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小鼠胰岛分离纯化方法研究
目的：探讨可提高胰岛产量和功能活性的小鼠胰岛分离、纯化的方法。方法通过胆总管逆行灌注胶原酶溶液消化小鼠胰腺，经不连续密度梯度离心后，人工挑取、纯化胰岛。过夜培养后，用葡萄糖刺激胰岛素分泌实验（GSIS），检测胰岛功能。电子显微镜（电镜）观察胰岛β细胞亚细胞结构变化。结果利用该改良方法平均每只小鼠可收集（200±20）个胰岛，胰岛直径大小为（175±22）μm。GSIS 结果发现胰岛素水平在低糖（2.8 mmol／L）和高糖（16.7 mmol／L）刺激下分别为（0.33±0.07）、（1.36±0.47）ng／（islet·60 min），高糖刺激的胰岛素水平是低糖刺激的4.12倍，差异有统计学意义（P ＜0.05）。电镜证实胰岛β细胞胞膜、线粒体膜完整，胞内可见大小不一的胰岛素分泌泡。结论胆总管逆行灌注胶原酶消化小鼠胰腺，体外不连续密度梯度离心联合人工挑取的方法是一种简便、快捷、稳定的小鼠胰岛分离方法，小鼠胰岛产量较高、形态完整，且 GSIS反应性良好。
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浅谈器官移植实验研究的发展
实验是临床发展的基础,自18世纪开始,就陆续出现了移植实验研究的雏形,如羚羊异体角膜移植等.19世纪出现了游离组织的移植如皮肤、角膜、甲状腺、胰岛等.20世纪初,现代血管吻合技术的建立真正引领了现代器官移植实验的开展,建立了大量的动物移植模型,从而促进了临床工作的顺利进行.近30年来,器官移植及实验研究取得了迅猛发展,尤其是进入21世纪,诸多支持学科的发展,使得器官移植实验不再拘泥于传统的外科实验,从动物移植模型的模拟转而深入到细胞、分子水平开展机制研究,在器官保存、免疫耐受、异种移植、器官克隆等方面有了深入进展.下面就这些方面研究的内容作概略评述.
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阻断Notch信号通路促骨髓间质干细胞体外分化为胰岛样细胞
目的 通过Notch信号途径抑制剂DAPT构建Notch信号敲除模型,探讨Notch信号通路在骨髓间质干细胞(BMSCs)体外分化为胰岛样细胞中的作用.方法 体外分离培养BMSCs并鉴定,体外诱导其分化.用γ-分泌酶特异性抑制剂DAPT阻断Notch信号通路.采用双硫腙(DTZ)染色法鉴定胰岛细胞;间接免疫荧光染色,RT-PCR和Western印迹等方法检测诱导后细胞的胰岛素、胰高血糖素、胰十二指肠同源框1基因(Pdx-1)和神经元素3(Ngn3)的表达.ELISA法检测细胞葡萄糖刺激后分泌胰岛素水平.结果 (1)BMSCs鉴定:间接免疫荧光染色结果显示:BMSCs表达CD59和CD90抗原,体外可表达神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)等神经细胞标记物,证实其具多向分化潜能.(2)MTT结果显示:γ-分泌酶抑制剂(DAPT)可抑制BMSCs增殖,其效应有时间和剂量依赖性.并以剂量和时间依赖性方式抑制Notch信号通路靶基因Hes1的表达.用1、5、20 μmol DAPT处理96 h后细胞的Hes1表达分别为对照组的92.06％、71.40％、46.89％,提示其对Notch信号通路阻断率分别达到7.94％、28.6％和53.11％(均P＜0.05).(3)间接免疫荧光结果显示:DAPT阻断组的胰岛素和胰高血糖素阳性细胞百分比较对照组明显增多[分别为(74.03±3.96)％比(36.49±3.24)％;(64.81±4.37)％比(37.50±3.69)％,均P＜0.05].提示阻断Notch信号通路后BMSCs体外分化效率增加.(4)RT-PCR和Western印迹结果提示:BSMCs诱导14 d后可以检测到胰岛素、胰高血糖素表达,DAPT阻断后上述蛋白表达上调;BMSCs诱导早期(7 d)即表达Pdx-1和Ngn3,14d后达到高峰,之后逐渐下降.DAPT阻断后Pdx-1和Ngn3的表达增加.(5)ELISA结果显示:诱导后细胞对葡萄糖刺激有分泌胰岛素反应,DAPT阻断后诱导细胞的反应更好.结论 大鼠BMSCs体外可分化为胰岛样细胞;阻断Notch信号通路可通过改变胰腺关键转录因子的表达而增强BMSCs体外分化能力.
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氯氮平对体外培养大鼠胰岛分泌功能的影响
目的研究不同浓度氯氮平在不同条件下对外培养大鼠胰岛分泌功能的影响.方法利用细胞培养技术,在不同葡萄糖浓度(3.3 mmol/L或16.7 mmol/L)和不同作用时间(1 h或4 h)下,以0.2、1、5或10μmol/L氯氮平作用于大鼠胰岛,用放射免疫分析法测定培养上清液中胰岛素浓度,与相应对照组比较.结果培养液葡萄糖浓度为3.3 mmol/L,培养1 h,氯氮平各浓度组胰岛素分泌量与对照组相比无显著性差异;培养4 h,4种浓度氯氮平均抑制胰岛素分泌,但各浓度组间无显著性差异.培养液葡萄糖浓度为16.7 mmol/L,培养1 h或4 h,4种浓度氯氮平均不影响胰岛素分泌.结论氯氮平抑制基础胰岛素分泌,与剂量无关;胰岛素分泌缺陷和胰岛素抵抗的共同作用可能是氯氮平引起糖代谢异常的机制.
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误收住精神科之胰岛B细胞瘤1例
患者女性,40岁,农民,以"间断性四肢抽搐8月,加重20天"之主诉于2001年11月25日入住我院精神科,后经我科会诊以"胰岛B细胞瘤"之诊断转入我科.
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叙利亚金黄地鼠胰岛的分离、纯化与功能鉴定
目的 构建成年叙利亚金黄地鼠胰岛的分离、纯化及功能鉴定的方法.方法 胶原酶V灌注分离成年叙利亚金黄地鼠胰腺,不连续密度梯度法纯化胰岛.经DTZ染色后于倒置显微镜下测定胰岛细胞的数量和纯度.通过胰岛素释放试验检测胰岛细胞的功能.结果 纯化后每只地鼠胰腺可获得(359±35)胰岛细胞当量,胰岛纯度>90%,胰岛活率>90%.在低糖和高糖刺激下,胰岛细胞体外培养液中胰岛素含量的浓度分别为(3.29±0.32)mU/L和(11.12±0.57)mU/L.高糖刺激后胰岛素释放肇为低糖的3.38倍.体外培养1周生长状况良好.结论 成功获取了高纯度、高活率的金黄地鼠胰岛细胞.
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沉默组织因子重组腺病毒的构建和胰岛中沉默效果检测
目的 构建复制缺陷型重组腺病毒介导短发夹RNA(shRNA):干扰组织因子(TF)在胰岛表达.方法 设计并合成四对单链寡核苷酸(ss oligo),经变性退火为双链寡核苷酸(ds oligo)插入穿梭质粒pENTR/U6载体,测序正确后经脂质体介导入成人胰岛,通过实时定量RT-PCR方法筛选对TF沉默效果佳穿梭质粒pENTR/U6-shRNA,然后与腺病毒骨架质粒行同源重组.筛选出正确重组子,用293A细胞包装出表达TF-shRNA的复制缺陷型重组腺病毒并测定其病毒滴度.通过实时定量RT-PCR腺病毒沉默TF效果予以检测.结果 测序结果提示所构建的pENTR/U6-shRNA质粒正确,并从四对ds oligos筛选出对组织因子沉默效果佳的穿梭质粒pENIR/U6-shRNA,经同源重组后成功构建了介导shRNA-TF复制缺陷型重组腺病毒.转染胰岛后,通过实时定量RT-PCR方法检测发现shRNA-TF腺病毒感染胰岛后对TF mRNA的沉默效果4 d后达佳效果,为54.29%(P＜0.05 vs NC).结论 成功构建的介导shRNA复制缺陷型重组腺病毒可以体外抑制胰岛细胞中组织因子的表达.
关键词： 重组腺病毒 组织因子 短发夹RNA(shRNA) 胰岛 基因沉默 -
连续和不连续密度梯度法纯化人胰岛的效果比较
目的 使用COBE 2991细胞处理器比较连续和不连续密度梯度纯化法纯化人胰岛的效果.方法 胰腺消化产物使用COBE 2991细胞处理器分别采用不连续和连续密度梯度法进行离心纯化,并对纯化后得到的胰岛取样检测其数量、纯度.换算为胰岛当量(IEQ),计算胰岛回收率,比较两种纯化方法的效果.结果 连续密度梯度纯化法得到的胰岛产量(55 000 IEQ vs 206 000 IEQ,P=0.000)、纯度(58.0%±8.O% vs 33.5%±10.3%,P=0.000)优于不连续密度梯度纯化法,胰岛活性没有明显差异.结论 连续密度梯度法纯化效果优于不连续密度梯度法.
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一种简易高效的大鼠胰岛分离纯化方法
目的探索一种高效、高纯度大鼠胰岛分离纯化方法,并研究纯化后的胰岛细胞在体内外环境中的基本生物学功能状况.方法采用Hanks液经胰管内注射法机械性扩张破坏大鼠胰腺的腺泡组织,然后将其剪碎置于含1 g/L胶原酶的Hanks液中,于37℃中静止消化25～30min后移入含10%胎牛血清的RMPI-1640完全培养液中,24℃短期培养,Ficoll-400非连续密度梯度液离心纯化胰岛,纯化后的胰岛进行异种移植.结果经Ficoll-400纯化后,平均每只成年Wistar大鼠胰腺能获得920～1 230个胰岛,纯度可达98%以上;在葡萄糖刺激下胰岛素释放量约为基础分泌水平的2.2倍(P＜0.001)纯化后的胰岛异种移植可逆转实验性糖尿病BALB/C小鼠的高血糖平均达(8.7±1.6)d.结论胰腺清化物经短期培养后再透行胰岛纯化的方法具有耗酶量少、技术难度小、胰岛纯度和产率及活率高的特点,是一种简便易行的高效分离纯化方法.
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高糖诱导人脐血间充质干细胞向胰岛样细胞分化
目的:探讨脐血间充质干细胞向胰岛样细胞分化的潜能.方法:分离脐血有核细胞,将其置于MesencultTM培养基中进行培养,并利用贴壁法进行纯化、扩增.扩增后的脐血间充质干细胞用含体积分数5%胎牛血清的H-DMEM持续诱导.采用胰岛素免疫荧光染色对诱导后的细胞进行鉴定,定量检测胰岛素分泌水平及其对葡萄糖刺激的反应性.结果:诱导后,细胞形态发生明显变化,变圆而且聚集成团;细胞的胰岛素免疫荧光染色为阳性;而且细胞能分泌少量胰岛素,并对糖刺激具有反应性.结论:在高糖环境中,脐血间充质干细胞具有向胰岛样细胞分化的潜能.
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体外诱导人骨髓间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的研究
目的:探讨体外诱导人骨髓间充质干细胞(MSCs)向胰岛β样细胞分化.方法:在无菌条件下从正常成人骨髓中分离间充质干细胞,体外培养传3代后用表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、β-巯基乙醇和高糖培养基诱导MSCs向胰岛β样细胞分化.观察MSCs在诱导前后的形态变化;用胰岛素免疫细胞化学染色检测胰岛素的表达;用双硫腙染色鉴定胰岛β样细胞.结果:未经诱导的MSCs在培养体系中呈贴壁生长,长梭形,经诱导分化后,细胞逐渐变圆,并聚集成团;胰岛素免疫细胞化学表明细胞团内的细胞呈胰岛素染色强阳性反应;双硫腙染色阳性.结论:人骨髓间充质干细胞可在体外被定向诱导分化为胰岛β样细胞.
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新生鼠胰岛分离与纯化的实验研究
目的:探讨新生鼠胰岛的分离和纯化,为体外培养胰岛和胰岛细胞奠定基础.方法:将100只新生Wistar大鼠分为10组,每组10只,用V型胶原酶消化胰腺,用质量分数35%牛血清白蛋白(BSA)和葡聚糖作为纯化剂,分离和纯化胰岛.结果:每组胰岛收获量为(780±23)个,纯度达92%,活性为86%,胰岛的分泌功能良好.结论:联合应用35%BSA和葡聚糖分离纯化新生鼠胰岛是可行的.
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胰岛素样生长因子-1对大鼠胰岛功能及细胞凋亡的影响
目的 研究胰岛素样生长因子-1(IGF-1)在高糖条件下对大鼠胰岛功能及胰岛细胞凋亡的影响.方法 体外培养SD大鼠胰岛48 h,按培养液不同分为3组:对照组(葡萄糖5.6 mmol/L)、高糖组(葡萄糖15.6 mmol/L)、IGF-1组(葡萄糖15.6 mmol/L+IGF-1.10 ng/mL),检测项目(1)胰岛细胞分泌功能:放射免疫法、免疫组织化学法;(2)胰岛细胞凋亡:Hoechst33342染色免疫荧光法、DNA断裂的原位末端标记法(TUNEL法)、免疫组织化学法、透射电镜.结果 与对照组比较,高糖组胰岛素分泌量、细胞内胰岛素表达率明显减少(P＜0.05);凋亡细胞明显增多,人B细胞淋巴瘤/白血病因子-2(Bcl-2)表达率明显减少(P＜0.05);细胞核碎裂固缩多,核仁消失核膜变形分泌颗粒减少可见淀粉样物质沉积.与对照组及高糖组比较,IGF-1组胰岛素分泌量、胰岛素表达率均明显升高(P＜0.05);胰岛细胞凋亡率低于高糖组但高于对照组(P＜0.05)、Bcl-2表达率高于高糖组但低于对照组(P＜0.05);核碎裂、核固缩少,细胞核形态结构正常及分泌颗粒数量相对增加.结论 IGF-1可以直接作用于胰岛,有促进胰岛素分泌及抗细胞凋亡作用,这种功能可能与诱导抗凋亡因子Bcl-2高表达有关.
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胰腺干细胞对移植胰岛的保护作用
目的 探讨胰腺干细胞对胰岛体外存活时间及保持胰岛功能的作用,为胰岛移植治疗1型糖尿病提供更多高质量胰岛.方法 分离纯化培养SD大鼠胎鼠胰腺干细胞;不连续密度梯度分离纯化SD大鼠胰岛;实验分组:单纯胰岛培养组(以下简称单纯培养组)、胰岛与胚胎胰腺干细胞联合培养组(以下简称联合培养组),体外观察胰岛形态变化,AO/PI法观察胰岛存活率,酶联免疫吸附法(ELISA)检测胰岛素分泌量及刺激指数.体内实验分别取两组培养7 d的胰岛600个移植于糖尿病大鼠左肾包膜下,术后监测血糖变化情况.结果 联合培养组的胰岛存活率显著高于单纯培养组,培养7 d存活率分别为70%,40%;14 d时为40%,5%;均P<0.01;高糖刺激下联合培养组胰岛分泌量及刺激指数均高于单纯培养组,培养7 d时高糖刺激下胰岛素分泌量分别为(571.4±42.5)ng/L和(392.8±20.2)ng/L(P<0.01),刺激指数1.95±0.24和1.51±0.13(P<0.01).联合培养后的胰岛左肾包膜下移植大鼠血糖可于第5天降至正常,而单纯培养后的胰岛移植血糖没有降至正常.结论 胎鼠胰腺干细胞与胰岛联合培养可以明显延长胰岛体外存活时间并保持良好的活性,对胰岛具有良好的保护作用.
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壳聚糖/海藻酸钠微胶囊包埋大鼠胰岛异种腹腔移植的实验研究
目的 探讨用壳聚糖代替聚赖氨酸,制备包埋大鼠胰岛的壳聚糖/海藻酸钠(ACA)微胶囊进行异种胰岛移植的可行性.方法 SD大鼠胰腺原位消化法分离纯化胰岛,气流吹喷制作海藻酸钠/壳聚糖/海藻酸钠(ACA)微囊化大鼠胰岛,比较微囊化与未微囊化胰岛的胰岛素释放情况、在异种受体腹腔内存活情况及糖尿病小鼠模型血糖逆转情况.结果 实验组与对照组的胰岛素释放试验差异无显著性(P＞0.05);实验组糖尿病小鼠模型血糖正常持续时间为23～65 d(平均48 d),对照组为3～6 d(平均5 d),两组差异有显著性(P＜0.05);小鼠腹腔灌洗分离ACA微囊化大鼠胰岛,发现微囊膜完整,囊壁无纤维化,胰岛存活良好.结论 ACA微胶囊具有良好的免疫隔离作用,胰岛素释放正常并可使异种胰岛移植物存活时间明显延长.
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功能性与无功能性胰岛细胞肿瘤的临床病理特征分析
目的了解功能性与无功能性胰岛细胞肿瘤在临床病理特征方面存在的差异.方法将44例胰岛细胞肿瘤分为功能组和无功能组,对其临床病理特征进行回顾性分析比较.结果功能组36例,无功能组8例.无功能组病程短,定位诊断阳性率高,肿瘤体积大,多位于全胰或胰头部,可合并浸润或转移,手术操作复杂,切除率较低,治愈率较低,生存期较短.两组镜下细胞形态相似.结论无功能性胰岛细胞肿瘤治疗较困难,预后较差.
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外科手术治疗2型糖尿病:肠-胰岛轴机制和展望
1982年,Pories等在手术治疗病态肥胖症时偶然发现合并有2型糖尿病的患者接受减肥手术后,体重显著减轻的同时血糖也快速恢复了正常,且不再需要采取任何降糖措施维持[1].从而开创了一条外科手术治疗2型糖尿病的新途径.
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Leptin与2型糖尿病
Leptin(瘦素)是肥胖基因(ob)编码,由脂肪组织分泌的一种多肽激素.Leptin与下丘脑的Leptin受体(OB-R)结合,通过下丘脑调节食欲和(或)能量代谢,从而控制机体体脂平衡.此外,在外周组织,如胰岛、肝脏、骨骼肌和脂肪组织等也存在Leptin受体,Leptin与外周组织OB-R受体结合,可直接调节各器官的功能和物质代谢.
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松龄血脉康对35例老年高血压患者糖耐量及胰岛素含量的影响
对象和方法1.对象1995年11月至1996年6月住院病人35例,男27例,女8例,年龄60～92(平均69)岁.高血压按WHO诊断标准,排除糖尿病.糖耐量异常的入选标准按冯凭提出的标准[1].
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建立自发缓解2型糖尿病动物模型可行性探讨
目的 探讨建立2型糖尿病自然病程中高血糖自发缓解现象动物模型的可行性.方法 将8只C57BL/6J品系雄性小鼠(体质量21g)随机分为高脂饮食组(4只)和对照饮食组(4只),分别予高脂饲料(20％碳水化合物、20％蛋白质、60％脂肪)和匹配对照饲料(70％碳水化合物、20％蛋白质、10％脂肪)喂养.每周监测2组体质量、血糖、摄食量,为期12个月.高脂饮食诱导高血糖出现及自发缓解时行葡萄糖耐量实验、胰岛素耐量实验.观察终点检测2组小鼠血清胰岛素、血脂、肾脏功能及评价胰岛β细胞质量.结果 高脂饮食组空腹血糖呈现动态变化,第3个月开始出现空腹高血糖,与对照饮食组比较差异有统计学意义(P＜0.01),这一趋势持续至第7个月;第8个月空腹血糖开始下降,与对照饮食组比较差异无统计学意义(P＞0.05),直至观察终点.上述高血糖自发缓解表型伴随体质量持续增加、胰岛素抵抗进展、平均胰岛面积增大、血清胰岛素水平显著升高.结论 12个月单纯高脂饮食喂养C57BL/6J小鼠可作为2型糖尿病自发诱导缓解的动物模型.
