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结核病DNA疫苗的现状与未来
1990年Wolff等[1]在一次基因治疗的实验研究中意外地发现不加任何处理的基因也可在骨骼肌细胞中表达蛋白至少2月,从而产生了核酸疫苗或基因疫苗、基因免疫、核酸免疫的全新概念,开创了免疫学和疫苗学的新领域.核酸疫苗包括DNA疫苗和RNA疫苗,由能引起机体保护性免疫反应的病原体抗原的编码基因和真核表达载体构建而成,它被注入机体后,通过宿主细胞的转录系统表达蛋白抗原,诱导宿主产生细胞免疫应答和体液免疫应答,从而达到预防和治疗疾病的目的.DNA疫苗可诱导全面的免疫反应,尤其是特异性CTL识别、杀伤、破坏被感染的细胞及清除细胞内的病原体,这对于清除寄生于巨噬细胞内的结核分支杆菌非常有意义.1996年以来WHO将结核病核酸疫苗研究列为资助的项目之一.本文概述了结核病DNA疫苗研究的现状,及其在结核病预防和治疗方面需进一步研究的问题和应用前景.
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双益方、组方中药及有效成分对骨骼肌及HepG2细胞胰岛素抵抗的影响
目的:研究双益方、组方中药及有效成分对骨骼肌细胞胰岛素抵抗模型葡萄糖消耗量及人肝癌HepG2细胞糖原合成,己糖激酶(hexokinase,HK),丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)活性的影响,初步探讨其作用机制,为其临床应用奠定基础.方法:采用高胰岛素方法建立骨骼肌细胞的胰岛素抵抗(IR)模型,观察双益方低、中、高剂量组、组方中药(黄芪、山茱萸、黄连、桑白皮、葛根、佩兰),有效成分(黄芪甲苷,毛蕊异黄酮葡萄糖苷,熊果酸,马钱苷,小檗碱,1-脱氧野尻霉素,葛根素)组(30,120,480 μg·L-1)对骨骼肌细胞胰岛素抵抗模型的葡萄糖消耗量的影响,蛋白质免疫印迹法(Western blot)测定骨骼肌细胞蛋白酪氨酸磷酸酶-1B(protein tyrosine phosphatase-1B,PTP-1B),葡萄糖转运蛋白4(glucosetransporters 4,GLUT4)表达;建立HepG2细胞的胰岛素抵抗模型,研究双益方、组方中药及其有效成分对HepG2细胞糖原合成及己糖激酶、丙酮酸激酶活性的影响.结果:双益方,黄芪,山茱萸,黄芪甲苷,1-脱氧野尻霉素,葛根素可降低骨骼肌细胞细胞上清液葡萄糖浓度(P＜0.05),以480μg·L-1双益方,黄芪甲苷组及葛根素组效果较好;与模型组比较,双益方、黄芪及有效成分组方可降低PTP-1B,提高GLUT-4的表达(P ＜0.05,P＜0.01).与正常组比较,模型组糖原合成量及HK,PK活性显著降低(P＜0.01);与模型组比较,各浓度组单味中药及有效成分均能一定程度的增加糖原合成量及HK,PK活性(P＜0.05,P＜0.01),其中黄芪甲苷、黄芪提取液增加糖原合成及提高HK活性作用较好;双益方提取液及葛根素增加PK活性作用较好.结论:双益方、组方中药及有效成分对骨骼肌,HepG2细胞胰岛素抵抗具有一定缓解作用,降低PTP-1B表达、提高GLUT4表达、增加糖原合成、提高HK,PK活性可能是其作用机制.
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热休克蛋白70对骨骼肌细胞系(C2C12)葡萄糖代谢的影响
目的 探讨高表达热休克蛋白70(HSP70)对骨骼肌细胞(C2C12)葡萄糖代谢的影响.方法 将C2C12细胞分为HSP70转染组与正常对照组.转染组细胞通过构建重组pTRE2hyg-HSP70质粒,稳定转染C2C12骨骼肌细胞系,使其高表达HSP70.待转染组及对照组细胞分化后3和7d,用葡萄糖氧化酶法检测葡萄糖的消耗,用3H-2-脱氧葡萄糖测定葡萄糖摄取能力,用生化仪检测乳酸的产生,用比色法测定磷酸果糖激酶(PFK),乳酸脱氢酶(LDH),己糖激酶(HK),丙酮酸激酶(PK)等葡萄糖酵解关键酶的活性及细胞内ATP水平,用Western blot检测细胞膜葡萄糖转运体4 (Glut4)的表达.结果 与对照组相比,在细胞分化后3和7d,过表达HSP70的C2C12细胞葡萄糖的消耗和乳酸的产生(P＜0.01),以及葡萄糖的摄取量都明显升高(P＜0.05);细胞磷酸果糖激酶(PFK),乳酸脱氢酶(LDH),己糖激酶(HK),丙酮酸激酶(PK)的活性及ATP的水平明显升高(P＜0.01);细胞膜Glut4的表达也明显升高(P＜0.05).结论 HSP70通过提高骨骼肌C2C12细胞膜Glut4的表达增加细胞对葡萄糖的摄取,并通过提高糖酵解关键酶的活性促进细胞的葡萄糖酵解.
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2型糖尿病是一种氧化还原性疾病
运动一直被认为是对于身体健康必不可少的.运动应激使骨骼肌细胞产生过氧化氢等活性氧,然而我们并不了解活性氧是如何延缓2型糖尿病、痴呆、心血管疾病及某些癌症的发生和发展的.近的研究发现,治疗2型糖尿病常用的药物二甲双胍(美福明)和运动似乎对其他几种疾病如癌症、阿尔茨海默病和心血管疾病等也有益,尽管目前还无法解释.
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人白介素-2基因在原代培养骨骼肌细胞中的表达研究
目的对以人白介素-2在原代培养骨骼肌细胞中的表达作为肿瘤基因治疗模式进行新的探索; 方法将人白介素-2 cDNA片段与CMV启动子及RSV启动子重组,通过Lipofectin介导将得到真核表达载体pCMV-IL2和pRSV-IL2转入原代培养的骨骼肌细胞,并用免疫组织化学方法观察白介素-2的表达; 结果 pCMV-IL2和pRSV-IL2经酶切鉴定正确,免疫组织化学观察到约有10%左右细胞表达了白介素-2cDNA; 结论不同启动子表达情况并无差别,质粒DNA为今后肿瘤基因治疗提供了新的途径.
关键词： 人白介素-2 骨骼肌细胞 脂质体介导的基因转移 -
绿色荧光蛋白在大鼠骨骼肌中的表达
目的研究绿色荧光蛋白(GFP)在哺乳动物细胞中的表达. 方法制备了含绿色荧光蛋白基因的重组DNA,经脂质体(lipofectin)法转染培养的大鼠骨骼肌细胞,用共聚焦显微镜观察GFP的表达. 结果大约20%～30%的骨骼肌细胞呈现不同强度的绿色荧光. 结论 GFP是研究活细胞生命现象的一种新途径.
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热打击对人骨骼肌细胞通透性、细胞骨架及细胞周期的影响
目的 研究热打击对培养人骨骼肌细胞(HSKMC)通透性、细胞骨架及细胞周期影响.方法 流式细胞仪钙离子内流检测热打击对HSKMC细胞膜通透性的影响,考马斯亮蓝R-250染色法检测热打击对HSKMC细胞骨架影响,流式细胞仪检测热打击对HSKMC细胞周期改变.结果 给予培养人HSKMC细胞不同温度梯度热打击1h后,43℃热打击组钙离子流式检测的中位数为91.63,37℃对照组中位数为22.98.同对照组相比,随着热打击程度加强,显微镜高倍镜下可见骨骼肌细胞骨架逐渐出现变粗、变短、出现明显的应力纤维.骨骼肌细胞在热打击情况下,各组G0/G1期DNA含量在44.13～62.98之间,与正常对照组对比,当细胞离开热打击环境后培养18 h前G0/G1期DNA含量明显高于对照组,培养第18小时恢复才同对照组基本相同.结论 热打击的情况下造成细胞钙离子内流效应,导致细胞内钙超载.可改变HSKMC骨架结构,使骨架失去正常的网状有序排列结构,间隙增大.细胞周期出现阻滞,细胞被阻滞在G0/G1期.
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碳酸镧诱导人骨骼肌细胞胰岛素抵抗模型构建
目的 探讨碳酸镧处理人骨骼肌细胞能够否建立骨骼肌细胞胰岛素抵抗模型.方法 将配制好的成人骨骼肌细胞细胞直接在培养基中进行培养,培养基样板为96孔.将细胞分为对照组、胰岛素组和碳酸镧组,后两组分别添加不同浓度的胰岛素(5 ×10-7μmol/L、1×10-7μmol/L)和碳酸镧(5μmol/L、10μmol/L、100μmol/L、1 000 μmoL/L).培养6h、12h、24 h、36 h后,使用葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖浓度.结果 培养24 h后,10 μmol/L、100 μmol/L、1 000 μmol/L碳酸镧组及5×10-7 μmol/L胰岛素组中,葡萄糖含量与对照组细胞相比均有不同程度的增加(P＜0.05).在100 μmol/L、1 000 μmol/L的碳酸镧培养基中培养的时间达到6h后,胰岛素将会对溶液中葡萄糖的浓度产生较大的影响.结论 碳酸镧处理骨骼肌细胞能够引发胰岛素抵抗,可为研究转胰岛素抵抗发病机制和药物筛选提供新的骨骼肌细胞胰岛素抵抗模型.
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转基因的骨骼肌细胞及其在Ⅰ型糖尿病治疗中的应用
骨骼肌成肌细胞已经成为转基因治疗的一种重要的靶细胞,关于这方面的研究越来越多.在治疗Ⅰ型糖尿病方面,面临的问题包括:体外培养骨骼肌细胞的增殖、分化、融合,高效率的基因转染载体、转移基因长期可控性表达等.本文主要对前两部分问题作一简单综述.
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葡萄糖运载体4
胰岛素抵抗是2型糖尿病患者糖利用障碍的主要原因之一.研究发现胰岛素受体后缺陷在胰岛素抵抗的环节中,意义尤为突出,其中外周组织,主要是骨骼肌和脂肪组织对葡萄糖摄取、利用减少是受体后胰岛素抵抗的主要原因.而葡萄糖的跨膜转运是骨骼肌细胞利用葡萄糖的主要限速步骤.目前研究表明,这一过程是依靠细胞膜上的特殊转运蛋白来完成的,这种特殊转运蛋白称为葡萄糖运载体(glucose transporter, GLUT).骨骼肌细胞中存在两种GLUT,分别为GLUT1和GLUT4,前者主要位于骨骼肌细胞外膜上,只在基础状态下参与细胞对葡萄糖的摄取和转运;而后者在基础状态下主要位于细胞内微粒体和某些特定的囊泡等各种内膜结构上,对胰岛素和收缩刺激敏感,是骨骼肌细胞主要的GLUT[1].因此,GLUT4对葡萄糖的转运在机体糖代谢中占有重要地位,并且GLUT4的研究对糖尿病的运动疗法与康复方案的制定具有重要意义.
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骨骼肌再生和骨骼肌肌卫星细胞相关研究的进展
在我们的日常生活和体育锻炼中,发生肌肉损伤不可避免,肌肉发生损伤以后,需要经历修复和再生的过程.而对骨骼肌的修复和再生的发生、发展、转归的研究在骨骼肌损伤后的治疗和康复领域有很重要的临床和现实意义.但以往组织病理学的观点认为,人体成熟的骨骼肌细胞属于终末分化细胞,已经不再具有分裂和再生的能力,一旦因为某种原因遭受破坏,就会成为永久性的功能和组织的缺失,被纤维化的瘢痕组织所代替,不再具有收缩能力,使其运动能力减弱或丧失.这种观点一直影响着后来的医学和体育工作者.Carlson在1973年发表了一篇综述,其中对当时有关骨骼肌再生的文献进行了综述报道[1].从那以后,人们对骨骼肌再生的关注程度逐渐提高,有关的研究逐渐增多,很多文章对骨骼肌损伤后再生的病理学以及形态学的变化有所报道,但有关再生过程的机制还没有明确指出.
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运动对葡萄糖转运蛋白4介导的骨骼肌糖摄取调节机制的研究进展
葡萄糖转运蛋白4(glucose transporter 4,Glut 4)是骨骼肌细胞中主要的葡萄糖转运载体[1],它所介导的葡萄糖转运是骨骼肌糖代谢的主要限速步骤[2].大量研究发现,Glut 4的紊乱将导致骨骼肌对葡萄糖的摄取、利用减少,而骨骼肌是全身葡萄糖利用主要的组织,约占整个葡萄糖转运的80%.
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骨骼肌细胞葡萄糖运载体4的研究进展
骨骼肌是体内主要摄取葡萄糖和代谢葡萄糖的组织之一.葡萄糖跨膜转运是骨骼肌利用葡萄糖的首要步骤.葡萄糖跨膜进入骨骼肌细胞需要细胞膜上的葡萄糖运载体(glucose transporter,GLUT)协助扩散.GLUT有多种亚型,其中葡萄糖运载体4(GLUT4)是存在于骨骼肌、脂肪组织中帮助葡萄糖转运的蛋白.胰岛素和肌肉收缩可通过不同的机制调节GLUT4的基因表达和转位[1],从而促进葡萄糖的跨膜转运.因此,GLUT4是糖尿病基础研究中的一个热点.
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脂肪酸对牛骨骼肌卫星细胞分化的影响
目的：近年来,脂肪酸对细胞分化的影响作用一直受到广泛关注。研究发现,脂肪酸可以通过调节过氧化物酶体增殖激活受体( PPAR)或其他转录因子而调控组织分化。单不饱和脂肪酸亚油酸( LA)和油酸( OA)在促进骨胳肌细胞的增殖和分化过程中具有重要作用。多不饱和脂肪酸如花生四烯酸( AA)和二十二碳六烯酸( DHA)还可以通过改变细胞膜的脂质分布,从而促进大鼠成肌细胞的分化。然而,脂肪酸是否能够影响牛骨骼肌细胞的发育,以及脂肪酸的摄取与骨骼肌卫星细胞分化的关系,仍不清楚。方法：本研究通过向牛骨骼肌卫星细胞( muscle-derived satellite cells,MDSCs)培养体系中添加三种不同的脂肪酸(棕榈酸PA、油酸OA和二十二碳六烯酸DHA ),以探讨不同脂肪酸对牛骨骼肌卫星细胞分化的影响。结果：PA、OA和DHA作用浓度均为50 umol/L,以2%马血清为对照,诱导分化牛骨骼肌卫星细胞。分化96h后分别收集细胞,采用免疫荧光染色,实时定量PCR和Western blot技术检测细胞分化过程中相关的标志性基因MyoG( Myogenin)和MyHC( Myosin Heavy Chian)的表达变化进而探讨脂肪酸对体外培养的牛骨骼肌卫星细胞分化程度的影响；此外,通过荧光定量RT-PCR法检测脂肪酸代谢途径中关键基因CPT2( Carnitine palmi-toyltransferase 2,肉碱棕榈酰转移酶Ⅱ)、DGAT2( Diacylglycerol acyltransferase 2,二酰甘油酰基转移酶Ⅱ)和ELOVL3(Fatty acid elongase 3,脂肪酸链延长酶III)的表达变化,进而探讨脂肪酸摄取对骨骼肌卫星细胞脂肪酸代谢的影响。实验结果显示,PA、OA和DHA处理的牛骨胳肌卫星细胞能够促进肌卫星细胞的分化。3种脂肪酸处理的细胞中脂肪酸代谢中的关键基因CPT2、DGAT2和ELOVL3的表达量显著增加。结论：脂肪酸( PA、OA、DHA)能够促进牛骨骼肌卫星细胞的分化,从而为探明肌肉发育和分化的分子机制提供帮助。
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miR-1与肿瘤
MicroRNAs (miRNAs)是近年来发现于真核细胞中的一类长21～22个核苷酸的内源性非编码小RNA分子,它们由相应的基因编码,转录后通过一系列加工过程,形成成熟的miRNA分子.成熟的miRNA通过与靶mRNA的3'非编码区(3UTR)结合,抑制mRNA的翻译或影响mRNA的稳定性,从而调节基因表达,在个体发育、细胞增殖、凋亡和肿瘤发生等过程中发挥了重要的调控作用[1].据估计,30％的人类基因受到miRNAs调控,这也表明miRNAs可能影响所有的信号途径[2].其中,miR-1存在于大多数动物种系,特异性表达于心肌和骨骼肌细胞,通过作用于组蛋白去乙酰化酶4(HDAC4)而促进成肌细胞分化,抑制细胞扩增,近年来研究发现其与肿瘤发生发展也密切相关,本文将就上述问题进行系统阐述.
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不同浓度葡萄糖和游离脂肪酸对大鼠骨骼肌细胞株L6细胞胰岛素敏感性和细胞内活性氧的影响
目的:研究不同浓度的葡萄糖和游离脂肪酸(FFA)对骨骼肌L6细胞胰岛素敏感性及细胞内活性氧(ROS)的影响.方法:L6细胞诱导分化成熟后,分为6组,以5mmol/L葡萄糖为低糖对照组,其中加0.3或1mmol/L的混合FFA为低糖低FFA或低糖高FFA组.以25mmol/L葡萄糖为高糖对照组,其中加0.3和1mmol/L的FFA的培养基为高糖低FFA或高糖高FFA组.干预48h,3H-D-葡萄糖摄取实验(加与不加100nmol/L胰岛素37℃30min)验证L6细胞胰岛素敏感性,经荧光探针H2DCFDA观察细胞内ROS含量的变化.结果:在5mmol/L葡萄糖组,低糖对照组基础摄糖值为22777.6±6608.7,低糖低FFA组为26027.5±4085.7,低糖高FFA组为146805.1±21099.4.胰岛素刺激后,低糖对照组为76586.5±18450.1.低糖低FFA组为43738±9203.6,低糖高FFA组为32050.6±3362.3,较低糖对照组显著降低(P<0.01).在25mmol/L葡萄糖组,基础葡萄糖摄取量为11793.8±551.4,高糖低FFA组11887.3土2082.3高糖高FFA组为13886.1土3872.9,差别无统计学意义(P>0.05),但较低糖对照组显著降低(P<0.01);加入胰岛素刺激后,高糖对照组为42798.8±9441.5.高糖低FFA组为23946.9±3839.6,高糖高FFA组为13886.1±3872.9,各组之间差别显著(P<0.01).对细胞内ROS的研究发现,低糖低FFA组为2234.2±477.2.低糖高FFA组为1969.0±480.9.高糖对照组为1969.0±229.4,高糖低FFA组为2184.5±734.2,高糖高FFA组为2571.3±96.7.可以显著增加的L6细胞内ROS,与低糖对照组(615.3±244.3)相比差别显著(P<0.01).除对照组之外的各组之间差别无统计学意义(P>0.05).结论:高糖和高FFA可以诱导L6细胞出现氧化应激,同时高糖和高FFA是导致骨骼肌细胞胰岛素抵抗的重要原因之一.
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线粒体融合蛋白2改善高脂诱导的骨骼肌细胞胰岛素抵抗机制的研究
目的 探讨线粒体融合蛋白2 (Mfn2)是否通过减轻氧化应激改善大鼠骨骼肌细胞IR.方法 建立高脂诱导骨骼肌细胞IR模型(PA组),以Mfn2基因重组腺病毒转染细胞(PMfn2组),观察细胞内葡萄糖摄取率、超氧化物歧化酶总活力(T-SOD)、过氧化氢酶(CAT)、活性氧簇(ROS)及MDA的改变. 结果 (1)与正常对照(NC)组相比,高脂(PA)组葡萄糖摄取率降低(P＜0.01),T-SOD及CAT活性降低,ROS、MDA含量增加(P＜0.05);(2)与PA组相比,Mfn2基因重组腺病毒转染(PMfn2)组T-SOD及CAT活力均增加(P＜0.05);ROS水平、MDA含量降低(P＜0.05);GSH-Px活力无明显改变. 结论 上调高脂干预后骨骼肌细胞的Mfn2水平可减轻细胞氧化应激,改善IR.
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运动对胰岛素刺激的老年雌性鼠骨骼肌细胞葡萄糖转运因子4转位的影响
我们应用老年小鼠模型制备完整的骨骼肌束,研究运动对胰岛素刺激的骨骼肌细胞葡萄糖转运因子4(Glucose transporter 4,GLUT4)转位的影响,探讨运动改善骨骼肌细胞对胰岛素敏感性和减少骨骼肌细胞胰岛素抵抗(IR)的机制.
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骨髓间充质干细胞在心血管疾病治疗中的应用
间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSCs)是中胚层来源的具有多向分化能力的干细胞,主要存在于全身结缔组织和器官间质中,以骨髓组织中含量为丰富,在一定的诱导条件下能分化为成骨细胞、成软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、内皮细胞、神经细胞、骨骼肌细胞及心肌细胞[1-8].由于不同的文献对其有不同的命名,即集落形成单位成纤维细胞(CFU-F)、骨髓基质成纤维细胞(MSF)、骨髓基质细胞(MSC)、间充质干细胞(MSC)或间充质祖细胞(MPC).由于骨髓是其主要来源,因此统称为骨髓MSCs,并仅就其生物学特征、多向分化潜能及在心血管疾病治疗中的研究进展作一综述.
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固醇调节元件结合蛋白1c对骨骼肌细胞胰岛素受体底物1表达调控的影响
目的 探讨固醇调节元件结合蛋白1c(SREBP-1c)对大鼠骨骼肌细胞胰岛素受体底物1(IRS-1)表达调控的影响.方法 采用酶联合消化法取2～3 d SPF级雄性SD大鼠原代骨骼肌细胞,将原代细胞分为对照组(C)、对照+胰岛素组(C+I)、高脂组(PA)及高脂+胰岛素组(PA+I).将表达SREBP-1c腺病毒转染L6细胞,根据感染复数(MOI)分为含绿色荧光蛋白阴性载体(GFP)组、MOI值为5、50、100、200组.将靶基因为SREBP-1c的干扰RNA (siRNA)转染L6细胞,并分为空白对照组、阴性siRNA组及SREBP-1c siRNA组.Western blotting和实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测SREBP-1c、IRS-1、蛋白激酶B(Akt)基因及蛋白表达,油红O染色法检测细胞内脂质沉积情况.多组资料比较采用方差分析,两两比较采用小显著差异法.结果 与C组相比,PA组SREBP-1c基因和蛋白水平升高(分别为2.72±0.08比1.00±0.18,3.02 ±0.19比1.00±0.05,t=15.240、18.289,均P＜0.05),IRS-1基因和蛋白水平降低(分别为0.71 ±0.04比1.00 ±0.05,0.82 ±0.04比1.00±0.04,t=-7.960、-6.052,均P＜0.05),丝氨酸磷酸化IRS-1蛋白表达升高,丝氨酸磷酸化Akt(p-Akt)蛋白表达下降(t=20.987、-5.869,均P＜0.05).与GFP组相比,MOI值为50、100和200组的SREBP-1c基因和蛋白表达呈剂量依赖性上升(均P＜0.05),IRS-1基因和蛋白表达水平呈剂量依赖性下降(均P＜0.05).与空白对照组和阴性siRNA组相比,SREBP-1c siRNA组SREBP-1c基因和蛋白水平降低,IRS-1蛋白表达升高(均P＜0.05).结论 SREBP-1c可抑制骨骼肌IRS-1胰岛素信号通路,参与肌细胞胰岛素抵抗的发生.
关键词： 固醇调节元件结合蛋白1C 胰岛素受体底物1 胰岛素抵抗 骨骼肌细胞
