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补骨脂乙素诱导HepG2细胞凋亡及对Bcl-2家族表达的影响
目的:观察补骨脂乙素对人肝癌细胞HepG2凋亡及其相关蛋白的影响.方法:用不同浓度补骨脂乙素(3、4、5、6和7mg/ml)处理HepG2细胞24h后,MTT法检测药物对细胞增殖的影响,并用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,Western印迹法检测凋亡相关蛋白的表达.结果:补骨脂乙素4mg/ml即能抑制HepG2细胞的增殖并诱导其凋亡,7mg/ml时凋亡率可达94.57％,在浓度4～7 mg/ml之间有良好的量效关系.补骨脂乙素浓度为7mg/ml时促凋亡蛋白Bax、Bid表达明显增加、抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少.结论:补骨脂乙素4mg/ml能诱导HepG2细胞凋亡,可能与其影响Bcl-2家族蛋白的表达有关.
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田基黄对人肝癌细胞HepG2增殖的影响
目的:探讨田基黄对人肝癌细胞增殖的影响.方法:体外培养人肝癌细胞株HePG2,用MTT法和流式细胞术(FCM)检测田基黄提取物及其含药血清作用于HepG2 24h后的细胞增殖情况.结果:MTT法结果表明,田基黄对HepG2增殖有抑制作用;FCM检测表明,田基黄阻止增殖中的HepG2进入S期.结论:田基黄能有效地抑制HepG2细胞增殖,提示阻滞细胞周期、抑制细胞增殖可能是田基黄治疗肝癌的一个机制.
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姜黄挥发油抗肿瘤作用机制研究
目的:探讨姜黄挥发油抗肿瘤作用.方法:运用体外培养细胞MTT法观察姜黄挥发油对肿瘤细胞的抑制作用及对BALB/C小鼠脾细胞增殖的影响.结果:姜黄挥发油能抑制人急性早幼粒白血病细胞株HL-60和肝胚细胞癌HepG2细胞株的增殖,并能促进BALB/C小鼠脾细胞的增殖.结论:姜黄挥发油对肿瘤有明显抑制作用,且能增强免疫功能.
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大柴胡汤含药血清通过Sirt3线粒体途径诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的研究
目的:探讨大柴胡汤含药血清抑制人肝癌HepG2细胞增殖的作用机制.方法:采用血清药理学方法制备大柴胡汤含药血清.以HepG2人肝癌细胞为对象,采用噻唑蓝法测定其对生长抑制的影响,倒置相差显微镜观察含药血清对HepG2细胞作用后形态改变,罗丹明123荧光染色观察细胞线粒体膜电位的变化,免疫印迹实验探讨其作用机制.结果:与空白血清组比较,大柴胡汤组(8.1 g/kg)5％、10％和20％含药血清能够抑制HepG2人肝癌细胞增殖并呈时间-浓度依赖性特点.5％、10％和20％大柴胡汤含药血清作用24h后,能够显著降低细胞线粒体膜电位并下调Sirt3、PI3K、Akt、NF-κB和Bcl-2蛋白表达,上调Bax和Caspase3蛋白表达.结论:大柴胡汤含药血清能够显著抑制人肝癌HepG2细胞增殖并通过线粒体依赖的Sirt3/PBK途径发挥作用.
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病毒介导的P53低表达HepG2细胞株的建立
目的 构建干扰P53的逆转录病毒载体,建立稳定低表达P53的HepG2细胞株.方法 合成干扰P53基因的寡核苷酸序列插入pMSCV-hyg-U6质粒,转化受体菌DH5α,经酶切测序鉴定后瞬时转染HepG2细胞,通过半定量RT-PCR方法检测P53 mRNA表达水平评估干扰效果；选择干扰效果好的重组质粒转染PT67细胞进行病毒包装,获得逆转录病毒颗粒感染HepG2细胞,通过Hygromycin筛选获得多个细胞克隆,Western blot检测P53蛋白的表达情况；选择P53表达水平低的细胞克隆.通过5-氟尿嘧啶(5-FU)诱导凋亡实验,检测P53低表达的HepG2细胞p53通路介导的细胞凋亡情况.结果 经酶切和测序验证成功构建重组病毒载体；瞬时转染HepG2细胞后P53 mRNA表达下调；病毒颗粒感染HepG2细胞后P53的mRNA、蛋白表达下调；用5-FU处理后P53低表达HepG2细胞凋亡水平明显低于对照.结论 成功构建了干扰P53的逆转录病毒载体,建立了P53低表达HepG2细胞株,明显阻断了P53通路依赖的细胞凋亡.
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维拉帕米对肝癌细胞株HepG2细胞增殖及迁移的影响
目的 探讨钙离子通道阻滞剂维拉帕米(VR)对人肝痛细胞株HepG2细胞增殖、DNA合成及细胞迁移的影响.方法 在HepG2细胞培养液中加入不同浓度的VR(0、1、5、10、1 5、20 μg/mL),采用甲基四唑蓝(MTT)法测定VR对HepG2细胞增殖的影响;5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2'deoxyuridine,Edu)荧光检测法测定细胞DNA合成期(S期)细胞所占比例;划痕试验测定细胞的迁移距离.结果 MTT结果 显示经VR处理24 h、48 h后除1、5 μg/mLVR在24 h对细胞无抑制作用外(P＞0.05),其余浓度及时间段对HepG2的增殖均有抑制作用(P＜0.05),并且相同浓度VR刺激48 h较24 h对HepG2的抑制率增加(P＜0.05).Edu结果 显示HepG2经VR作用24 h后,0、1、5、10、15、20μg/mL处理组HepG2的S期细胞所占比例分别为51.5%±3.78%、52.4%±3.26%、53.1%±1.94%、39.6%±4.25%、40.2%±2.67%、42.6%±3.13%.10、15、20 μg/m1处理组S期细胞所占比例较1、5μg/mL组及对照组下降(P＜0.05),与MTT结果 一致.划痕试验结果 显示经10、15、20ug/mLVR处理24 h后,与对照组相比,细胞迁移距离缩短(P＜0.05).结论 VR对肝癌细胞株HepG2的增殖及迁移均有抑制作用,VR可能成为肝痛治疗的新靶标.
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藻酸盐凝胶中肝癌HepG2细胞的三维培养
目的 采用藻酸盐凝胶为支架进行肝癌HepG2细胞的体外培养,构建体外肝癌细胞三维培养模型.方法 将HepG2细胞接种于藻酸盐凝胶中进行培养,通过倒置显微镜观察、H-E染色、钙黄绿素-碘化丙啶荧光复染及MTT实验,了解藻酸盐凝胶内细胞的生长情况.结果 在藻酸盐凝胶中HepG2细胞以细胞团的形式生长,增殖活跃.结论 成功建立了肝癌HepG2细胞藻酸盐凝胶培养体系,且该体系有利于HepG2细胞的生长.
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地塞米松刺激HepG2细胞内源性NTCP表达及在抗HBV药物筛选中的应用
目的 观察地塞米松处理人肝癌细胞HepG2对细胞内源性NTCP mRNA的表达影响,以及刺激后该体系在抗HBV药物筛选中的应用.方法 采用不同浓度地塞米松刺激HepG2细胞,处理后不同时间提取HepG2细胞中总RNA,实时荧光定量PCR检测NTCP mRNA表达量,确定刺激NTCP mRNA表达佳浓度及时间.采用佳浓度和时间刺激HepG2细胞,洗去培养基中残留地塞米松,实时荧光定量PCR检测NTCP mRNA表达变化.用HepG2.2.15细胞培养上清浓缩HBV感染地塞米松刺激后的HepG2细胞,ELISA检测细胞培养上清中HBsAg.后,采用阳性药物验证该体系的有效性、可行性.结果 0.5μm地塞米松刺激HepG2细胞24h时NTCP mRNA表达量高.撤去地塞米松后96h内,HepG2细胞中内源性NTCP mRNA的表达有一定程度的下降并维持在一定水平.HBV感染地塞米松刺激后的HepG2细胞后,在培养上清中能够检测到乙肝表面抗原.在该体系中,阿德福韦酯抗HBV活性的EC5o为0.26μm,环孢菌素A的EC50为0.19μm.结论 地塞米松能够上调HepG2细胞内源性NTCP mRNA的表达,能够更有效地介导HBV感染,且可以应用于抗HBV药物筛选.
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地衣活性化合物C11H12O5体外抗肿瘤作用
目的 研究地衣活性化合物C11H12O5对人乳腺癌细胞株MCF-7、人肝癌细胞株HepG2及人肺腺癌细胞株A-549的体外抗癌作用,观察其体外抗癌的剂量-效应关系和时间-效应关系.方法 采用体外细胞培养方式,以MTT法检测OD值,计算不同处理浓度和处理时间下肿瘤细胞的增殖抑制率.结果 化合物C11H1205在剂量2、4、8、16和32 μg/mL时,对人乳腺癌细胞株MCF-7的抑制率分别为14.19％、13.84％、28.90％、59.50％、80.29％,IC50为12.43 μg/mL;对人肝癌细胞株HepG2的抑制率分别为3.89％、11.09％、21.66％、46.27％、66.69％,IC50为18.88 μg/mL;人肺腺癌细胞株A-549的抑制率分别为14.13％、11.09％、45.98％、86.19％、99.02％,IC50为6.21 μg/mL.结论 地衣活性化合物C11H12O5对人乳腺癌细胞株MCF-7、人肝癌细胞株HepG2、人肺腺癌细胞株A-549均有显著体外抗肿瘤作用,存在明显的剂量-效应关系,其中A-549对该化合物敏感.对A-549体外抑制作用时间-效应关系不明显.
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奥沙利铂化疗对荧光HepG2肝癌细胞裸鼠原位移植瘤侵袭转移潜能的影响
目的 探讨化疗对肝癌裸鼠原位移植瘤侵袭转移潜能的影响.方法 选用稳定表达绿色荧光蛋白的HepG2人肝癌细胞株构建肝癌裸鼠原位移植模型,成瘤后实验组给予10 mg/kg奥沙利铂腹腔注射化疗,每周1次,共3次.后1次化疗后第7天,将2组裸鼠体内的残余肿瘤修剪成相同大小的瘤块再接种于新的裸鼠肝脏内.再接种后第6周,测量肿瘤大小,荧光显微镜下观察肿瘤的侵袭转移情况.结果 对照组和化疗预处理组裸鼠肿瘤体积分别为(2 376.29±573.69) mm3和(1 637.23±338.68) mm3 (P＜0.05).对照组裸鼠肿瘤均未发生肝脏、腹腔和肺转移,化疗预处理组裸鼠肿瘤发生肝内转移率为83.3％ (P=0.015),腹腔转移率为50％(P=0.182),肺转移率为50％ (P=0.182).结论 HepG2肝癌细胞在奥沙利铂化疗后生物学行为显著恶化.
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纳米微粒偶联抗OX40/抗AFP抗体在细胞毒性T细胞抗肝癌中的作用
目的 探讨乳酸-羧基乙酸共聚物(PLGA)制备的纳米微粒偶联抗OX40及抗AFP抗体(抗OX40/抗AFP-NP)对甲胎蛋白AFP158-155抗原肽特异性细胞毒性T细胞(CTL/AFP158-166)体外杀伤肝癌细胞的影响.方法 用溶剂蒸发法制备纳米微粒(NP),并与抗OX40和抗AFP共价偶联.用扫描电镜观察所制得PLGA-NP纳米颗粒的形态；ZetaPlusTM粒度测定仪检测纳米微粒的粒径及电荷；用BCA蛋白定量方法检测纳米微粒偶联抗体的效率；用人外周血单核细胞诱导形成树突状细胞(DC),用AFP158-166抗原肽负载DC诱导AFP特异性的CTL/AFP158-166；分别用2-(4-碘苯)-3-(4硝基苯)-5-(2,4-磺苯基四氮唑)-2H-四唑单钠盐-1法(WST-1)法、ELISA及乳酸脱氢酶(LDH)法分别检测抗OX40/抗AFP-NP对CTL/AFP158-166细胞增殖能力、分泌IL-2和IFN-γ及杀瘤活性的影响.结果 所制得的PLGA-NP为圆形,大小较均一,粒径约为(300±42)nm,带负电荷,约为-(25.12 ±5.34) mV.蛋白定量显示每mg的PLGA-NP偶联约100μg抗体,偶联效率为25％；增殖和活化实验显示偶联有抗OX40的纳米微粒能显著刺激CTL的增殖、IL-2和IFN-γ的分泌；杀伤实验显示,抗OX40/抗AFP-NP能显著增强AFP特异性CTL/AFP158-166细胞对HepG2细胞特异性杀伤作用,而对SMMC-7721杀伤作用无明显效果.结论 抗OX40/抗AFP-NP能刺激CTL/AFP158-166细胞的增殖、细胞因子的分泌并增强CTL/AFP158-166细胞对AFP阳性肝癌细胞的特异性杀伤作用.
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pDsRed1-C3/LOC51255真核表达质粒的构建及在HePG2细胞的表达定位
目的:构建pDsRed1-C3/LOC51255真核表达质粒并检测其在人肝癌细胞株HePG2中的表达和亚细胞定位.方法:采用PCR法从pET28b/LOC51255重组质粒中克隆得到LOC51255 cDNA全长序列, 并将该片段亚克隆到真核表达载体pDsRed1-C3中.构建好的pDsRed1-C3/LOC51255真核表达质粒经双酶切和测序鉴定后, 采用脂质体法将该重组质粒转染人肝癌细胞株HePG2, 再用荧光显微镜直接观察LOC51255在其中的表达及定位情况.结果:经双酶切及DNA测序结果证实成功构建重组质粒pDsRed1-C3/LOC51255;荧光显微镜观察证实该重组质粒能在HePG2细胞中表达, 且LOC51255蛋白主要定位于HePG2细胞的细胞质.结论:成功构建pDsRed1-C3/LOC51255真核表达质粒, 并在HePG2细胞中得到表达, 同时证实LOC51255定位于HePG2细胞的胞质, 为进一步研究人类LOC51255基因的功能奠定了基础.
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TIP-6通过诱导细胞自噬抑制培养的HepG2细胞和正常肝细胞增殖
目的:研究7-(4-甲氧基苯基)-5,8a-二苯基-1,2,3,7,8,8a-六氢咪唑[1,2-a]吡啶(TIP-6)对培养的人肝癌HepG2细胞和人正常肝细胞L02增殖的影响.方法:用MTT法和台盼蓝染色法检测TIP-6对细胞增殖的影响;相差显微镜观察细胞形态学的变化;流式细胞术(FCM)分析细胞周期改变;吖啶橙荧光染色观察自噬泡的变化;Annexin V/7-AAD和DAPI染色检测细胞凋亡;DNA电泳检测凋亡梯形带的产生.细胞免疫化学法测定NF-κB的表达.结果:TIP-6浓度为90～200 μLmol/L时,细胞增殖受到抑制,且与浓度、时间有关;当浓度为200 μmol/L、处理72 h时,两种细胞增殖数分别只有对照的12.10%和18.75%,空泡化也随剂量和时间的增加而加剧,空泡数目越来越多、体积越来越大;FCM结果显示,细胞被阻滞在G2/M期,且HepG2比L02细胞敏感.吖啶橙荧光染色证实自噬及自噬性细胞死亡会随着化合物浓度和时间增加而增多;Annexin V/7-AAD、DAPI染色及DNA电泳均证实凋亡并非TIP-6诱导HepG2及L02细胞增殖抑制的主要形式;细胞免疫化学法的结果显示,随着核转录因子NF-κB表达量的上调,自噬泡会随之增加,细胞增殖却相应减少.结论:TIP-6可能诱导自噬抑制培养的肝癌细胞和肝细胞增殖.自噬性细胞死亡可能与NF-κB蛋白的活化有关.
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Wnt/β-catenin信号因子在HepG2以及L02细胞中的表达
目的:比较Wnt/β-catenin信号分子在HepG2和L02细胞中的表达,探讨Wnt/β-catenin信号转导通路在肝癌发生中的作用机制,为肝癌的防治提供新的思路.方法:选取Wnt/β-catenin信号转导通路中上下游关键因子Wnt1、Wnt4、β-catenin、cyclin D1以及c-myc等,应用RT-PCR的方法观察他们在正常肝脏L02细胞和肝癌HepG2细胞中的转录水平.用免疫细胞化学染色方法和Western blot检测研究Wnt/β-catenin信号转导通路中关键的成员β-catenin在上述2个细胞株中的定位和定量表达.结果:在正常的L02肝细胞中,用RT-PCR的方法未检测到Wnt1、Wnt4、cyclin D1以及c-myc的mRNA转录,只有β-catenin的基因被转录表达.同时用免疫细胞化学染色观察到β-catenin在L02细胞膜处存在表达.而在HepG2肿瘤细胞中,不仅检测到β-catenin的基因转录,同时也检测到Wnt1、cyclin D1以及c-myc的mRNA转录,只有Wnt4未转录.用免疫细胞化学的方法观察β-catenin在肿瘤细胞中的表达明显增强,表现为胞膜着色减弱而胞质甚至是胞核的阳性染色.采用Western blot检测也验证了β-catenin蛋白在肿瘤细胞中的表达水平明显高于正常细胞.结论:Wnt/β-catenin信号转导通路在人的肝癌细胞HepG2中存在异常活性,Wnt1可能是导致信号通路激活的始动因素之一.
关键词： Wnt/β-catenin 信号转导通路 肝癌 HepG2 -
新型自杀基因linamarase/linamarin系统对人肝癌细胞HepG2体外杀伤效应及其旁观者效应的初步观察
目的: 研究新型自杀基因亚麻苦甙水解酶/亚麻苦甙(lis/lin)统对人肝癌细胞HepG2的体外杀伤效应.方法: 应用分子克隆技术构建热带植物木薯的cDNA文库, 并从中扩增出lin基因克隆至pEGFP-N1载体, 构建质粒pEGFP-N1-lis.通过电穿孔法将其转染人肝癌细胞株HepG2, 同时进行G418筛选, 直至出现抗性克隆, 扩大培养, 命名为HepG2/lis, 通过荧光显微镜观察、 RT-PCR、 Western blot鉴定lis基因的表达; 采用MTT法观察不同浓度lin对已转染的HepG2的杀伤作用及旁观者效应.结果: RT-PCR和Western blot证明转染的lis基因能够在HepG2细胞中表达并产生融合蛋白lis-EGFP; 低浓度lin对转染了lis基因的HepG2细胞具有明显的细胞毒效应; 旁观者效应显示仅10%左右的HepG2/lis细胞与90%的HepG2细胞混合培养于lin浓度为500 mg/L的培养基时, 就可显示出明显的旁观者效应.结论: lis/lin自杀基因系统在lin浓度为500 mg/L时对人原发性肝癌细胞HepG2具有明显的杀伤作用和旁观者效应.
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NDRG2对肝癌细胞HepG2凋亡的诱导作用
目的: 探讨NDRG2对肝癌细胞HepG2凋亡的诱导作用.方法: 用RT-PCR获取NDRG2基因.测序判断正确后, 将其克隆入含绿色荧光蛋白(GFP)基因的真核表达载体pIRES2-EGFP中, 并转染NDRG2表达阴性的HepG2细胞.用光镜观察转染细胞的形态变化; 荧光显微镜观察NDRG2蛋白的定位; 流式细胞仪分析细胞周期的改变; 透射电镜进一步观察细胞超微结构的改变.结果: 获得了NDRG2基因, 成功地构建了pIRES2-EGFP-NDRG2真核表达载体.转染HepG2细胞后, 细胞生长受抑, 结构破坏并死亡.荧光显微镜观察到NDRG2在胞质中表达, 流式细胞仪检测出现G1期阻滞和凋亡峰, 透射电镜观察到典型的细胞凋亡特征.结论: NDRG2基因具有诱导HepG2细胞凋亡的作用, 其机制有待进一步研究.
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β-榄香烯抑制HepG2细胞侵袭及转移的作用机制
目的:研究β-榄香烯(β-elemene)对体外培养的人肝癌细胞HepG2迁移与侵袭能力的影响及可能的作用机制.方法:细胞分为试验组和对照组,试验组细胞给予β-榄香烯处理,对照组细胞不添加任何药物.采用MTT法检测HepG2细胞的活力;分别采用划痕实验、Transwell小室迁移及侵袭实验、细胞-基质黏附实验测定HepG2细胞的体外迁移、侵袭和黏附能力;采用明胶酶谱法及western blot检测HepG2细胞MMP-9酶活性及蛋白表达;采用免疫荧光染色及western blot检测HepG2细胞NF-κB p65核转位的情况.结果:划痕实验、Transwell小室迁移及侵袭实验、细胞-基质黏附实验表明试验组细胞的迁移、侵袭和黏附能力均明显低于对照组(P＜0.05),呈浓度依赖性;明胶酶谱法及western blot表明β-榄香烯能明显降低MMP-9的酶活性及其蛋白表达,呈浓度依赖性;免疫荧光染色及western blot表明与对照组相比,β-榄香烯可以明显抑制HepG2细胞NF-κB p65的核转位,从而抑制其活化,呈浓度依赖性.结论:一定量的β-榄香烯在体外可以抑制HepG2细胞迁移、侵袭和黏附,其机制可能与其通过抑制NF-κB p65活化从而抑制MMP-9的表达有关.
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FAT10过表达对HepG2肝癌细胞生长及凋亡的影响
目的:探讨FAT10过表达对人肝癌细胞株HepG2生长和凋亡的影响.方法:采用脂质体法将FAT10质粒导入HepG2细胞,建立FAT10过表达的肝癌细胞系.Western blot检测细胞中FAT10表达水平,CCK-8细胞计数试剂盒,Annexin V凋亡试剂盒检测FAT10过表达对HepG2细胞生长和凋亡的影响.人类基因表达谱芯片检测FAT10下游与细胞增殖和凋亡相关基因的差异表达.结果:Western blot结果显示FAT10过表达细胞FAT10蛋白水平明显高于对照组,CCK-8检测显示FAT10过表达细胞增殖速度高于空载体组和对照组,而抗喜树碱诱导凋亡的能力FAT10过表达组较空载体组和对照组强.芯片分析显示,FAT10下游与细胞增殖和凋亡相关的若干基因表达有显著差异.结论:FAT10过表达可以促进HepG2细胞增殖和抗凋亡能力.
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阿霉素热化疗对肝癌细胞增殖和凋亡的影响
目的:探讨阿霉素(ADM)加热化疗对人肝癌细胞HHCC及HepG2的增殖抑制和凋亡诱导作用.方法:以体外培养的人肝癌细胞HHCC和HepG2为研究对象,采用水浴加温法,观察单纯热疗,ADM化疗和热化疗对细胞增殖和凋亡的影响.MTT法确定阿霉素的工作浓度并检测细胞增殖的抑制作用,流式细胞术检测细胞凋亡.结果:热化疗组细胞的抑制率显著高于单纯热疗、单纯化疗组[HHCC细胞:(65.77±2.54)% vs (23.18±0.81)%、(38.35±2.23)%,P＜0.05.HepG2细胞:(74.25±1.53 )% vs (17.12±2.86)%、( 30.35±5.90)%,P＜0.05].热化疗组细胞凋亡率显著高于单纯热疗组、单纯化疗组[HHCC细胞:(76.1±2.33)% vs (23.83±1.76)%、(45.57±2.81 )%,P＜0.05.HepG2细胞:(76.9±2.79)%vs (19.7±7.63 )%、(37.43±1.88)%,P＜0.05].结论:加热能增强ADM对HHCC及HepG2的增殖抑制和诱导凋亡作用.
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三羟异黄酮对肝癌细胞HepG2的ADAM17表达的调节
目的:观察三羟异黄酮(genistein)对肝癌细胞HepG2的生长增殖及ADAM17基因表达的影响. 方法: 培养肝癌细胞HepG2,加入三羟异黄酮特异性阻断酪氨酸蛋白激酶(TPK),MTT法观察genistein对HepG2细胞生长增殖的影响,PCR分析ADAM17基因水平变化,免疫组化法观察细胞水平ADAM17蛋白表达的变化. 结果:经过genistein处理的肝癌细胞HepG2生长增殖受到明显抑制,在48、72和96小时有统计学意义(P＜0.01);而且ADAM17的基因表达和蛋白表达都受到明显抑制(P＜0.05),抑制程度呈现时间依赖性关系.结论: 三羟异黄酮可以通过抑制TPK通路抑制肝癌细胞HepG2的生长增殖,并且抑制ADAM17基因和蛋白表达水平,从而间接调节HepG2细胞生长信号的传递.
