4B-35蛋白在89.1％的食管胃交界部腺癌组织中呈高表达状态,LAPTM4B-35高表达组癌细胞发生远处转移(P=0.011)、肿瘤进展至TNM Ⅲ/Ⅳ期(P=0.026)显著多于低表达组.CTGF蛋白在51.1％的癌组织中呈高表达状态,CTGF高表达组发生远处转移(P=0.033)、肿瘤直径＞5 cm(P=0.021)均多于低表达组.癌组织中LAPTM4B-35蛋白与CTGF蛋白表达之间呈正相关关系(r=0.218,P=0.010).单因素生存分析显示LAPTM4B-35、CTGF蛋白高表达的患者其术后生存时间分别显著低于LAPTM4B-35、CTGF蛋白低表达的患者(双侧log-rank检验,P＜0.001).LAPTM4B-35蛋白表达(P＜0.001)、发生远处转移(P＜0.001)、淋巴结转移(P=0.007)、查见脉管癌栓(P=0.022)及患者性别(P＜0.001)是影响食管胃交界部腺癌患者的独立预后因子.结论 LAPTM4B-35及CTGF蛋白的高表达与肿瘤的侵袭转移及不良预后密切相关.
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阻断肾素-血管紧张素-醛固酮系统不同环节抗大鼠肝纤维化的实验研究
目的:探讨阻断肾素-血管紧张素-醛固酮系统不同环节抗大鼠肝纤维化的作用及其机制.方法:取6周龄SD大鼠50只,随机分为正常对照组、模型组、卡托普利组、氯沙坦组和螺内酯组,每组10只.正常对照组皮下注射橄榄油,其余大鼠给予40％CCl4腹壁皮下注射,3mL/kg,首剂加倍,1次/3 d,制备大鼠肝纤维化模型；次日,卡托普利组给予血管紧张素转换酶抑制剂卡托普利60 mg/kg、氯沙坦组给予血管紧张素Ⅱ的Ⅰ型受体阻断剂氯沙坦10mg/kg、螺内酯组给予醛固酮受体拮抗剂螺内酯100 mg/kg,模型组和正常对照组给予等量的生理盐水,1次/d,均经胃管内灌注,各组动物均于第8周处死,取材,HE染色和Masson染色观察肝组织病理变化,分别应用Real-timePCR及Western blot法检测肝组织转化生长因子β1及结缔组织生长因子mRNA和蛋白质表达情况.结果:与模型组相比,卡托普利组、氯沙坦组和螺内酯组肝纤维化程度较模型组明显减轻;肝组织转化生长因子β1及结缔组织生长因子mRNA和蛋白质表达:模型组高于正常对照组(P＜0.05)；卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组较模型组均显著下降(P＜0.05),卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组间无差异(P＞0.05).结论:阻断肾素-血管紧张素-醛固酮系统不同环节均可抑制肝纤维化形成,其作用机制可能与其显著抑制转化生长因子β1及结缔组织生长因子表达有关.
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补肾柔肝方对二甲基亚硝胺诱导大鼠肝纤维化后CTGF mRNA表达的影响
目的:探讨中药复方补肾柔肝方对二甲基亚硝胺(dimethylnitrosamine,DMN)诱导大鼠肝纤维化后肝脏组织结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF) mRNA的表达影响,以了解其对肝纤维化的治疗作用和分子机制.方法:♂ Wjstar大鼠40只,随机分为正常对照组(n=10)、模型组(n=15)及治疗组(n=15).模型组和治疗组以10 mg/kg的剂量腹腔注射DMN,每天1次,每周连续3 d,共4 wk_模型组在造模结束后给予生理盐水ig,而治疗组在造模结束后给补肾柔肝方ig进行治疗干预,用药4 wk第8周末处死全部大鼠,用放射免疫试剂盒方法检测血清胶原成分HA、LN及Ⅳ-C的含量;用HE和天狼猩红染色法观察肝组织的炎症及纤维增生情况.并采用RT-PCR半定量方法,探讨大鼠肝组织CTGFmRNA的表达水平.结果:治疗组大鼠一般状态明显好于模型组:正常组大鼠无死亡,模型组死亡率为40%,治疗组死亡率20%.模型组血清胶原成分HA、LN及Ⅳ-C的含量较正常组显著增高,治疗组较模型组显著下降(HA:319.75±63.23 pg/L vs 434.44±98.81 pg/L;LN:44.83±4.09 pg/L vs 70.67±6.32 pg/L:Ⅳ-C:52.79±5.71 pg/L vs 79.39±10.52 pg/L,均P<0.01).DMN可以成功诱导大鼠肝纤维化,模型组肝组织CTGF mRNA表达明显增强,中药复方治疗组与模型组相比明显减弱(CTGF/β-actin:0.76±0.10 vs1.08±0.17,P<0.01),而正常对照组表达较少.结论:CTGF mRNA的表达可能与肝纤维化的发生密切相关,中药复方补肾柔肝方具有较好的抗肝纤维化作用,可以显著抑制大鼠肝组织CTGF mRNA的表达.
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TGF-β/CTGF在肠纤维化机制中的作用
肠纤维化是多种炎性肠病比较棘手的并发症,主要因肠间质细胞的过度增殖及细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的异常沉积所致,转化生长因子(transforming growth factor-beta,TGF-β)在此过程中起了关键作用.结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)作为TGF-β致纤维化作用的特异性下游介质,TGF-β的促肠纤维化作用可通过多种信号途径诱导CTGF的表达来完成,本文根据国内外研究资料,就肠纤维化的形成机制及TGF-β/CTGF在此进程中的作用和调控机制作一简要综述.
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参芪扶正注射液对酒精性肝纤维化大鼠ROS、SOD、LPO、NF-κB及CTGF mRNA表达的干预作用
目的:研究ROS、SOD、LPO、NF-KB及CTGF mRNA在酒精性肝纤维化大鼠中的表达状况及参芪扶正注射液的干预作用,方法:SD大鼠100只,随机分为正常对照组、模型组和参芪扶正注射液小剂量治疗组2.0mL/(100gd)、中剂量治疗组25 mL/(100 gd)、大剂量治疗组3.0 mL/(l00 g.d).以乙醇灌胃诱导大鼠肝纤维化模型,治疗组造模同时给予参芪扶正注射液尾静脉注射,共16 wk.16wk后处死大鼠取肝组织标本,光镜观察肝组织的病理变化,放射免疫法测定血清ROS、SOD、LPO含量及NF-kB活性,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测肝组织结缔组织生长因子(CTGF) mRNA表达.结果:与正常组比较,模型组SOD显著下降,肝组织纤维化积分、ROS、LPO、NF-kB活性及CTGF mRNA表达显著增加(P＜0.01);与模型组比较,治疗组SOD显著上升,肝组织纤维化积分、ROS、LPO、NF-ｋB活性及CTGFmRNA表达显著下降(P＜0.0l),肝组织纤维化积分和ROS、LPO及CTGF mRNA表达呈正相关关系((s)=0.463、0.425、0.412,均p＜0.05).结论:脂质过氧化、NF-ｋB活化、CTGF与酒精性肝纤维化的严重程度密切相关,3者对酒精性肝纤维化发生、发展有协同作用,参芪扶正注射液能显著抑制脂质过氧化、降低NFkB活性及CTGF mRNA表达,从而减轻肝组织损害严重程度.
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CTGF靶向RNA干扰重组体的构建及序列分析
目的:利用pEGFP质粒载体构建介导结缔组织生长因子(CTGF)短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达的质粒.方法:分别设计3对有小发夹结构的两条DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至带有U6启动子的质粒载体pEGFP中,构建重组体,转化DH5α菌株,提取质粒行酶切鉴定后,进行测序分析.结果:CTGF的sRNA片段被成功克隆到pEGFP质粒载体中,3个重组质粒shRNA编码序列与设计的片段完全一致,经酶切与测序证实构建成功.结论:成功构建了能表达CTGF shRNA的重组体,为下一步探索肝纤维化基因治疗的新途径打好基础.
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IL-10对TGF-β1诱导的大鼠肝星状细胞CTGF表达的影响
目的:探讨IL-10对大鼠肝星状细胞(hepaticstellate cells,HSC)表达CTGF的影响及其抗纤维化的可能机制.方法:体外培养大鼠肝星状细胞系rHSC-99,分别用不同浓度的IL-10、TGF-β1干预和两者共同干预48 h后,采用半定量RT-PCR法检测各组肝星状细胞中CTGF mRNA表达水平.结果:TGF-β1单独干预HSC,CTGF mRNA表达水平与对照组比较均明显增强(P<0.05);不同浓度的IL-10单独干预HSC,各目的基因表达与对照组比较无明显统计学意义;不同浓度的IL-10与TGFβ1共同干预HSC,CTGFmRNA表达水平与TGF-β1组比较均明显降低(P<0.05).结论:IL-10可显著抑制由TGF-β1诱导的CTGF mRNA的表达,这可能是其抗纤维化的机制之一.
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肝窦内皮细胞条件培养基对肝星状细胞表达结缔组织生长因子的影响
肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)是肝纤维化时细胞外基质(extracellular matrix,ECM)异常增生的主要细胞来源,其调控机制复杂,许多因素参与[1,2].其中结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)的研究引起关注[3].
