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DNA依赖性蛋白激酶催化亚基在电离辐射诱发HeLa细胞自噬中的作用
目的：了解DNA依赖性蛋白激酶催化亚基（ DNA-PKcs）在电离辐射诱发细胞自噬中的作用。方法通过慢病毒载体（ pSicoR ）构建DNA-PKcs短发夹RNA （ shRNA ）表达载体，并转染HeLa细胞敲低DNA-PKcs表达。CCK-8实验检测细胞增殖活性及细胞放射敏感性，免疫印迹检测自噬相关蛋白表达，免疫荧光实验检测自噬标志物GFP-LC3的表达。结果成功构建shRNA敲低DNA-PKcs表达的HeLa细胞模型，通过该细胞模型观察到抑制DNA-PKcs蛋白表达导致细胞增殖能力降低、放射敏感性增高。 P62和LC3蛋白表达变化，以及细胞内绿色荧光蛋白（ GFP）-LC3免疫荧光斑检测结果显示，DNA-PKcs基因敲低后，明显增加X射线诱发细胞自噬。抑制DNA-PKcs导致哺乳动物西罗莫司（雷帕霉素）靶蛋白（ mTOR）第2481位丝氨酸磷酸化水平降低。结论抑制DNA-PKcs增强受照射宫颈癌HeLa细胞的自噬及放射敏感性，mTOR信号通路可能参与DNA-PKcs对自噬的调节作用。
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DNA-PKcs单链抗体DPK3-scFv的原核表达纯化及生物学作用研究
目的 原核表达和纯化DNA依赖性蛋白激酶催化亚单位(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit,DNA-PKcs)单链抗体DPK3-scFv,观察其透入细胞及干扰辐射诱发DNA-PKcs磷酸化修饰的生物学作用.方法 PCR扩增DPK3-scFv基因,插入到带有His标签的原核表达载体pET28a,重组质粒转化工程茵BL21、优化表达.免疫荧光显微镜和蛋白免疫印迹观察DPK3-scFv透膜进入HeLa细胞及对电离辐射诱发靶分子DNA-PKcs的磷酸化修饰的影响.结果 成功构建单链抗体表达载体pET28a-DPK3-scFv,在2xYT培养基(16 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物和lO g NaCI溶于1 L双蒸水中,高压灭茵)、20℃温度、O.2 mmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)条件下诱导可溶性表达,进一步获得了纯化单链抗体.DPK3-scFv能体外抑制DNA-PKcs激酶活性,纯化的DPK3-scFv可跨膜进入细胞内,并与DNA-PKcs共定位在细胞核.DPK3-seFv对γ射线照射HeLa细胞中DNA-PKcs及其S2056位点(pS2056)的自磷酸化具有显著抑制作用.结论 通过优化条件获得了可溶性原核表达的DPK3-scFv单链抗体,具有抑制其靶分子DNA-PKcs的磷酸激酶活性.
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HIV-1 Tat 蛋白对细胞周期相关基因表达及辐射细胞周期阻滞的影响
目的:探讨HIV-1 Tat蛋白对细胞周期相关基因表达以及电离辐射诱发细胞周期阻滞的影响.方法:使用包含102个与DNA损伤修复和细胞周期相关的基因微阵列检测人横纹肌肉瘤细胞(TE671)及已转染tat基因的TE671细胞(TT2)基因表达谱的改变;使用流式细胞仪检测细胞周期变化;Western印迹检测蛋白表达变化.结果:在基因芯片的检测中发现,与DNA损伤修复及细胞周期调控相关的6个基因Cdc25C,KIF2C,Cdc20,DNA-PKcs,CTS1,Wee1在转染tat基因的细胞中表达下调;细胞周期检测发现TE671细胞和TT2细胞经4 Gy γ射线照射后表现出不同程度的G2/M期阻滞,但表达Tat的TT2细胞G2/M阻滞出现较TE671细胞晚,而在照射后48 h时TE671细胞G2/M期阻滞已恢复,但TT2细胞阻滞仍很显著.另外,TT2细胞S期阻滞时间延长.研究进一步发现细胞周期蛋白(cyclin)B1在TT2细胞中表达增强.结论:HIV-1Tat蛋白导致G2/M检验点功能紊乱,将影响细胞的辐射敏感性,本研究为了解AIDS合并肿瘤患者对放射治疗敏感性提供了重要实验数据.
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DNA双链断裂感应分子ATM能与PTC1相互作用
目的:研究DNA双链断裂感应分子ATM与原癌基因ret重排活化蛋白PTC1的相互作用.方法:用Flag抗体Western印迹检测,ATM免疫共沉淀真核细胞内过表达的PTC1;RET抗体检测ATM免疫共沉淀真核细胞内过表达的c-ret;用HA/myc抗体Western 印迹检测,HA-ret TK+myc-LZPR免疫共沉淀蛋白复合物;荧光蛋白标记的亚细胞定位.结果:PTC1可以与ATM激酶相互作用,此作用不依赖于电离辐射,且不被PI3K家族特异性抑制剂沃氏蓝霉素(wortmannin)所抑制,而野生型RET蛋白则不能同ATM结合;缺失体实验进一步证明两者的结合区段为ATM的LZPR结构域与PTC1的酪氨酸激酶结构域.构建PTC1绿色荧光蛋白表达质粒的亚细胞定位实验显示,PTC1以弥散形式分布于细胞质内.结论:胞浆蛋白PTC1可能借助某种途径使ATM在DNA损伤反应发生后重新定位,介导了细胞的恶性转化机制.
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电离辐射与生物组织作用的径迹结构研究方法
分析了电离辐射与人体组织相互作用的微观物理机制,确定了电离辐射微剂量学在研究辐射生物效应过程中的重要地位,指出径迹结构研究方法用于计算电离辐射粒子在人体组织中能量沉积时的可行性.
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电离辐射对人体造血和免疫系统的影响及防治
随着核工业和放射医学的快速发展,电离辐射对人体的损伤越来越受到重视.大剂量的辐射对人体各系统均有损伤,其中造血系统敏感,其次为免疫系统.电离辐射对人体的损伤程度和预后与照射剂量有密切关系.现将电离辐射伤及防治进展综述如下.
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重视CT检查中的辐射剂量
医疗辐照是X线被发现后早获得实际应用的领域,也是目前人类所受到的大的人工电离辐射来源[1].
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床旁X线机遥控曝光控制器的设计
X射线用于医学诊断有悠久的历史,医用辐射已成为人类受电离辐射的大来源,医用辐射防护日益引起社会各界的极大关注[1].X线成像设备遥控化是减少操作人员有害照射的主要途径[2].但对于床旁X线机的操作者来说,由于工作环境的复杂性,使用有线遥控因其距离限制不能达到完全的X线防护的目的.因此笔者设计了无线遥控床旁X线机曝光控制器RC-01,该遥控器不仅操作简单、灵活,而且使操作人员的有害照射降至低.
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CT在无症状人群个人健康评估中的合理应用
2014年10月15日至17日，由WHO主办、德国联邦辐射防护办公室协办，主题为“CT在无症状人群个人健康评估（individual health assessment，IHA）中的合理应用”的国际会议在德国慕尼黑举办。WHO就医疗机构的辐射安全发出全球性倡议，倡导医疗机构在医学领域安全、有效使用电离辐射，倡议包括辐射风险评估、风险管理和风险沟通等内容，旨在支持国际电离辐射防护和辐射源安全的基本安全标准在医疗机构实施，并就无症状人群IHA形成共识。与会专家交流了各国、各地区无症状人群IHA中CT应用的情况。欧美国家对无症状人群肺癌、结肠直肠癌及冠心病IHA的研究较多，并已制定了相关方案。笔者对本次会议相关报告、专家建议和共识进行总结，以飨国内读者。
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电离辐射对EL-4细胞Caspase-3蛋白表达的影响
Caspase-3(cysteinyl aspartic acid protease-3)是人类白细胞介素1β转化酶家族的重要成员之一,是细胞凋亡过程中的重要激酶.在凋亡的执行阶段,Caspase-3负责对全部或部分关键性蛋白的酶切(激活或灭活).许多凋亡调节因子终作用于下游效应器Caspase-3,形成凋亡特征性改变[1].电离辐射可诱导多种正常组织和肿瘤组织发生凋亡.笔者采用流式细胞术系统研究了不同剂量X射线对Caspase-3蛋白表达的影响,从而为探讨电离辐射引起细胞凋亡机制提供一定的科学依据.
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不同剂量率γ射线照射诱发淋巴细胞早熟凝集染色体环产额的研究
目的 比较不同剂量率γ射线照射诱发的淋巴细胞早熟凝集染色体环(PCC-R)的产额,建立不同剂量率的人外周血早熟凝集染色体环与辐射剂量之间的剂量效应曲线.方法 取健康成年人外周血,分别用吸收剂量率为0.5和1.0 Gy/min的60Co γ射线照射,吸收剂量为0、1、2、5、10、15、20和25 Gy.培养48 h,终止培养前1 h加入冈田酸(okadaic acid)诱导早熟凝集染色体,观察人外周血淋巴细胞PCC-R产额与照射剂量的关系.结果 在20 Gy剂量范围内,人外周血淋巴细胞PCC-R产额随着剂量的增加而增加.在25 Gy剂量范围内,在相同剂量情况下,吸收剂量率为1.0Gy/min的PCC-R产额都要高于0.5 Gy/min的产额,且在20和25 Gy剂量点的差异有统计学意义.结论 PCC-R作为大剂量受照情况下的生物剂量指示剂,基于不同剂量率建立的剂量效应关系曲线所估算剂量的结果会有所不同.
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全脑照射后海马组织内氨基酸类神经递质含量的变化
目的检测受照射后大鼠脑海马中氨基酸类神经递质的含量与变化.方法一次全脑2、15和30 Gy照射SD大鼠,照射后1周、1和3个月的SD大鼠经体脑微透析技术采集其海马组织的细胞外液,用高效液相色谱荧光法测定其中氨基酸类神经递质的含量.结果30Gy照射后1周、1月和15Gy照射后1月3组大鼠谷氨酸和天冬氨酸的含量与对照组相比增加了1.6和2.5倍;而其他组兴奋性和抑制性氨基酸递质均没有明显改变.结论大鼠大脑受照射后脑组织内兴奋性氨基酸神经递质有明显的增加,这为放射性脑损伤发病机理的研究提供了新的思路.
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辐射与化疗诱导Egr-1启动子调控GM-CSF基因表达的实验研究
目的 探讨辐照与阿霉素诱导早期生长反应因子(Egr-1)启动子调控造血生长因子基因表达对造血损伤的恢复作用.方法 构建携带Egr-1启动子且下游连接GM-CSF和EGFP基因的真核表达载体(Egr-EG);脂质体介导转染人骨髓基质细胞系HFCL;经60Co γ源辐照2.5 Gy或3μmol/L的阿霉素处理后,采用FACS检测转染细胞绿色荧光蛋白的表达,N-乙酰半胱氨酸(活性氧抑制剂)鉴定辐照及阿霉素处理诱导Egr-1调控下游基因表达的特异性;采用ELISA和RT-PCR检测辐照或阿霉素对HFCL/EG细胞GM-CSF蛋白及mRNA表达的影响;观察辐照及阿霉素处理后的细胞上清对CFU-GM形成的影响.结果 在辐照和阿霉素处理的HFCL/EG细胞中均显示EGFP和GM-CSF表达较未处理组明显增强(t=5.11,P<0.01),未处理组EGFP+细胞占1.2%,阿霉素组EGFP+细胞占15.2%,辐照组EGFP+细胞占18.2%;N-乙酰半胱氨酸明显减少辐照和阿霉素处理后细胞的绿色荧光蛋白表达强度,两组间差异无统计学意义(P0.05);辐照和阿霉素处理组细胞上清促进CFU-GM增殖作用较未处理组明显增强(t=4.37,P<0.01).结论 辐照和阿霉素诱导Egr-1启动子调控的造血生长因子基因表达可能对其所致的造血损伤具有一定的恢复作用.
关键词： 早期生长反应因子 电离辐射 阿霉素 粒-巨噬细胞集落刺激因子 活性氧 -
电离辐射诱导的两种新线粒体DNA缺失的分析鉴定
目的 筛选电离辐射诱导的线粒体DNA(mtDNA)缺失类型,并进行鉴定.方法 用10 Gy 60Co γ射线照射正常人淋巴细胞细胞系,用2对引物的长PCR扩增照射前后样品的mtDNA基因组.发现可能缺失片段后用限制条件的普通PCR进行确认,并对PCR产物进行纯化、克隆、测序和核酸同源性(BLAST)分析.结果 照射前的淋巴细胞系mtDNA样品只扩增出预期全长片段,照射后每对引物还扩增出可能为缺失造成的短片段;进一步限制条件的普通PCR证实了mtDNA缺失的存在.PCR产物经纯化、克隆后测序进行BLAST分析表明两种mtDNA缺失分别为7455 bp(重链nt475～7929)、9225 bp(重链nt7714～369)的mtDNA缺失,均发生在8 bp正向重复序列之间.进一步的生物信息学检索得出两种mtDNA缺失为新发现的mtDNA缺失类型.结论 电离辐射诱导出人淋巴细胞mtDNA 7455 bp和9225 bp缺失.
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辐射相关基因芯片的制备及其在肺癌细胞中的应用
目的寻找参与肺癌细胞辐射抗性的基因.方法构建辐射相关的基因芯片,初步筛选出在不同辐射敏感性肺癌细胞系中差异表达的基因.为了评价芯片结果的可靠性,我们对一些差异表达基因进行了RT-PCR验证.结果和辐射敏感的NCI-H446细胞相比,辐射抗性的A549中有18个基因有明显的改变,8个基因是上调,10个基因是下调.在照射后6 h和24 h,A549细胞中分别有22个基因(19个基因上调,3个下调)和26个基因(8个上调,18个下调)的差异表达;NCI-H446细胞中分别有17个基因(9个基因上调,8个下调)和18个基因(6个上调,12个下调)差异表达.从这些基因中,我们发现一些参与细胞增殖和抗凋亡的基因,在照射后的A549细胞中是增高的,而在NCI-H446细胞中是降低的.另外一些参与DNA修复的基因,在A549中比在NCI-H446细胞中有更高的表达.结论一些参与细胞DNA修复、细胞周期调控、细胞增殖和抗凋亡作用的基因可能有助于A549细胞辐射抗性的形成.
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2 GyX射线对EL-4细胞p16、CyclinD、CDK4基因转录和蛋白表达影响
目的研究电离辐射对EL-4细胞p16、CyclinD、CDK4基因转录及蛋白表达的影响.探讨p16/CyclinD/CDK4负向调控通路在辐射诱导G1期阻滞中的作用.方法采用半定量RT-PCR方法检测2 GyX射线照射后EL-4细胞p16 mRNA水平变化,采用Northern blot方法检测CyclinD、CDK4基因转录变化,应用免疫细胞化学方法(ICC)检测3种蛋白表达的变化.结果2 Gy X射线照射后2～48 h EL-4细胞p16 mRNA水平增高,48 h恢复至正常水平.p16蛋白表达照射后2h开始增高,12h达到峰值(P＜0.01),72 h恢复至正常水平.EL-4细胞周期蛋白CyclinD mRNA水平于照射后1 h开始明显降低,照射后8 h降至低值.CyclinD蛋白表达于照射后8 h开始明显减少,持续至照射后48 h(P＜0.05～P＜0.01).EL-4细胞CDK4 mRNA水平于照射后1h明显降低,照射后4 h～12 h保持较低水平,72 h恢复至正常水平.CDK4蛋白表达于照射后4 h明显下降,12 h降至低,72 h仍低于正常水平(P＜0.01).结论2 Gy X射线照射可诱导EL-4细胞p16表达增高,CyclinD和CDK4表达降低.提示p16/CyclinD/CDK4负向调控通路可能在电离辐射诱导EL-4细胞G1期阻滞中发挥重要作用.
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电离辐射诱导免疫细胞旁效应的实验研究
目的探讨不同剂量电离辐射在体外诱导免疫细胞的旁效应.方法用3H-TdR掺入法观察未受照射的EL-4细胞的增殖效应,用硝酸盐还原法测定受照射的J774A.1细胞分泌一氧化氮(NO)的含量.结果在受高、低剂量照射的抗原递呈细胞(J774A.1)和未受照射的T淋巴细胞(EL-4)的共培养体系中,0.075 Gy X射线照射的J774A.1细胞使EL-4细胞的增殖增强,而2 Gy X射线照射的J774A.1细胞则使EL-4细胞的增殖抑制;较大剂量X射线照射后J774A.1细胞分泌NO量明显增多,可能影响共培养的T细胞的增殖反应.结论低剂量辐射可诱导兴奋性或有益的旁效应,其机理有待进一步阐明.
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碱性单细胞凝胶电泳检测辐射诱发的外周血淋巴细胞DNA损伤
电离辐射往往通过DNA损伤而诱发细胞突变和癌变。由Singh等改进和建立的碱性单细胞凝胶电泳试验(SCGE)，是一种检测哺乳动物单细胞DNA断裂的新技术［1，2］。作者应用SCGE检测了受γ射线照射后小鼠及从事X射线探伤工人的外周血淋巴细胞DNA单链断裂(DNAssb)的情况。 一、材料和方法 1.实验动物及照射：雄性昆明系小鼠购自原苏州医学院动物部，6～7周龄，体重(20±2)g。用60Co外照射治疗机全身照射小鼠。球靶距70 cm，吸收剂量0.5和5.0 Gy，吸收剂量率为90.3 cGy*min-1。
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超氧阴离子和过氧化氢对抗辐射菌增殖的影响
目的探讨不同浓度的超氧阴离子(O-2)和过氧化氢(H2O2)与抗辐射菌(Dr)增殖的关系.方法利用细胞色素C还原法测定正常状态下和受不同剂量照射后Dr的O-2释放,加入还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化酶抑制剂DPI,观察在同样条件下Dr的O-2释放和增殖的变化.利用激光共聚焦显微镜测定受照后Dr内H2O2浓度变化.用3H-TdR掺入法测定上述条件下Dr的增殖.结果Dr中O-2、H2O2的释放与其增殖有关,较小剂量(＜1 kGy)照射能刺激Dr增殖并释放O-2、H2O2,较大剂量下该效应被抑制.结论适当浓度的O-2、H2O2对于Dr的增殖是必要的.
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电离辐射对小鼠免疫器官SOD基因转录以及蛋白活性的影响
电离辐射通过水的辐解作用可产生出各种自由基,并可由自由基引发脂质过氧化反应影响生物膜的结构与功能并进而影响整个细胞的功能.
