大鼠增龄中胰腺超微结构的变化及胰岛的分布规律

目的探讨胰腺超微结构的增龄变化及胰岛的分布规律,以提供胰腺移植的参考.方法取30只健康SD大鼠,分3组,幼年、青年、老年各10只,每只取胰头、体、尾做组织切片光镜观察.每组选3只取胰尾做透射电镜观察.结果透射电镜观察老年鼠胰腺外分泌部的腺细胞,胞核固缩,酶原颗粒减少,线粒体脱嵴肿胀,粗面内质网扩张,出现脂滴,溶酶体增多,而内分泌部的B细胞分泌颗粒空晕增宽,数量减少,粗面内质网脱粒,线粒体减少.A细胞无明显年龄变化.光镜观察老年鼠胰腺小叶间结缔组织增生,胰岛的分布以幼鼠胰尾数量为多.结论胰腺外分泌部的腺细胞和内分泌部的B细胞呈现与年龄相关的结构变化,胰岛的分布以幼鼠胰尾的胰岛数目为多.提示胰腺移植的供体以幼年胰尾为佳,老年不宜.

APA微囊细胞移植的免疫隔离作用

随着器官移植研究的深入,诸如移植物排斥反应、供体缺乏等一系列问题出现在人们面前.1980年,Lim等[1]首次采用微囊免疫隔离技术进行胰岛微囊化移植研究,为人类解决这些问题提供了新思路.

胚胎胰岛细胞发育相关基因表达的研究

胰岛B细胞、A细胞的快速双染

组织学特殊染色技术及免疫组织化学技术已广泛应用于基础医学和临床医学的科研工作中.本快速染色法即用组织学醛品红染色法和免疫组织化学SP法在同一张切片上对胰岛B细胞和A细胞进行了双重染色,取得较好的效果,现作简单介绍.取大鼠胰腺,Bouin液固定,石蜡包埋,切5μm厚切片.双染步骤如下:第一步,胰岛B细胞的醛品红染色:切片脱蜡到水;入0.25%浓硫酸和0.25%高锰酸钾等量混和液中3min;蒸馏水洗后入5%草酸2min;蒸馏水洗;再经70%酒精后入醛品红染液15min;70%酒精分色后,蒸馏水洗.第二步,胰岛A细胞的免疫组化染色:将经醛品红染色后的切片,入3%甲醇双氧水室温孵育15min;蒸馏水洗后枸橼酸缓冲液(0.01M,pH6.0)(电炉加热煮沸92 ℃～98℃)进行抗原修复10min;PBS浸泡5min后,用正常羊血清室温封闭3 0min;弃去多余羊血清,滴加一抗(抗胰高血糖素抗体,1∶1500),37℃,孵育2hr;PBS室温洗10min后,滴加生物素标记的二抗,37℃,孵育40min ;PBS室温洗10min后,滴加辣根酶标记的链霉卵白素工作液,37℃,孵育40m in;PBS室温洗10min,DAB显色.结果及讨论:此染色方法在同一张切片上所观察到的胰岛B细胞呈蓝紫色,而胰岛A细胞呈棕黄色,两者颜色对比清晰.细胞核不着色.本方法可在一个工作日内完成,即提高了工作效率,又减少了免疫组织化学多重染色中步骤多、时间长,易受外界因素影响的限制,进而降低了非特异性染色.因此,该方法在科研工作中具有一定的应用价值.

胰岛β细胞保护的研究进展

多种因素可引起胰岛β细胞的损伤,因此通过保护胰岛β细胞来治疗糖尿病的研究受到人们广泛重视.保护途径较多,包括免疫机制、阻断细胞因子的作用、使用自由基清除剂、采用免疫隔离技术以及基因重组技术.胰岛细胞保护为治疗糖尿病提供了新的思路和方法.

胰腺移植和胰岛移植的现状

糖尿病是临床常见病,据推测至2010年全球糖尿病患者预计将超过3.5亿,其中5%～10%的患者将因糖尿病晚期出现的糖尿病肾病、视网膜病变、微血管病变和神经末梢病变等并发症而直接影响生命,因此糖尿病及其并发症作为一项重要而艰巨的课题仍然困扰着广大医务工作者.

露蜂房对淋巴细胞与胰岛混合培养系统中淋巴细胞转化的影响

目的 初步探索露蜂房对淋巴细胞与胰岛混合培养系统中淋巴细胞转化的影响.方法 露蜂房水提取液系利用其生药通过水提醇沉法制备获得.无菌制备大鼠淋巴细胞及猪胰岛组织悬液,并对二者进行混合培养,在37 ℃、5% CO2的培养箱中进行,培养过程中分别加入3种浓度(4.0、0.4及0.2 g/ml)的露蜂房水提取液,即露蜂房Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ组,应用 3H-TdR掺入法测定放射性核素每分钟脉冲数(cpm),观察大鼠淋巴细胞的转化情况,并设立空白组和环孢素A(CsA)组作为对照.结果 3种浓度的露蜂房水提取液对大鼠淋巴细胞的转化均有明显抑制作用(P＜0.001),3组抑制率分别为45.3%、 29.6% 和 9.2%; 但与CsA相比,免疫抑制作用较弱(CsA抑制率为80.7%).结论 露蜂房对淋巴细胞胰岛混合培养系统中的淋巴细胞转化有抑制作用,且随浓度增加抑制作用增强,提示露蜂房可以抑制T细胞介导的免疫功能.

大鼠胰岛的分离纯化方法改进与功能鉴定

目的 通过改进胰腺消化和分离的技术条件,提高成年大鼠胰岛分离纯化产率和质量. 方法 用胶原酶Ⅺ液灌注消化成年SD大鼠胰腺,对胰岛分离纯化方法加以改进:以 4 种比重的 Euro- Ficoll (F1∶D=1.132,F2∶D=1.108,F4∶D=1.069) 和 Hank's 液(F5∶D=1.023) 不连续密度梯度离心,以离心半径 15 cm,2 000 r/min 于4℃缓慢升降离心 20 min,收集位于F1 和 F2界面的胰岛.双硫腙特异染色法鉴定胰岛纯度;二醋酸酯荧光素/碘化丙啶染色法计算胰岛成活率;放射免疫分析法检测葡萄糖刺激的胰岛素分泌量,计算刺激指数.将胰岛当量(islets equivalent quantity,IEQ) 为 1000 的胰岛移植于同品系糖尿病大鼠肾包膜下,9d 内隔日观察动物血糖的变化,评价胰岛功能.比较分离条件优化前后收获胰岛的产率和质量. 结果 改进纯化方法后每只大鼠胰岛收获量为(920±122) IEQ,胰岛纯度> 90%,胰岛细胞成活率为 91%±2%.胰岛细胞功能良好,在低糖和高糖刺激后培养液中胰岛素浓度分别为(18.25±0.32) mU/L 和(36.70±3.57)mU/L,刺激指数为 2.01±0.15.1000 IEQ 胰岛移植于糖尿病大鼠肾包膜下,观察期内可维持动物血糖水平正常. 结论 改进后的胶原酶灌注消化和不连续梯度离心方法提高了胰岛的产率,保证了胰岛的高纯度及高成活率.

BMSCs对猪胰岛缺氧再给氧损伤的保护作用

目的 研究恒河猴BMSCs在缺氧再给氧环境下对新生猪胰岛活性和功能的保护作用. 方法 取健康成年恒河猴5只,体重6～10 kg,取骨髓采用骨髓单核细胞贴壁培养法筛选获得BMSCs;取3～5日龄新生长白猪5只,取胰腺以V型胶原酶消化制备新生猪胰岛.将实验分为胰岛正常组(A组)、胰岛加BMSCs正常组(B组)、胰岛缺氧再给氧组(C组)、胰岛加BMSCs缺氧再给氧组(D组),观察比较常规培养和缺氧(1％O2)12 h再给氧24h或48h条件下,胰岛的功能活性变化:二乙酸荧光素/碘化丙啶(propidiumiodide,PI)染色计算胰岛成活率;细胞计数试剂盒8法检测新生猪胰岛的代谢活性;膜联蛋白V-FITC/PI标记后流式细胞仪检测胰岛凋亡率;葡萄糖刺激法分析胰岛功能糖刺激指数(stimulation index,SI). 结果 C组较A、B组胰岛团更为分散,死亡细胞增多;D组较C组胰岛团完整,成活率更高.A、B、C、D组胰岛成活率分别为90.2％±9.1％、88.3％±5.9％、52.3％±12.1％、71.4％±11.5％,C、D组显著低于A、B组(P＜0.05),D组显著高于C组(P＜0.05).D组BMSCs以1∶10和1∶20比例与胰岛缺氧再给氧共培养后,代谢活性显著高于C组(P＜0.05).A、B、C、D组胰岛凋亡率分别为27.1％±3.2％、24.0％±1.0％、64.3％±1.8％、46.2％±1.4％,C、D组显著高于A、B组(P＜ 0.05),但D组显著低于C组(P＜0.05).各时间点A、B组SI比较差异均无统计学意义(P＞ 0.05),C组显著低于A、B组(P＜0.05),在24 h和72 h时D组显著高于C组(P＜0.05). 结论 BMSCs对缺氧再给氧诱导的新生猪胰岛活性和功能损伤具有保护作用.

大鼠胰岛分离纯化技术的改良及活性研究

目的 胰岛的纯度和活性对胰岛移植治疗糖尿病的疗效有很大影响.探讨一种大鼠胰岛分离纯化的新方法,以获得高纯度、高产量、活性好的胰岛. 方法 选取健康成年雄性SD大鼠lO只,体重250～300 g,逆行胆总管灌注V型胶原酶溶液,38℃水浴消化约15 min后,采用两种方法纯化胰岛细胞:A组采用 Ficoll 400不连续密度梯度液,B组采用Ficoll-Paque~(TM) PLUS溶液.行双硫腙(dithizone,DTZ)染色鉴定胰岛并计算胰岛当量(islet equivalent quantity,IEQ)、胰岛纯度,锥虫蓝染色检测胰岛活性.取B组胰岛用海藻酸钠-聚左赖氨酸-海藻酸钠(alginate/poly-L-lysine/alginate,APA)包裹制备胰岛微囊,体外静止葡萄糖刺激胰岛素释放实验检测微囊化和未微囊化胰岛的生物学活性. 结果 DTZ染色示胰岛呈猩红色,有圆形、椭圆形和不规则形,胰岛边缘清晰,大部分直径为50～300μm.A、B组IEQ值分别为338.04±76.61和834.80±54.00,比较差异有统计学意义(P＜0.05).A、B组胰岛纯度分别为88.31%±2.67%和95.63%±1.96%,差异无统计学意义(P＞0.05).A、B组胰岛活率分别为67.40%±5.15%和86.05%±2.52%,差异有统计学意义(P＜0.05).胰岛APA微囊囊形呈完整圆形,大小均匀,微囊直径为1.5～2.0 mm,每个微囊中包裹1～3个胰岛.葡萄糖刺激释放胰岛素实验显示,未微囊化胰岛和微囊化胰岛在低糖下的胰岛素分泌浓度分别为(5.53±1.64)ng/mL和(4.76±0.26)ng/mL,高糖下分别为(11.95±2.07)ng/mL.和(14.34±3.18)ng/mL,高糖刺激下胰岛素释放量为低糖刺激的2倍多,差异有统计学意义(P＜0.05);两组的刺激指数分别为2.16±0.30和3.01±0.59,差异无统计学意义(P＞0.05). 结论 Fieoll-Paque~(TM) PLUS溶液作为纯化液分离纯化胰岛的方法具有操作简便、胰岛产量高、纯度高等优点,获得的胰岛经微囊化或未微囊化体外培养均有良好活性.

生物素对高糖状态下大鼠胰岛β细胞功能的影响

目的 探讨生物素对高糖损伤胰岛β细胞功能的影响.方法 采用Dextran密度梯度离心法分离纯化大鼠胰岛,在含5.5 mmol·L~(-1)葡萄糖、5.5 mmol·L~(-1)葡萄糖+1 μmol·L~(-1)生物素、含27.0 mmol·L~(-1)葡萄糖及27.0 mmol·L~(-1)葡萄糖+1 μmol·L~(-1)生物素的RPMI 1640培养基中培养48 h,分析3.3、27.0 mmol·L~(-1)葡萄糖刺激的胰岛素分泌及胰岛细胞中胰岛素的含量;提取总mRNA,RT-PCR扩增前胰岛素源基因,电泳并进行灰度分析.结果 在5.5 mmol·L~(-1)葡萄糖培养条件下,生物素增加高糖诱导的胰岛素释放及胰岛细胞的胰岛素含量,前胰岛素源mRNA也增加;在27.0 mmol·L~(-1)葡萄糖培养铝h的胰岛中,胰岛细胞中的胰岛素浓度降低,高糖诱导的胰岛素释放及前胰岛素源mRNA显著减少;生物素的共培养,部分提高了高糖诱导的胰岛素释放及前胰岛素源mRNA含量.结论 生物素通过促进胰岛素的合成显著改善了高糖损伤胰岛β细胞的功能紊乱.

飞天蜈蚣七对实验性肝纤维化大鼠胰岛β细胞功能的影响

目的探讨应用飞天蜈蚣七抗肝纤维化时对大鼠胰岛β细胞功能的影响.方法以四氯化碳诱导大鼠肝纤维化模型,设立正常组,模型组和飞天蜈蚣七组.正常组于实验开始时取胰腺,模型组和飞天蜈蚣七组则分别于造模后3周,6周取胰腺作胰岛细胞的分离与培养,然后测定其培养上清液胰岛素含量.结果 3周模型组大鼠空腹血清胰岛素与正常组差异无显著意义,而6周模型组大鼠空腹血清胰岛素为(53.8±3.1)mU/l,正常组为(24.5±2.5)mU/l,两组比较q=12.87,P＜0.05;3周模型组大鼠胰岛细胞的基础胰岛素分泌与正常组差异无显著意义,而6周模型组大鼠胰岛细胞的基础胰岛素分泌量为(50.90±12.86)μU/ml,正常组为(34.87±5.16)μU/ml,两组比较q=11.08,P＜0.01;3、6周飞天蜈蚣七组大鼠胰岛细胞的基础胰岛素分泌量分别为(156.01±7.11)μU/ml和(141.43±39.01)μU/ml,均高于相应模型组,F值分别为65.80和12.66,P＜0.01.结论飞天蜈蚣七可增加四氯化碳所致肝纤维化3、6周大鼠胰岛β细胞的基础胰岛素分泌量.

免疫抑制剂依维莫司对大鼠胰岛细胞的毒性作用

目的 观察依维莫司等免疫抑制剂对大鼠胰岛瘤细胞(INS-1)和SD大鼠正常胰岛细胞代谢活性和功能的影响,旨在探讨依维莫司在胰岛移植免疫抑制治疗中的安全性和可行性.方法 不同浓度梯度免疫抑制剂依维莫司、西罗莫司、环胞霉素A和霉酚酸酯处理INS-1和正常胰岛细胞,用MTT法检测细胞的代谢活性;用葡萄糖刺激胰岛素分泌实验检测胰岛细胞的胰岛素分泌功能.结果 临床血药浓度以上的依维莫司和西罗莫司高浓度组胰岛细胞增殖抑制率低于环胞霉素A和霉酚酸酯(P＜0.05);依维莫司在临床血药浓度范围和其它免疫抑制剂一样可以抑制胰岛细胞的胰岛素分泌功能,各组间的刺激指数差异无统计学意义.结论 依维莫司和西罗莫司对INS-1细胞及SD大鼠胰岛的毒性作用较小,环胞霉素A和霉酚酸酯对INS-1和SD大鼠胰岛具有较为明显的毒性作用,依维莫司有望作为新型免疫抑制剂应用于临床胰岛移植.

Beaglf犬选择素E基因组DNA的克隆、序列分析及同源性比较

目的研究胰岛的血液引流与胰腺外分泌的机能联系与临床意义.方法运用微血管树脂/墨汁灌注扫描电镜/光镜观察法、保留动态及组织信息在静态样本的微循环观察法、FITC标记红细胞(FITC- RBC)荧光活体显微镜观察法以及计算机图像处理微血管三维重建法,对11例男性尸体、40只猴、24只狗、62只鼠、24只兔的胰岛血液引流通道与胰腺外分泌腺泡的关系进行了系统研究.结果不同动物的内分泌胰岛血液主要经胰岛的三种类型输出血管引流至不同的外分泌腺泡区域,灵长类的部分胰岛血液还引流至邻近的小胰岛,研究者根据胰岛引流系统的特征对其进行了分类及命名:①连续型引流系统,所有胰岛具有这类引流(输出)管道,其管径细,行程短、引流至胰岛周围的腺泡毛细血管区域.②聚合型引流系统,为部分胰岛所有,其管径粗、行程长,引流至远离胰岛的腺泡毛细血管区域.③跨越型引流系统,为部分胰岛所有,其输出管道越过小叶间隔引流至另一胰腺小叶的腺泡毛细血管区域,而这一小叶往往没有胰岛存在.④胰岛-胰岛型引流系统,灵长类部分胰岛的血液通过胰岛-胰岛型引流通道回流至邻近的小胰岛.结论胰岛具有完善联系外分泌腺泡的引流系统,提示含有高浓度胰岛内分泌激素的胰岛血液可能对外分泌腺泡的机能产生影响,胰岛引流系统的微血管的损伤以及胰岛-腺泡门脉循环中的胰岛素含量减少可能是糖尿病胰腺外分泌部病理损伤的基础.

人胰岛内分泌细胞分布特点及其与微血管相互关系的研究

采用双重免疫组织化学染色方法研究了成人胰岛内分泌细胞的分布特点及其与微血管的相互关系.结果发现:①成人胰岛为鞘型胰岛, B细胞位于胰岛中央,A、D细胞位于B细胞周围,形成鞘;②A、D细胞存在位置分布上的一致性;③即使由于有结缔组织隔将胰岛分隔成不同的"亚单位",其每一"亚单位"的周围部仍为A、D细胞,中央部仍为B细胞;④胰岛A、D细胞距微血管较近.这些研究结果将为进一步研究胰岛内分泌细胞间的功能联系提供形态学基础.

人胎胰岛B细胞体外增殖及其影响因素

糖尿病是世界疾病的第五大死因,胰岛细胞移植是可能治愈糖尿病的唯一有效方法.但胰岛细胞来源匮乏和移植后免疫排斥反应一直困扰着胰岛细胞移植的开展[1].解决此问题主要有两种方法:

GLP-1对大鼠胰岛氧化应激损伤的保护作用及机制研究

目的：观察GLP-1对H 2 O 2所致的胰岛β细胞氧化损伤的保护作用,探讨其抵抗氧化应激诱导的细胞凋亡作用机制。方法 Ficoll法分离纯化SD大鼠胰岛β细胞,实验分为正常对照组、H 2 O 2诱导胰岛损伤组、GLP-1预处理+H 2 O 2损伤组。采用FDA/PI染色法检测细胞存活,Annexin-V/PI流式细胞术检测细胞凋亡,荧光定量PCR检测氧化应激和细胞凋亡相关基因iNOX、SOD2、Caspase-3、Bcl-2表达,Western blot检测胰岛细胞Akt、P-Akt、Caspase-3蛋白表达。观察GLP-1预处理能否减少ROS诱导的胰岛β细胞凋亡,以及在此过程中PI3K/Akt信号通路的改变。结果经 H 2 O 2损伤后胰岛β细胞的增殖活性、存活率和胰岛素分泌能力显著降低,细胞凋亡率显著升高；iNOS、Caspase-3基因表达显著升高,SOD、Bcl-2基因表达显著降低；Akt蛋白磷酸化水平明显降低, Caspase-3活性明显升高。 GLP-1预处理可显著提高β细胞的增殖活性、存活率和胰岛素分泌能力,减少细胞凋亡；显著降低iNOS、Caspase-3基因表达,上调SOD基因表达；增强Akt磷酸化,减少活化Caspase-3水平。结论 GLP-1对H 2 O 2所致的大鼠胰岛氧化应激损伤具有一定的保护作用,其作用机制与增强Akt磷酸化及抑制凋亡信号分子活化相关。

腹腔神经丛阻滞对2型糖尿病Goto-Kakizaki大鼠胰岛的影响

目的 观察腹腔神经丛阻滞(NCPB)对2型糖尿病Goto-Kakizaki(GK)大鼠胰腺的影响.方法 25只2型糖尿病(T2DM)构模成功的雄性GK大鼠,随机抽取5只取胰腺组织(N0),以观测基础状况;再随机将20只GK大鼠分为对照组和实验组,每组10只.实验组给予0.5％利多卡因行NCPB,1 my(次·d),对照组以0.9％生理盐水替换.对照组和实验组分别于14次(N14)和28次(N28)NCPB后,各取5只GK大鼠,取胰腺组织.采用免疫组化和Western blot法检测各组胰腺组织中TNF-α、IL-1β水平和Bax、Bcl-2的蛋白表达.结果 HE染色和胰岛素免疫组化分析均可见对照组和实验组GK大鼠胰腺在N14、N28时病变持续加重,胰岛数及细胞数目减少,并可见被增生纤维组织分割包围的胰岛明显萎缩,但两组相比,实验组胰岛萎缩程度明显轻于对照组;在N14、N28时,对照组胰岛的TNF-α和IL-1β水平均有所升高,而实验组却明显下降,并显著低于对照组;实验组GK大鼠胰腺Bax蛋白表达水平在N14、N28时显著低于对照组(P＜0.01),Bcl-2蛋白表达显著高于对照组(P＜0.01),Bax/Bcl-2比值显著低于对照组(P＜0.01).结论 延缓T2DM模型GK大鼠胰岛的病理改变,可能是NCPB减轻糖耐量受损程度的机制之一.

2-吡啶羧酸铬对实验性糖尿病小鼠胰岛B细胞影响的免疫组织化学观察

应用免疫组织化学方法显示胰岛B细胞,观察了用2-吡啶羧酸铬处理实验性糖尿病小鼠3周后胰岛B细胞免疫组织化学变化.结果显示:2-吡啶羧酸铬对实验性糖尿病小鼠受损胰岛及B细胞形态结构具有明显的改善作用.

富铬酵母对实验性糖尿病小鼠胰岛影响的免疫组织化学观察

目的:采用HRP-SPA法研究了富铬酵母对实验性糖尿病小鼠胰岛及B细胞形态结构的影响.方法:将糖尿病小鼠随机分为3组:糖尿病对照组、实验Ⅰ组(富铬酵母250μg/kg·d)、实验Ⅱ组(富铬酵母125μg/kg·d),另设正常对照组,实验周期为4周.结果:实验动物胰岛内空虚部分明显缩小,B细胞及其颗粒增多,界限较清.结论:富铬酵母对实验性糖尿病小鼠受损胰岛及B细胞形态结构具有明显的改善作用.