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X射线全身照射对小鼠骨髓细胞CyclinD、 CDK4表达的影响
目的研究X射线全身照射对小鼠骨髓细胞CyclinD、CDK4表达的影响,以探讨电离辐射诱导小鼠骨髓细胞G1阻滞的分子机理.方法采用Northern blot和半定量RT-PCR方法分别检测CDK4、CyclinD基因转录水平变化;流式细胞仪检测了X射线全身照射小鼠骨髓细胞CyclinD、CDK4的表达及周期时程的变化.结果 2 Gy X射线全身照射后12 h骨髓细胞出现G1期细胞百分数升高(P＜0.05),G2+M期细胞百分数于照后4 h及12 h升高(P<0.05);CyclinD基因转录水平从2 h开始下降,48 h达到低,照后72 h恢复至正常水平,CDK4的变化趋势与CyclinD相似,只是从8 h开始下降,48 h达到低,照后72 h恢复假照组水平;CyclinD蛋白表达在照射后2、4、24、48 h显著降低(P<0.01),CDK4蛋白表达在照射后2 h开始急剧下降,持续至照射后48 h仍未恢复到对照水平(P<0.01).结论 2 Gy X射线全身照射可诱导小鼠骨髓细胞发生G1、G2阻滞;CyclinD、CDK4基因及其蛋白产物可能在电离辐射诱导的小鼠骨髓细胞周期阻滞中起重要作用.
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电离辐射致线粒体DNA 4977 bp缺失质粒构建及其鉴定
目的建立电离辐射诱导的人线粒体DNA(mtDNA)4977 bp缺失片段和对照DNA片段的稳定质粒,用于线粒体基因组相关研究.方法对无mtDNA 4977 bp缺失的正常人外周血进行离体照射10 Gy60Co γ射线,提取细胞总DNA,用巢式PCR扩增mtDNA 4977 bp缺失片段,普通PCR扩增对照ND1基因片段.PCR产物经纯化后构建质粒;提取质粒DNA,DNA样品经酶切、纯化后测序,将测序结果进行BLAST分析.结果PCR扩增的跨mtDNA 4977 bp缺失的DNA片段和ND1基因片段大小与预期值是吻合的.对制备的质粒DNA样品进行测序,结果经BLAST分析,两种质粒DNA与人线粒体序列同源性在99%以上.结论本研究中所构建的质粒是成功的,可以用于人mtDNA4977 bp缺失的定性或定量研究.
关键词： 电离辐射 线粒体DNA 4977bp缺失 质粒构建 -
电离辐射对血管内皮细胞纤维肌动蛋白的影响
目的 观察电离辐射对血管内皮细胞纤维肌动蛋白的影响,探讨血管内皮细胞电离辐射损伤的机制.方法 用0、2、4、6、8、10和12 Gy 60Coγ射线对血管内皮细胞进行照射,于照射后6 h用激光共聚焦显微镜观察其细胞膜骨架蛋白,于照射后12和24h收集细胞,用流式细胞仪测定F-actin的含量.结果 细胞膜骨架随着辐射剂量的增加而破坏,这种变化呈剂量依赖性.F-actin的含量在照射后12 h明显减少,24 h后有所回升.结论 电离辐射能使血管内皮细胞骨架破坏和F-actin解聚,导致细胞损伤.
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P53在电离辐射诱导的细胞周期解耦联中的作用
目的 探讨p53基因在电离辐射(IR)诱导的MCF-7细胞周期解耦联中的作用.方法 构建RNAi表达载体,经磷酸钙共沉淀法转染293T细胞形成病毒包装颗粒,感染MCF-7后采用Western blot检测P53蛋白的表达,建立p53基因沉默模型.将p53野生型(+/+)和沉默模型(-/-)经电离辐射处理后,采用流式细胞术分别测定细胞周期并分析细胞多倍体的变化.结果 与p53+/+组比较,p53-/-模型组G0/G1期细胞百分数减少,S期、G2期增加(P<0.01),倍体分析表明二倍体数减少,四倍体、八倍体均增加(P<0.01).在p53+/+和p53-/-细胞中,与假照射组比较,4 Gy照射后G0/G1期、S期细胞百分数减少,而G2期增多(P<0.01);倍体分析表明,照射后二倍体数减少,四倍体、八倍体均增加(P<0.01).与p53+/++IR组比较,p53-/-+IR组发生G0/G1期、S期细胞百分数减少,G2+M期增多(P<0.01),二倍体数减少,四倍体增多(P<0.01),八倍体无明显差别.结论 电离辐射可以诱导细胞发生G2期阻滞和细胞周期解耦联;P53在电离辐射诱导的MCF-7细胞G2期阻滞中发挥作用,而在细胞周期解耦联中可能不发挥作用.
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电离辐射对小鼠组织金属硫蛋白-1 mRNA表达的影响
目的探讨X射线全身照射对小鼠肝、脑、胸腺及脾脏金属硫蛋白(MT)-1 mRNA表达的影响及其剂量效应关系.方法采用Northern杂交方法检测了X射线全身照射后小鼠肝、脑、胸腺及脾脏MT-1 mRNA水平变化.结果4GyX射线照射后肝脏及胸腺MT-1 mRNA水平逐渐升高,照射后4 h达峰值,分别为假射组的1.82及1.72倍,24 h基本恢复至正常水平;0.5～6Gy照射后4h,肝脏及胸腺MT-1 mRNA水平均呈剂量依赖性增加,6Gy照射后MT-1 mRNA水平分别为假照组的2.13和1.62倍.但X射线全身照射后小鼠脑及脾脏MT-1 mRNA水平未见明显变化.结论X射线全身照射可提高小鼠肝脏和胸腺MT-1 mRNA水平,但对小鼠脑及脾脏MT-1 mRNA表达无影响.
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SSH方法分离大剂量照射后小鼠骨髓差异表达EST序列
目的为探讨骨髓辐射损伤的分子机理,研究了整体照射条件下,辐射前后骨髓基因表达的变化.方法小鼠7 Gyγ射线照射后4 h提取骨髓总RNA为实验方(tester),对照组动物骨髓总RNA为驱动方(driver);实验方、驱动方总RNA由SMART cDNA合成方法合成双链cDNA,进而由抑制消减杂交(SSH)方法获得消减杂交产物,消减杂交产物克隆到T载体建立消减文库;对部分克隆进行杂交筛选及序列比对.结果消减杂交文库挑取800个克隆进行PCR扩增,阳性率约为86%;部分克隆经两轮杂交筛选获得14个差异片段;7个差异片段与鼠EST库已有序列高度相似,其余7个差异片段可能是新的EST序列.结论大剂量照射后小鼠骨髓cDNA消减文库的建立以及部分差异表达EST的验证为进一步研究辐射相关差异表达基因奠定基础.
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电离辐射对小鼠骨髓基质细胞分泌的干细胞因子mRNA转录的影响
骨髓基质细胞(Bone marrow stromal cell,BMSC)是造血微环境的重要组成成分，也是产生造血活性物质所必需的结构基础，同时也能分泌多种造血因子。BMSC受到辐射损伤后，M-CSF、G-CSF、GM-CSF、IL-1、IL-4、IL-5等造血因子mRNA水平发生了变化［1］，但对于其分泌的造血调控的重要细胞因子——干细胞因子(Stem cell factor,SCF)在放射损伤后其mRNA水平有什么变化，以及这些变化与造血功能障碍之间是否有关系，至今尚未见报道。本文作者观察了体外培养的小鼠BMSC在受到不同剂量60Co γ射线照射后，其SCF mRNA转录水平的变化，以期探讨放射损伤后造血功能障碍的机理。 一、材料和方法 1.实验材料：健康雄性昆明小白鼠，体重18～22 g，本校实验动物中心提供。总RNA提取试剂盒(GIBCO BRL)，10×SYBR Green PCR buffer(PE Applied Biosystems),Taq酶、m-MLV等均为上海生物工程公司代理产品。 2.引物设计：由Genset Singapore Biotechnology Pte Ltd合成，序列顺序为：上游引物：5′-ATCTGCGGGAATCCTGTGACTG-3′，下游引物：5′-CCATATCTCGTAGCCAACAATGAC-3′。 3.BMSC培养：参照Dexter's介绍的方法［2］进行BMSC培养。每周半量换液，至贴壁细胞长满为止(约3～4周)。
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电离辐射对p16基因转录及蛋白表达的影响
目的研究电离辐射对p16基因转录及蛋白表达的影响.方法采用Northern blot检测p16 mRNA水平的变化;采用单克隆抗体免疫荧光标记及流式细胞术检测p16蛋白表达的变化.结果研究证实,2.0 Gy照射后2～24h,胸腺细胞p16 mRNA水平明显增高,8～48 h p16蛋白表达显著增高(P＜0.05～P＜0.01);照射后2～8 h脾细胞p16 mRNA水平明显增高,24 h p16蛋白表达显著增高(P＜0.05).研究还证实,0.5～6.0 Gy照射后,胸腺细胞p16mRNA水平呈剂量依赖性增高,p16蛋白表达在1.0～4.0 Gy组显著增高(P＜0.05～P＜0.01);脾细胞p16mRNA水平亦增高,但增幅远低于胸腺细胞,p16蛋白表达在1.0～4.0 Gy组显著增高(P＜0.05～P＜0.01).结论电离辐射可诱导p16基因转录及蛋白表达增高,其增高幅度表现出一定的细胞异质性.
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cAMP-PKA参与辐射诱导p27Kip1蛋白的表达调控
目的研究电离辐射反应中p27Kip1表达调控机理.方法将p27Kip1蛋白编码全长基因克隆导入原核表达载体pGEX4T-2,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后再经GST-Sephrose 4B柱亲和层析、纯化,获取的GST-p27Kip1融合蛋白作为磷酸化底物,并进行体外磷酸化检测.结果PKA具有磷酸化p27Kip1蛋白的功能,该反应能被PKA的特异性抑制剂H89所抑制;照射后细胞内源性的PKA对p27Kip1的磷酸化程度减弱.结论cAMP-PKA在电离辐射诱导细胞周期检查点蛋白p27Kip1表达降低的调控机理中起到主要作用.
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电离辐射对小鼠腹水型S180细胞凋亡及小鼠生长的影响
电离辐射诱导细胞凋亡是目前肿瘤放射生物学研究的热点之一［1］，但辐射诱导细胞凋亡的机理仍不十分清楚。本文作者通过研究S180荷瘤小鼠经电离辐射诱导肿瘤细胞凋亡，探讨电离辐射诱导细胞凋亡与照射剂量、照射方式、抑瘤作用及生存期之间的关系。 一、材料和方法 1.材料设备：昆明小鼠(内蒙古大学动物实验中心)，S180细胞(北京肿瘤基础研究所)，直线加速器(北京BG-4），流式细胞仪(美国B-D FACscan)，透视电镜(日本H-700）。 2.动物模型建立：取7～8 d S180荷瘤鼠腹水液，按1∶4稀释，接种于鼠腹腔，每只0.2 ml，相当于2×106个瘤细胞，制成腹水型荷瘤小鼠。
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大剂量γ射线照射后PC12细胞死亡方式的研究
目的 研究受大剂量γ射线作用后,大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12)的死亡方式,寻找神经细胞辐射损伤的体外模型.方法 PC12细胞分为0、8、16和32 Gy组,经60 Co γ射线照射后,PI单染流式细胞术法观察细胞增殖周期改变,Annexin-V-FITC及PI双染法检测细胞凋亡的发生,光镜和电镜技术观察照射后细胞分化与存活的形态学变化.结果 大剂量γ射线照射后,随照射剂量的加大,发生死亡的细胞数有所增加,但发生凋亡的PC12细胞数目很少,可以忽略不计;细胞主要是在肿胀的基础上发生死亡的.电镜显示,细胞器明显肿胀扩张,粗面内质网高度扩张,线粒体肿胀、空化,核染色质浓缩成块状,散在于核膜下及核仁周围,核膜间隙增宽,与胀亡性坏死的特征相类似.结论 大剂量γ射线照射后,PC12细胞主要是在肿胀的基础上发生死亡的.该细胞模型适于被用来研究辐射致神经细胞坏死相关病理生理过程及其内在机制等问题.
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γ射线对培养的兔血管平滑肌细胞的抑制作用
目的观察体外培养的兔动脉平滑肌细胞(SMCs)对γ射线照射的剂量效应关系,探讨电离辐射抑制SMCs增殖的细胞生物学机理.方法静止期SMCs分别给予γ射线2.5,5,10,20及30Gy一次性照射后继续培养4,24或72 h.以3H-TdR掺入法、流式细胞术分析、微核实验和电镜观察γ射线对SMCs的DNA合成、增殖周期和损伤的影响.结果在2.5 Gy以上剂量γ射线一次性照射时,SMCs增殖明显抑制,细胞G0/G1期阻滞,均呈剂量依赖性.2.5Gy以下剂量γ射线照射后24 h左右可见细胞凋亡增加,2.5 Gy以上剂量γ射线照射可使SMCs发生坏死.结论电离辐射能抑制SMCs增殖,使细胞产生G0/G1期阻滞,并呈剂量依赖关系.SMCs死亡方式与受照射剂量有关.
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电离辐射致血管细胞及心肌细胞凋亡作用比较
实验证实,电离辐射不仅能抑制平滑肌细胞分裂增殖,而且能诱导机体多种组织细胞,包括血管平滑肌细胞及内皮细胞的凋亡[1,2].因此,利用电离辐射诱导平滑肌细胞凋亡以达到抑制细胞过度增殖,有望成为预防再狭窄的新途径[3].但血管内放射治疗属非选择性,β或γ射线射程内的所有组织细胞均受到电离辐射.冠状动脉内放射治疗所涉及的细胞包括血管平滑肌细胞、血管内皮细胞及心肌细胞等.其中,放射治疗的靶细胞为血管平滑肌细胞,而血管内皮细胞及心肌细胞则是无辜者.本文作者旨在观察电离辐射对血管细胞及心肌细胞的影响,以便为临床放射治疗再狭窄提供理论依据及合理的治疗方法.
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电离辐射对小鼠骨髓细胞p53、Wafl、gadd45基因转录水平的影响
目的研究X射线全身照射对小鼠骨髓细胞p53、wafl、gadd45基因转录水平的影响,以探讨电离辐射诱导小鼠骨髓细胞G1阻滞的分子机理.方法采用Northern blot和半定量RT-PCR方法分别检测p53、wafl、gadd45基因转录水平变化.结果2GyX射线全身照射后2～72 hp53基因转录水平均有不同程度的升高,wafl基因在照射后2 h开始升高,4 h达峰值,一直持续到照后48 h开始恢复,gadd45转录水平除在照射后2 h一过性升高外,从8 h即开始不同程度下降,照射后72 h开始恢复.分别以0.5～6.0 Gy X射线全身照射后12 h取小鼠骨髓细胞作量效研究表明,p53的改变在照射后各组虽有不同程度的升高,但未见明显的剂量依赖,wafl基因转录呈明显的剂量依赖性升高,6.0 Gy X射线照射后达对照组的3.41倍,gadd45未见升高趋势.结论在电离辐射诱导的小鼠骨髓细胞周期G1阻滞中p53-wafl通路起重要作用,而gadd45可能不参与该过程调控.
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X射线全身照射对小鼠免疫细胞PKCθ表达和膜转位的影响
目的 探讨不同剂量电离辐射全身照射对免疫细胞中PKC θ表达的影响.方法 用免疫细胞化学ABC法观察了小鼠胸腺和脾细胞中PKC θ的表达变化.结果 低剂量电离辐射和高剂量电离辐射均能增强胸腺和脾细胞PKC θ分子在胞浆中的表达和膜转位,在胸腺中呈现明显的剂量依赖性.结论 在电离辐射作用下,PKC θ表达上调、膜转位增强,它不仅参与T细胞的成熟与活化过程,可能同时参与其他信号传导而具有多种生物活性,但它是电离辐射影响机体免疫功能的重要因素之一.
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ATM基因对60Coγ射线照射后AT细胞hTERT表达的影响
目的研究外源性ATM基因对电离辐射照射的毛细血管扩张-共济失调症(ataxiatelangiectasia,AT)患者皮肤的成纤维细胞系AT细胞(AT5BIVA)hTERT mRNA和蛋白表达的影响.方法以正常人皮肤的成纤维细胞系GM细胞(GM0639)为对照,应用RT-PCR与Western blot实验方法,观察经0、1、3和5Gy(剂量率1.0 Gy/min)60Co γ射线照射后,AT细胞、空载体AT细胞、ATM+-AT细胞和GM细胞的hTERT mRNA和蛋白表达的变化.结果未照射时,除GM细胞外,其余各细胞均有hTERT mRNA和蛋白的表达;ATM+-AT细胞的hTERT mRNA和蛋白表达量较AT细胞明显下降(P＜0.05);ATM+-AT细胞的hTERT mRNA和蛋白表达量仍然明显高于GM细胞的hTERT mRNA表达量.在1～5 Gy剂量范围内,AT、空载体AT、ATM+-AT和GM细胞的hTERT mRNA和蛋白表达量呈剂量依赖性增加;在相同照射剂量点,ATM+-AT细胞的hTERT mRNA表达量较AT细胞均有明显降低(P＜0.05).结论电离辐射可诱导细胞hTERT mRNA和蛋白的表达;并且细胞hTERT mRNA和蛋白表达量呈剂量依赖性增加;外源性ATM基因可下调AT细胞hTERT mRNA和蛋白的表达.推测端粒酶参与电离辐射诱导DNA损伤的修复.
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电离辐射对EL-4细胞凋亡与坏死的影响
目的 研究不同剂量电离辐射对EL-4细胞凋亡和细胞坏死的影响。方法 采用PI和Hoechst 33342双染、流式细胞术检测。结果 实验结果表明：给予50～200 mGy低剂量照射后6 h，EL-4细胞凋亡和坏死较对照组没有升高，而给予1.0～8.0 Gy大剂量X射线照射后6 h，细胞凋亡较对照组有明显升高，4.0 Gy以上剂量，细胞坏死显著升高。结论 一定剂量的电离辐射不仅可以诱导凋亡的产生，而且可直接导致细胞坏死，即细胞的死亡模式与受照剂量有关。
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电离辐射对松果腺细胞功能的影响
目的研究电离辐射对松果腺细胞凋亡、cAMP和褪黑素(MLT)含量的变化规律及特点.方法采用流式细胞术检测松果腺细胞凋亡.采用放免分析法检测松果腺细胞中cAMP含量.采用高效液相色谱分析法检测松果腺细胞中MLT含量.结果小鼠受0.5～6Gy X射线全身照射12 h,随剂量增加松果腺细胞凋亡百分率增加;照射后24 h,随剂量增加松果腺细胞中cAMP含量降低.小鼠受1～6Gy照射后12 h,随剂量增加松果腺细胞合成和分泌MLT功能减弱.结论高剂量电离辐射对松果腺细胞功能有抑制作用.
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电离辐射肾损伤病理特点及其机理研究
目前对放射性肾病有一些研究,但对其发生机理不很明确,现有的体外照射动物肾脏的方法存在定位不准确和肾外组织的损伤.本研究用手术方法将大鼠双肾暴露体外后进行γ射线照射,并通过光镜和电镜观察电离辐射肾损伤的病理特点,以RT-PCR方法研究相关基因表达量的改变,为放射性肾病病理及辐射防护提供实验依据和研究手段.
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ATM基因在电离辐射诱导下对BRCA1、RAD51表达的影响
目的 探讨60Co γ射线照射前、后,BRCA1、RAD51蛋白在GM、ATM+AT、AT细胞中的 表达.方法 应用免疫荧光染色和激光扫描共聚焦显微镜,观察GM、ATM+-AT、AT细胞在0和10Gy60Co γ射线照射后,BRCA1、RAD51蛋白在上述细胞中的定位及表达并进行定量分析.结果 60Coγ射线照射前,BRCA1、RAD51蛋白在GM、ATM+-AT、AT细胞中仅有少量表达并且无共定位表达,其中在AT细胞中表达量低;10 Gy 60Co γ射线照射后,BRCA1、RAD51在GM、ATM+-AT、AT细胞中表达量增高,其中GM、ATM+-AT细胞呈现共定位表达,AT细胞无共定位表达;GM、ATM+-AT细胞中BRCA1、RAD51蛋白表达量与AT细胞比较差异有统计学意义(P＜0.01);GM细胞中BRCA1、RAD51蛋白表达量与ATM+-AT细胞比较差异也有统计学意义(P＜0.01).结论 GM细胞和ATM+-AT细胞中存在ATM基因,ATM在射线等因素诱导下可以激活其下游基因BRCA1、RAD51,并且使这两种蛋白表达或表达量增加并且相互作用,共同完成辐射损伤后的细胞修复;外源性ATM转入正常GM细胞后,由于外源性的ATM基因不能完全弥补内源性的ATM突变基因的功能,对其下游基因Brca1"部分"磷酸化,表现为BRCA1、RAD51蛋白表达量均较GM细胞低.
关键词： atm基因 BRCA1 RAD51 电离辐射 激光扫描共聚焦显微镜
