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果蝇S2细胞中高表达荧光素酶重组质粒的构建及活性测定
目的:构建果蝇S2细胞中高表达荧光素酶的重组质粒.方法:用PCR方法扩增得到pac启动子的基因片段,经酶切亚克隆至pGL3 -Basic的真核表达载体中,转染果蝇S2细胞,通过测定荧光素酶和β-半乳糖苷酶的活性计算荧光素酶的相对活性.结果:构建的重组质粒在S2细胞中荧光素酶的相对活性较pGL3 -Control中增加了2.7万倍.结论:成功构建了果蝇S2细胞中高表达荧光素酶的重组质粒pGL3 -pac.
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含hNIS报告基因的乏氧调控重组质粒的构建及其功能鉴定
目的 构建乏氧应答启动子调控的人钠／碘共同转运体(hNIS)报告基因重组质粒,为实体瘤微环境乏氧的实时监测提供研究基础.方法 合成乏氧反应元件(HRE)的核苷酸片段,克隆入pGL3-promoter,构建为pGL3promoter-5×HRE载体.然后将扩增的hNIS基因插入pGL3-promoter-5×HRE载体中,构建为pGL3-promoter-5×HRE-NIS重组质粒并进行测序验证.以DMSO处理组作为对照,CoC12处理HEK293细胞模拟乏氧；将经验证的pShuttle-NIS质粒转染HEK293乏氧细胞,同时将构建的pcDNA3.1-HIF-1α质粒和pShuttle-NIS质粒按照3:1比例转染HEK293细胞,转染空质粒pcDNA3.1和pShuttle-NIS质粒组作为对照.通过qRT-PCR法检测hNIS基因表达的变化.并用高锝酸盐( 99mTcO4-)处理双质粒共转染的HEK293细胞,洗脱游离99m TcO4-后通过γ计数器采集细胞放射性计数,检测所表达NIS蛋白的功能.结果 克隆的基因产物与预期一致,序列无碱基的突变.共转染HIF-1α质粒组及转染pShuttle-NIS的CoC12处理组,其hNIS mRNA的表达量显著高于转染空质粒及DMSO处理组(均P＜0.01).共转染HIF-1α质粒组细胞的99mTcO4-摄取率显著高于空质粒对照组(P＜0.01).结论 pGL3-promoter-5×HRE-NIS重组质粒转染后能介导细胞摄取99mTcO4-,为微环境细胞乏氧的核素显像提供实验依据.
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逆转录病毒载体介导的标志基因转移研究
目的:为建立高效、安全的逆转录病毒介导的基因标记系统.方法:用脂质体方法将含有标志基因NeoR的逆转录病毒载体LXSN导入包装细胞PA317;通过与单向型包装细胞GPE86相互转导,获得高滴度的双嗜型产病毒细胞,并以其对人类白血病细胞进行基因标记.结果:脂质体转染法获得的病毒滴度约为2.0×105CFU/ml,而与GP+E86细胞转导后可提高至2.8×106CFU/ml;重组病毒转导白血病细胞(HL-60,K562,KG-1)后,聚合酶链反应(PCR)证实NeoR基因整合到靶细胞基因组,巢式PCR与补救分析均未能检测到辅助病毒.结论:"乒乓效应"可显著提高逆转录病毒滴度,而逆转录病毒介导的基因标记系统是安全的.
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稳定沉默TRB3细胞模型及TRB3启动子报告基因的建立
构建人TRB3基因的shRNA真核表达载体和稳定沉默TRB3的人结肠癌细胞系HCT-8,构建TRB3启动子区的荧光素酶报告基因,为以TRB3为靶点的药物研究提供有效的筛选平台.针对TRB3的mRNA设计雾核苷酸序列,构建TRB3-shRNA表达载体和control-shRNA阴性对照载体,宿主菌扩增,并测序鉴定.测序正确的重组质粒转染HCT-8细胞,以潮霉素筛选,分别建立稳定表达TRB3-shRNA和control-shRNA的HCT-8细胞系.通过细胞划痕-修复实验检测细胞的迁移能力.同时,通过克隆、酶切、连接、转化和扩增,构建TRB3启动子区的荧光素酶报告基因pTRB3-Luc,转染HEK293ET细胞并给予衣霉素刺激,检测荧光素酶报告基因的活性.经测序证实,TRB3-shRNA真核表达载体构建成功,插入的DNA片段与设计序列完全一致.在建立的稳定表达TRB3-shRNA的HCT-8细胞中,TRB3的mRNA和蛋白表达水平都显著下降,细胞的迁移能力显著降低.同时,TRB3启动子区荧光素酶报告基因pTRB3-Luc构建成功,并在衣霉素诱导下呈现剂量依赖性的活性增强.TRB3-shRNA重组质粒、稳定沉默TRB3的HCT-8细胞系和TRB3启动子报告基因的建立为进一步研究TRB3在肿瘤发生发展过程中的作用以及TRB3抑制剂的筛选提供了有力的工具.
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以绿色荧光蛋白为标志研究对肿瘤细胞的基因转移
目的建立以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)示踪肿瘤细胞的方法.方法用编码EGFP的逆转录病毒分别转导人白血病细胞K 562、乳腺癌细胞MCF7和膀胱癌细胞5637,G418选择获得EGFP标记的肿瘤细胞.EGFP基因的整合与表达分别用聚合酶链反应(PCR)、流式细胞术(FCM )及荧光显微镜分析.结果 EGFP 病毒转导的3种肿瘤细胞内均有EGFP基因和NeoR基因的整合;与对照细胞相比,E GFP病毒转导可使EGFP阳性细胞的比例提高到85.5%～90.0%.结论携带 EGFP基因的逆转录病毒载体能在肿瘤细胞稳定表达,可用于研究肿瘤细胞的生长、转移和血管生成.
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报告基因信号扩增方法的研究进展
磁共振(MR)分子成像技术大的缺点是对信号探测的敏感性较低,合适的信号扩增方法是非常重要的.现对磁共振分子影像中报告基因信号扩增策略作一综述.
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核心结合因子α1对牙本质涎磷蛋白基因启动子不同片段启动活性的影响
目的:观察核心结合因子α1(cbfα1)对牙本质涎磷蛋白(DSPP)基因启动子不同片段启动活性的影响. 方法:选择小鼠成牙本质细胞样细胞MDPC-23为实验细胞,利用含DSPP基因启动子不同片段的真核表达载体,采用报告基因方法观察cbfα1对DSPP基因启动子不同片段启动活性的影响. 结果:在MDPC-23细胞中,pcDNA3-cbfα1共转染组相对于pcDNA3共转染组,Pgl3-Enhancer-1 (-4 496～-3 499 bp)、Pgl3-Enhancer-2 (-3 519～-2 515 bp)、Pgl3-Enhancer-2-3、Pgl3-Enhancer-95 (-95～54 bp) 活性增强(P<0.05);Pgl3-Enhancer-1-3、Pgl3-Enhancer-2.6 K (-2 475～53 bp) 活性降低(P<0.05). 结论:cbfα1可以调控DSPP基因的表达,cbfα1对DSPP基因启动子不同片段的启动活性有不同的调节作用.
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人Bax启动子荧光素酶报告基因的构建和鉴定
[目的]克隆人Bax基因的启动子,插入荧光素酶报告基因载体中,并在细胞内检测其活件.[方法]采用PCR技术从人HepG2细胞中扩增出Bax启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,经测序确定所扩增的DNA序列,并将其转染入H1299细胞中检测其活性.[结果]测序结果表明扩增的Bax启动子序列正确,双报告基因实验检测荧光素酶活力表明构建的报告基因具有启动子活性.[结论]克隆了Bax启动子,成功构建了人Bax启动子报告基因,为p53家族凋亡通路的功能研究提供了必要的实验材料.
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熊果酸和粉防己碱对肿瘤相关信号通路的互补抑制及其协同抗肿瘤增殖作用研究
[目的]通过分析中药活性成分对肿瘤相关的多条信号通路抑制作用的差异,研究对信号通路抑制作用存在互补现象的两个化合物熊果酸(ur-solic acid,UA)和粉防己碱(tetrandrine,Tet)协同抗肿瘤增殖的作用及其优配比.[方法]运用多信号通路报告基因技术,研究5个具有抗肿瘤活性的化合物千金藤碱(cepharanthine,Cep)、Tet、18α-甘草酸(18α-glycyrrhetinic acid,18α-Gly)、UA、木犀草素(luteolin,Lut)对肿瘤相关的MAPK/ERK、MAPK/JNK、NF-κB、Wnt、Notch、Cell Cycle、Myc/Max以及Hypoxia信号通路活化程度的影响;采用MTT法和结晶紫法研究由Cep、Tet、18α-Gly、UA、Lut组成的15个不同化合物组合对人肿瘤细胞MDA-MB-231、SW480、MG63、PC3、DU145、HCT116、143B、MDA-MB-468的抗增殖作用;运用两药相互作用指数(coefficient of drug interaction,CDI)法筛选存在协同增效作用的化合物组合;采用等效线法和合用指数(combination index,CI)法筛选该组合协同抗肿瘤细胞增殖的优配比.[结果]信号通路报告基因实验发现化合物组合UA+Tet对与肿瘤相关的8条信号通路活化的抑制作用存在互补,提示UA和Tet之间可能具有协同抗肿瘤细胞增殖作用.CDI法验证后发现UA和Tet具有协同抗肿瘤细胞增殖作用.等效线法、CI法分析得出UA与Tet佳浓度比为9:1.[结论]UA、Tet对8条肿瘤相关信号通路具有抑制互补作用,用MTT、结晶紫等不同方法证实二者协同抗增殖作用,并筛选出UA和Tet的优配比,这为研发抗癌复方提供了新的思路.
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千金藤素对人结肠癌细胞HCT116裸鼠异体移植肿瘤模型肿瘤增殖的影响及机制初探
[目的]通过实验研究观察千金藤素（Cepharanthine，CEP）对人结肠癌的抗增殖作用。[方法]本研究通过活体荧光示踪技术研究CEP对人结肠癌细胞HCT116裸鼠异体移植肿瘤模型的抗结肠癌作用，运用报告基因技术研究CEP对肿瘤相关的8条信号通路活化程度的影响，采用流式细胞仪测定CEP对细胞周期分布的影响。[结果]CEP体外能抑制多种人源肿瘤细胞的增殖，IC50范围为0.8-11.5μM。CEP能使HCT116细胞的S期和G2/M期百分比明显增加。通过对MAPK/ERK、MAPK/JNK、Wnt、Notch、Cel Cycle/pRb-E2F、NFκB、Myc/Max以及Hypoxia等8条信号通路报告基因活化程度的研究，发现CEP主要通过抑制MAPK/ERK和NFκB信号通路起到抑制肿瘤增殖的作用。动物模型的实验结果显示，CEP能抑制肿瘤增殖，促进肿瘤组织坏死。[结论]CEP通过抑制MAPK/ERK和NFκB信号通路的活化抑制人结肠癌细胞HCT116裸鼠异体移植肿瘤的增殖。
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健心方防治心力衰竭分子机理研究
[目的]探讨了健心方药物血清对于心肌细胞NF-kB活性的影响,阐明健心方保护心肌的作用机理.[方法]采用荧光素酶报告基因方法检测H2O2处理心肌细胞NF-kB活性的改变及丹参酮对损伤后心肌细胞NF-kB活性的影响.[结果]荧光素酶报告基因检测结果表明H2O2可明显增强心肌细胞NF-kB活性(P＜0.05),而健心方药物血清可抑制这种激活作用(P＜0.05);大小剂量的药物血清均可拮抗H2O2对心肌细胞的损伤作用(P＞0.05).[结论]心肌细胞损伤后NF-kB的激活是CHF发生发展中的重要过程,健心方可拮抗这种激活作用;健心方的心肌保护作用是通过对异常增高的NF-kB活性的拮抗产生的.
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葶苈子雌激素样活性筛选及其作用机制研究
目的 筛选葶苈子水提物(Semen Descurainiae aqueous extracts,SD-ae)的雌激素样活性,确定其有效化学拆分组分,并研究其雌激素样作用机制.方法 用动物实验即子宫增重实验和细胞实验即E-SCREEN实验筛选SD-ae及其化学拆分组分的雌激素样活性;雌激素受体拮抗剂 ICI182,780干预阻断实验检测其雌激素样作用途径;以雌激素反应元件(ERE)与报告基因荧光素酶(luciferase,Luc)构建报告基因载体,与ERα、ERβ表达载体以阳离子脂质体转染法共同转入HEK293细胞中,以标准化Luc活性来评价其雌激素样作用的信号通路;实时荧光定量PCR检测雌激素受体 ERα、ERβ及雌激素效应基因PR mRNA的表达.结果 与正常组相比,SD-ae高、低剂量组均可明显提高小鼠的子宫系数(P<0.05),且葶苈子低聚糖拆分组分(SD-ae-Oli)和多糖拆分组分(SD-ae-Pol)也能明显提高小鼠的子宫系数( P<0.01或P<0.05);SD-ae、SD-ae-Oli、SD-ae-Pol对MCF-7细胞有明显的促增殖作用(P<0.01或P<0.05),ICI182,780干预可阻断其促增殖作用;报告基因结果表明,SD-ae、SD-ae-Oli和SD-ae-Pol分别经ERβ诱导时,其标准化Luc活性都明显高于正常组(P<0.01);且与正常组相比,SD-ae可明显促进小鼠子宫ERβ mRNA的表达(P<0.01),但对于ERα、PR mR-NA的表达无影响.结论 SD-ae具有雌激素样活性,其有效雌激素样化学拆分组分是SD-ae-Oli和SD-ae-Pol,且SD-ae、SD-ae-Oli、SD-ae-Pol都是通过ERβ发挥雌激素样作用.SD-ae在体内发挥雌激素样作用的分子机制可能与促进ERβ mRNA的表达有关.
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人参皂苷Rc、Re、Rf 和Rg1对药物代谢酶CYP1 A1活性诱导作用研究
目的研究人参皂苷Rc、Re、Rf和Rg1能否激活hAhR受体信号通路诱导CYP1A1基因及蛋白表达。方法利用前期实验室构建的 pGL4．17-CYP1A1报告基因质粒、pcD-NA3．1-hAhR表达质粒与pRL-TK内参质粒共转染HepG2细胞，检测人参皂苷Rc、Re、Rf和Rg1对AhR的转录激活效应；并利用 Real-time PCR 及 Western blot 技术对人参皂苷Rc、Re、Rf和Rg1的不同浓度、不同时间处理组进行mRNA及蛋白的检测。结果报告基因模型检测结果显示，人参皂苷Rc、Re、Rf和Rg1对AhR具有转录激活作用，其中人参皂苷Re与Rf对AhR转录激活效应明显；同时不同浓度人参皂苷Rc、Re、Rf和Rg1均能上调CYP1A1 mRNA与蛋白表达水平。结论人参皂苷Rc、Re、Rf和Rg1可以诱导CYP1A1 mRNA与蛋白质水平的表达，这种诱导作用可能与上述皂苷成分激活AhR并提高其对CYP1A1的转录活性有关。
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黄芩素激活核转录因子Nrf2拮抗肝毒性的研究
目的：研究黄芩素( Baicalein, BAI )对核转录因子Nuclear factor erythroid 2-related factor 2(Nrf2)的转录激活,以及对四氯化碳( carbon tetrachloride, CCl4)、乙醇( etha-nol)和对乙酰氨基酚( acetaminophen, APAP)诱导的人正常肝L-02细胞毒性的拮抗作用。方法在肝L-02细胞中,采用瞬时转染报告基因实验检测不同浓度黄芩素对Nrf2转录激活的影响。在 L-02细胞上分别用 APAP (10 mmol · L-1)、CCl4(10 mmol·L-1)、Ethanol (100 mmol·L-1)诱导肝细胞毒性。黄芩素1、10、25、50、100μmol · L-1分别与细胞预孵15 min后,加入上述肝毒性物质,48 h后采用MTT法检测细胞存活率。结果与对照组比较,黄芩素(25、50μmol·L-1)能明显提高 Nrf2的转录激活(P <0．01,P <0．05)。与对照组比较,3种肝毒性物质均能明显降低细胞存活率(P <0．01),而黄芩素能剂量依赖性地提高给予APAP、CCl4和 Ethanol 后降低的 L-02细胞存活率( P <0．01)。结论黄芩素可以诱导重要的抗氧化核转录因子Nrf2的转录激活,这可能是黄芩素拮抗外源性肝毒性物质APAP、CCl4和Ethanol诱导的L-02肝细胞毒性的机制之一。
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基于Nrf2-ARE通路的抗辐射有效活性成分筛选研究
目的 建立基于Nrf2-ARE通路的报告基因筛选模型,筛选抗辐射复方四物汤加味方中的活性成分.方法 将抗氧化反应元件插入萤火虫荧光素酶载体pGL4.26,构建重组质粒pGL4-ARE,与海肾荧光素酶载体pRL-TK共同转染HEK-293细胞,检测四物汤加味方中刺五加皂苷E、金丝桃苷、五味子乙素等12个主要的化学成分对Nrf2-ARE通路的激活作用.结果 在四物汤加味方中,白藜芦醇(50 μmol·L-1以上)和金丝桃苷(100 μmol·L-1以上)的抗氧化活性强,与空白对照组比较差异有显著性(P<0.01);红景天苷也有较好的效果,500 μmol·L-1以上可提高诱导表达倍数(P<0.01 ).结论 白藜芦醇、金丝桃苷、红景天苷是四物汤加味方中的主要抗氧化活性成分.
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山酮类化合物抑制人脑胶质瘤细胞增殖活性及作用机制探讨
目的 检测3种山酮类化合物对人脑肿瘤细胞(T-98、U251SP和KT)增殖的抑制作用,并进一步探讨其可能的作用机制.方法 研究从3种微生物次生代谢产物中纯化的山酮类化合物对人脑肿瘤细胞增殖的抑制作用.MTT比色法检测细胞增殖抑制率;利用双荧光素酶报告基因检测系统检测p53和Bax报告基因的表达;采用Western blot分析与凋亡相关的蛋白表达变化.结果 Austocystin H对KT细胞的增殖显示极强的抑制活性,呈剂量依赖性,IC50仅为0.69 μmol·L-1;Austocystin H可诱导KT细胞内Bax报告基因表达(P<0.01);Western blot分析结果显示由Austocystin H处理的KT细胞中的p53和Bax的表达与对照组相比增加(P<0.05).结论 Austocystin H具有极强的抑制人脑肿瘤细胞增殖作用,其作用机制可能与其诱导肿瘤细胞凋亡有关.
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E0703对雌激素受体(ER)不同亚型的选择性激活作用
目的 探讨E0703(雌二醇衍生物)对雌激素受体不同亚型(α和β)的选择性激活作用.方法 将报告基因质粒pTAL-SEAP-ERE和校正质粒pSV-β-gal共转染已稳定转染了雌激素受体α/β的人胚肾细胞(HEK293),加入E0703进行报告基因的诱导表达.采用EMSA试验观察E0703对ERα与雌激素反应元件(ERE)的结合增强作用.结果 E0703对ERα具有较强的激活作用(低激活浓度为10-8 mol·L-1),激活强度略低于E2;E0703在10-10、10-9、10-8、10-7 mol·L-1浓度下对ERβ没有激活作用;EMSA试验证明,E0703能够增强ERα与雌激素反应元件的结合增强作用.结论 E0703对雌激素受体α具有选择性激活作用.
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基于报告基因和干扰素-α信号通路的药物筛选模型的建立
目的建立基于报告基因和干扰素-α(Interferon-α)信号通路的药物筛选模型,用于筛选具有IFN-α样活性的小分子化合物.方法构建带有ISRE(IFN-α stimulated response element)靶序列和报告基因的诱导性表达载体,并将其转染入血管内皮细胞(ECV304)中,筛选报告基因碱性磷酸酶(SEAP)表达受IFN-α诱导的阳性克隆.选取相关的细胞因子干扰素-β、干扰素-γ和生长因子甲状旁腺素(PTH)进行模型特异性考察.结果 ECV304细胞中SEAP的表达受IFN-α的诱导并呈现剂量依赖关系,IFN-α的高诱导表达率是IFN-β高诱导表达率的9.0倍、IFN-γ的8.8倍、PTH的9.1倍,具有相对特异性.IFN-α对ECV304细胞无增殖作用.本方法的Z'-因子为0.8,说明此模型具有很好的稳定性.结论本模型的SEAP基因表达水平能够被其特异性配体强诱导表达,利用此模型在96孔板上用化学发光法测定SEAP基因的诱导表达水平可筛选具有IFN-α样活性的小分子化合物.
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毒蕈胆碱M1受体激动剂的高通量筛选模型
目的建立毒蕈碱样胆碱M1受体激动剂的高通量筛选模型,以此模型进行M1受体激动剂筛选.方法将M1受体基因质粒(M1/pCDNA3.1)与报告基因质粒(3×CRE/3×MRE/SRE-LUC)按1∶5的比例共转染HEK293,建立了一个稳定的M1受体激动剂报告基因筛选细胞株.配体与细胞表面M1受体结合后,激活相应的信号通路,调节报告基因的表达,通过测定荧光酶素报告基因表达水平的变化,评估配体激活M1受体的生物活性.结果通过对筛选条件,如细胞数目、荧光素酶表达时间、底物浓度的优化,建立了可靠的筛选方法,并对多种抗衰老中药水提物进行了筛选,找到3种对M1受体有活性的中药.结论该系统能准确、稳定、有效地应用于M1受体激动剂的高通量筛选.
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基于报告基因检测的PXR、FXR和LXRα激动剂高通量筛选模型的建立
目的：建立基于报告基因法的高通量筛选细胞模型,用来发现PXR、FXR和LXRα受体激动剂。方法利用Re-al-time定量PCR方法比较HEK293、HepG2和LS174T细胞中内源性核受体 PXR、FXR 和 LXRα的表达量,将 pSG5-hPXR 和 pGL3-XREM-CYP3A4、pEGFP-N3-hFXR 和 EcRE-TK-Luc、 pCMX-FLAG-hLXRα和 pGL3-XREM-CYP3A4等质粒分别共转染到工具细胞中,优化共转染比例,并考察阳性药与萤光素酶报告基因表达强度的量效关系、模型特异性和稳定性。结果①根据Real-time定量PCR结果,模型选用低表达PXR、FXR和LXRα的HEK293细胞作为工具细胞；②根据不同共转染比例对报告基因活性的结果,PXR、FXR和LXRα报告基因药物筛选模型的报告基因和过表达质粒比例,终分别选择1∶1、2∶1和2∶1；③模型中,报告基因活性均与相应阳性药物( PXR/Rif、FXR/CDCA和LXRα/T0901317)呈剂量依赖性增长；④仅 PXR 激动剂 Rif、FXR激动剂CDCA和LXRα激动剂T0901317可分别明显增加相应筛选模型的报告基因活性,分别重复5次试验后,计算得Z′值分别为0．58、0．66和0．63。结论该研究建立的PXR、FXR和LXRα激动剂高通量筛选模型,具有良好的特异性和稳定性,适用于对PXR、FXR和LXRα受体激动剂的筛选,进而开发以核受体作为药物靶点的药物。
