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花椒提取物诱导肝癌细胞凋亡作用和分子机制研究
目的：研究花椒提取物ZBME诱导的肝癌细胞凋亡作用及其分子机制。方法：体外培养肝癌细胞HepG2细胞株。分为对照组（生理盐水）和ZBME处理组。不同浓度的ZBME处理体外培养肝癌细胞，通过相差倒置显微镜观察对照组和处理组细胞失巢凋亡和生长抑制。免疫印迹（ Western blotting）方法检测ZBME对细胞内抗凋亡蛋白Mcl-1、Survivin和Bcl-xL以及促凋亡蛋白Bax表达调控，基于Annexin V-PI双染的流式细胞分析统计 ZBME 诱导的细胞凋亡率。结果：在相差显微镜下，可以观察到 ZBME 能够显著诱导HepG2肝癌细胞株发生细胞凋亡和生长抑制。MTT检测细胞相对活性结果显示ZBME能诱导HepG2细胞增殖抑制。8μg/ml ZBME处理细胞48h增殖抑制率约40%（P﹤0.05）。Annexin V-PI染色表明ZBME能诱导细胞显著凋亡，8μg/ml ZBME 处理细胞48h凋亡诱导率约90%（P﹤0.05）。结论：ZBME能够诱导肝癌细胞凋亡和增殖抑制。ZBME抗癌作用可能通过下调致癌蛋白Mcl-1、Survivin和Bcl-xL以及上调抑癌蛋白Bax实现。
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ADAM17基因沉默对肝癌细胞HepG2的VEGFR2自分泌表达的影响
目的：观察ADAM17基因沉默对于肝癌细胞HepG2的VEGFR2自分泌表达的调节作用。方法：体外培养肝癌细胞HepG2，采用siRNA的方法靶向沉默 HepG2的 ADAM17基因，用逆转录 PCR和实时定量PCR分析VEGFR2基因水平的变化，用细胞免疫组化法和免疫印迹Western blot法观察VEGFR2蛋白水平的变化。结果：HepG2的VEGFR2蛋白表达在ADAM17基因沉默后72小时受到明显抑制（P＜0．05），但是在mRNA水平无明显变化。结论：ADAM17基因对于肝癌细胞HepG2的VEGFR2自分泌表达有重要的调节作用。通过干扰ADAM17基因的表达，可以抑制HepG2的VEGFR2的蛋白表达水平。ADAM17可以作为肝癌基因治疗的一个靶点。
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氨基葡萄糖对人肝癌 HepG2细胞增殖及凋亡的影响
目的：研究氨基葡萄糖对人肝癌 HepG2细胞增殖及凋亡的影响，并初步探讨其分子机制。方法：CCK -8法检测人肝癌 HepG2细胞的增殖情况。流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡。Western blot 检测ERK 及 P - ERK 蛋白的表达水平。结果：氨基葡萄糖可以抑制人肝癌 HepG2细胞的增殖，且该作用随着药物浓度的增加而逐渐增强。1.0mmol∕ L 氨基葡萄糖作用72h 可以使 G0∕ G1期细胞比例增加，S 期细胞比例降低。同时，2.0mmol∕ L 及4.0mmol∕ L 氨基葡萄糖处理72h 可以使人肝癌 HepG2细胞发生凋亡。另外，随着药物浓度的增加，人肝癌 HepG2细胞中 ERK 蛋白的磷酸化水平逐渐降低。结论：氨基葡萄糖可能是通过降低ERK1∕2蛋白的磷酸化水平影响细胞周期，从而抑制人肝癌 HepG2细胞的增殖并诱导其发生凋亡。
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白藜芦醇诱导肿瘤细胞凋亡和细胞周期阻滞的作用及机制
目的:探讨白藜芦醇(RES)诱导人肝癌HepG2、人慢粒K562肿瘤细胞凋亡和细胞周期阻滞的作用及机制. 方法: 应用形态学方法,Annexin V荧光染色检测HepG2,K562细胞凋亡的发生,应用流式细胞术(FCM)检测细胞周期,应用四唑蓝比色法(MTT)检测HepG2,K562肿瘤细胞对,RES的药物敏感性. 结果: RES对人肝癌HepG2细胞的生长有明显的抑制作用,并诱导肿瘤细胞发生凋亡. 凋亡细胞表现为细胞固缩, 核染色质碎裂. Annexin V荧光染色检测HepG2细胞凋亡率为33.7%,用FCM检测细胞周期明显阻止于G1期,而K562细胞凋亡率为9.97%. MTT检测表明RES对人肝癌HepG2细胞有剂量-效应关系. 但RES对人K562细胞的生长无明显的抑制作用. 结论:RES通过诱导HepG2细胞凋亡抑制肿瘤的生长,并有剂量-效应关系. 同时RES对肿瘤细胞的抑制及诱导凋亡的作用有细胞选择性.
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HBV对肝癌细胞中mmp-2及nm23表达的影响
目的:研究mmp-2和nm23在无HBV表达的人肝癌细胞株HepG2和持续表达HBV的HepG2细胞株(HepG2.215)中的表达及差异,进一步了解HBV在肝癌侵袭转移中的作用.方法:通过免疫细胞化学、Western Blot检测两组细胞株HepG2和HepG2.215中romp-2和nm23的表达.结果:肝癌细胞株HepG2.215与HepG2细胞株相比较,其romp-2表达的水平明显升高(P<0.01),而nm23表达的水平却明显下降(P<0.01).结论:romp-2和nm23的表达水平能反映肝癌的侵袭转移能力.romp-2在HepG2.215中的高表达和nm23在HepG2.215的低表达,可提示长时间的HBV感染可能会改变转移相关基因的表达,且有可能会导致肝癌细胞扩散转移.
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扶正抗癌方抑制HepG2细胞诱导EMT机理探讨
目的 探讨扶正抗癌方(FZKAF)对体外培养的人肝癌细胞HepG2迁移与侵袭能力的影响及可能的机制.方法 将细胞随机分为实验组和对照组,实验组给予FZKAF处理,对照组不添加任何药物,用MTT法测定两组HepG2细胞的活力,再分别采取细胞-基质黏附实验、划痕实验、Transwell侵袭及迁移实验测定HepG2细胞黏附,侵袭及迁移的能力;后通过明胶酶谱实验测定HepG2细胞内TGF-β1的酶活性.结果 FZKAF能抑制HepG2细胞的增殖,呈浓度依赖性,细胞-基质黏附实验、划痕实验、Transwell侵袭及迁移实验表明实验组细胞的黏附,侵袭及迁移的能力明显低于对照组(P＜0.05);明胶酶谱实验显示,随着FZKAF浓度的增加可以明显抑制HepG2细胞内TGF-β1的酶活性.结论 一定剂量的FZKAF在体外可以抑制HepG2细胞的粘附,迁移和侵袭,其机制可能是通过抑制TGF-β1的酶活性,抑制其表达,从而阻断肿瘤细胞的EMT过程有关.
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野生型p53/junB融合基因真核表达载体的构建
目的 通过构建抑癌基因野生型p53(wtp53)与核转录因子junB的融合基因真核表达载体,为进一步研究联合基因疗法在肝癌中的应用奠定一定的基础.方法 运用PCR(polymerase chain reaction)、RT-PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)、基因重组技术构建携带增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluoresent protein, EGFP)报告基因的wtp53/junB融合基因真核表达载体pEGFP-C1-wtp53/junB.通过观察绿色荧光定位的方法验证wtp53/junB融合基因的真核表达载体转染人肝癌细胞株HepG2的情况.结果 成功地将p53/junB融合基因克隆到pEGFP-C1质粒中,其序列与设计的完全一致;转染人肝癌细胞株HepG2后可观察到绿色荧光定位于细胞核中,证明wtp53/junB融合基因成功转染入肝癌细胞株中.结论 成功构建了携带EGFP的pEGFP-C1-wtp53/junB融合基因真核表达载体,并转染入人肝癌细胞核中,为进一步研究两者在肝癌中的协同作用奠定了基础.
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研究与分析阿霉素联合索拉菲尼对肝癌细胞株HepG2的抑制作用及机制
目的：研究与分析肝癌细胞株经阿霉素与索拉菲尼处理后对HepG2的抑制作用及机制。方法按照药物使用情况分为索拉菲尼组(甲组)、阿霉素组(乙组)、阿霉素联合索拉菲尼组(丙组)；并分别作用于肝细胞株HepG2细胞。并分析与比较三组细胞增殖抑制及细胞凋亡等情况。结果三组均可有效抑制HepG2细胞增殖，且存在剂量依赖性；但丙组具有协同效应(<0.05)。甲、乙组均可使HepG2细胞周期停滞于G0-G1期；但丙组G0/G1期细胞比率明显低于甲乙两组；且S期明显高于甲乙两组(P<0.05)。三组均可诱导HepG2细胞凋亡，但丙组更加显著(<0.05)；乙组可有效抑制HepG2细胞Survivin mRNA表达诱导细胞的凋亡。结论阿霉素联合索拉菲尼对肝癌细胞株HepG2具有较好协同效果，同时还可加速细胞增殖抑制，从而起到抑制肿瘤细胞生长效果。因此，临床可进一步研究，以更好地为肝癌临床治疗提供参考依据，从而改善患者预后。
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松花粉对肝癌细胞株HepG2的PIVKA-Ⅱ、AFP和VEGF含量的影响
目的 研究体外检测佳作用浓度(2mg/孔)和佳作用时间(48h)松花粉对肝癌细胞株HepG2的PIVKA-Ⅱ、AFP和VEGF含量的影响.方法 用ELISA法检测松花粉治疗组与HepG2对照组培养细胞上清液中PIVKA-Ⅱ、AFP和VEGF的含量变化.结果 松花粉治疗组与HepG2对照组相比,PIVKA-Ⅱ、AFP的含量下降( <0.05);VEGF的含量极显著下降( <0.01).结论 松花粉对HepG2细胞的增殖抑制作用和促凋亡作用可能与下调PIVKA-Ⅱ、AFP和VEGF有关.
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原花青素体内外抗肝癌活性及其自由基机理研究
目的:探讨葡萄籽原花青素(Grape Seed Proanthocyanidin Extract,GSPE)的抗肝癌活性及可能的机制.方法:以离体人肝癌HepG2细胞及在体荷瘤小鼠为研究对象,利用MTT法及流式细胞术评价葡萄籽原花青素体外对人肝癌HepG2细胞增殖及凋亡的影响.建立人肝癌HepG2细胞裸鼠皮下种植瘤模型,腹腔注射GSPE,观察其对体内种植瘤模型的作用.结果:GSPE对人肝癌HepG2细胞具有明显的增殖抑制作用,并将人肝癌HepG2细胞阻滞在S期.在体内则可显著抑制皮下移植瘤的生长.进一步研究结果显示,GSPE可降低HepG2细胞中活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)含量,同时可明显增高HepG2细胞中超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)的活性.结论:GSPE可明显抑制体内外肝癌的生长及发展,这可能与其较强的抗氧化活性有关.
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曲格列酮对HepG2及CD133+肝癌干细胞的毒性差异研究
目的 分离与鉴定肝癌细胞HepG2中CD133标记的肝癌干细胞(LCSC),初步探讨曲格列酮(Tro)对HepG2及CD133+LCSC的细胞毒性差异.方法 利用流式细胞仪分选纯化HepG2中的CD133+和CD133细胞,采用悬浮微球形成法、平板克隆形成法、Transwell侵袭和迁移实验检测HepG2、CD133+和CD133细胞的自我更新能力;BALB/c裸鼠体内成瘤实验检测HepG2和CD133 LCSC细胞的成瘤能力;流式细胞术检测HepG2、CD133+ LCSC细胞周期,MTT法测定其对索菲替尼的耐药性;MTT法检测Tro对HepG2、CD133+ LCSC的毒性情况,全自动生化分析仪测定其对细胞上清天冬氨酸氨基转移酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)和总蛋白(TP)水平的影响,荧光法检测Tro对细胞CYP450总活性和ROS水平的影响.结果 CD133标记的CSC在HepG2中占(0.72±0.05)％,CD133+细胞分选后纯度为98.7％;CD133+细胞微球形成能力、克隆形成能力以及Transwell迁移与侵袭能力、肿瘤形成能力明显高于亲本(P＜0.05、0.01);CD133+细胞群大多处于G0/G1期,G2/M期未阻滞,并且对索菲替尼表现较大耐药性(P＜0.05、0.01);Tro处理12、24、48、72 h后,CD133+ LCSC半数抑制浓度(IC50)显著低于HepG2 (P＜0.05、0.01);80 μmol/LTro处理48 h时,LCSC上清AST、TP、LDH、ALB、BUN生化指标不同程度升高,CYP450总活性和ROS水平出现明显抑制(P＜0.05、0.01).结论 成功筛选和鉴定具有高增殖能力的CD133+ HepG2 CSC,其在Tro引起肝细胞毒性方面较HepG2细胞更敏感,细胞毒性差异显著,为Tro靶向CD133+ LCSC的细胞毒性研究提供新思路.
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两种人类肝细胞系评价饮水氯化消毒副产物MX致DNA损伤作用的敏感性
背景与目的:研究两种人类来源的肝细胞在评价饮水氯化消毒副产物3-氯-4-二氯甲基-5-羟基-2(5氯)-呋喃酮(MX)DNA损伤作用的敏感性.材料与方法:应用单细胞凝胶电泳试验(彗星试验),研究人肝癌细胞株HepG2和人胚肝细胞L-02在评价饮水氯化消毒副产物MX DNA损伤作用的敏感性.结果:随着MX剂量增加,可引起HepG2(＞ 30 μmol/L)和L-02细胞(＞100μmol/L)DNA迁移度显著增加;中度以上损伤所占百分比在同剂量组中HepG2细胞大于L-02细胞,经比较分析,差异有统计学意义(χ2=20.985;8.0;11.97,P＜0.05).结论:应用单细胞凝胶电泳试验评价MX的DNA损伤作用,人肝癌细胞株HepG2比人胚肝细胞L-02更为敏感.
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裸鼠HepG2细胞皮下成瘤与肝内成瘤的实验研究
目的：探讨裸鼠皮下成瘤与肝内成瘤对肿瘤生物特性的影响。方法将20只裸鼠随机分为2组，皮下成瘤组与肝内成瘤组。皮下成瘤组取对数生长期的肝癌HepG2细胞制成细胞悬液，行前腋皮下注射。肝内成瘤组开腹，暴露肝脏，用微型注射器直接将浓缩的HepG2细胞悬液注射进入肝脏，逐层关腹。结果连续观察6周后处死裸鼠。前腋皮下成瘤组与开腹肝内成瘤组成瘤率均为100%，第9天前腋皮下成瘤组可见米粒大小结节，开腹肝内成瘤组15天可触及肝脏表面不平整。6周后大体解剖结果显示，皮下成瘤组肿瘤呈外生性生长，局部浸润皮肤，但未见肝、肺等远处转移，开腹肝内成瘤组肿瘤呈较明显的浸润性生长，且出现肝内、肺脏、肠系膜等远处转移。结论前腋皮下成瘤和开腹肝内注射成瘤二者成瘤率无差别。相同时间内，皮下成瘤组肿瘤生长较快，但肿瘤组织HE切片显示，皮下肿瘤血供较差，且远处转移率明显低于开腹组。相比其他肝内成瘤方法，开腹肝内注射成瘤方法简便，对于研究肿瘤的血供、转移以及侵袭性更具有优势。
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松花粉对肝癌细胞株HepG2的PIVKA-Ⅱ、AFP和VEGF含量的影响
目的：体外检测佳作用浓度（2 mg/孔）和佳作用时间（48 h）松花粉对肝癌细胞株HepG2的PIVKA-Ⅱ、AFP和VEGF含量的影响。方法用ELISA法检测松花粉治疗组与HepG2对照组培养细胞上清液中PIVKA-Ⅱ、AFP和VEGF的含量。结果松花粉治疗组与HepG2对照组相比，PIVKA-Ⅱ、AFP的含量下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；VEGF的含量极显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论松花粉对HepG2细胞的增殖抑制作用和促凋亡作用可能与下调PIVKA-Ⅱ、AFP和VEGF有关。
