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毛冬青甲素和异搏定对体外培养K562/A02细胞内柔红霉素蓄积的影响
目的 观察中药钙通道阻滞剂毛冬青甲素(IA)和异搏定(VP)对体外培养K562/A02细胞内柔红霉素蓄积的影响.方法 采用流式细胞仪测定细胞内柔红霉素(DNB)浓度.结果 采用非细胞毒性剂量的IA(40uM)和VP(10uM)均能提高细胞内DNR的浓度,其效果比较,IA+VP>IA IA+VP>VP.结论 毛冬青甲素和异搏定均能影响K562/A02细胞内柔红霉素的蓄积.
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益气养阴解毒方对K562/A02裸鼠移植瘤逆转作用研究
目的:研究益气养阴解毒方对K562/A02多药耐药移植瘤的逆转作用.方法:建立K562/A02裸鼠移植瘤多药耐药模型；选用维拉帕米作阳性对照,用流式细胞仪(FCM)检测各组移植瘤耐药细胞P糖蛋白(P-gP)与bcl-2的表达情况和移植瘤细胞内注射用盐酸多柔比星(ADM)蓄积浓度及移植瘤耐药细胞的凋亡情况.结果:移植瘤P-gP表达与维托帕米组相比,生理盐水组与中药小剂量组有差异(P<0.05)；bcl-2的表达与维拉帕米组相比,中药大剂量组有差异(P<0.05)；益气养阴解毒方能使移植瘤耐药细胞内ADM的浓度升高.结论:益气养阴解毒方具有部份逆转白血病K562/A02移植瘤多药耐药性的作用,其逆转移植瘤裸鼠多药耐药性的机制不是通过下调肿瘤细胞膜上P-gP的表达实现的,而与降低bcl-2的表达、促进耐药细胞凋亡有关.
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从白血病干细胞水平研究蝎毒多肽提取物逆转多药耐药机制
目的 探讨蝎毒多肽(peptide extract from scorpion venom,PESV)对白血病干细胞(leukemic stem cell,LSC)在体内多药耐药(multidrug resistance,MDR)的影响.方法 培养K562/A02细胞,在对数生长期收集并经免疫磁珠法分选出K562/A02干细胞备用;40只BABL/c裸鼠,取5只注射K562/A02干细胞形成皮下瘤块备用;采用随机数字表法将35只裸鼠分为正常对照组、模型组、耐阿霉素(Adriamycin,ADM)组、PESV组和ADM+ PESV高、中、低剂量组,每组5只.正常对照组不作处理,其余各组包埋瘤块组织,造模后模型组给予1 mL生理盐水腹腔注射,每天1次;ADM组腹腔注射ADM 0.05 mg,隔天1次;PESV组腹腔注射PESV 2μg,每天1次;ADM+PESV高、中、低剂量组腹腔注射ADM 0.05 mg,隔天1次,同时给予PESV(5、2、1μg)腹腔注射,每天1次.给药14天.流式细胞术检测P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp);RT-PCR检测乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein,BCRP)、多药耐药基因1(multidrug resistance 1,MDR1) mRNA表达;免疫组化法检测乙醛脱氢酶1 (aldehyde dehydrogenase 1,ALDH1);Western blot法检测磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)蛋白表达;ELISA检测核转录因子NF-κB含量.结果 K562/A02细胞经免疫磁珠分选前后的CD34+CD38-细胞比率分别为31.5％、92.8％,耐药率(IC50)分别为(60.33 ±10.68) μg/mL、(58.33 ±9.72) μg/mL,造模裸鼠成瘤率为100％.与模型组比较,ADM组各项检测指标比较,差异无统计学意义(P＞0.05);PESV组BCRP、MDR1 mRNA和NF-κB因子水平比较,差异均有统计学意义(P＜0.05);ADM+PESV高、中、低剂量组P-gp值降低,PI3K蛋白表达下调(P＜0.05),ADM+PESV高、中剂量组BCRP mRNA表达降低,MDR1 mRNA表达升高,差异均有统计学意义(P＜0.05);ADM+PESV高剂量组PI3K蛋白表达下调,差异有统计学意义(P＜0.05).分别与ADM组和PESV组比较,ADM+PESV高剂量组P-gp、BCRP mRNA、MDR1 mRNA、PI3K和NF-κB水平明显均下调,差异有统计学意义(P＜0.05).各组ALDH1阳性率比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 PESV联合ADM 具有下调白血病K562/A02干细胞P-gp、BCRP、MDR1、PI3K、NF-κB的表达水平,可以增强白血病K562/A02干细胞在体内对ADM的敏感度,具有逆转其多药耐药作用.
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应用蛋白质芯片对汉防己甲素单用及与屈洛昔芬伍用逆转白血病细胞耐药机理的研究
本研究的目的是应用蛋白质芯片检测汉防已甲素(Tet)单独及与屈洛昔芬(Drol)伍用对作用的白血病细胞表面的耐药蛋白,包括P-糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白(MBP1)、乳腺癌耐药蛋白(BCRP)表达的作用,为逆转剂的临床应用提供理论依据.选择位于膜表面P-gp、MRP1、BCRP耐药蛋白及其相应的抗体为研究体系,制备蛋白芯片,直接对逆转剂作用12、24和48小时的K562/A02细胞进行检测.结果表明:Tet和Drol联合作用24小时时检测到P-gp表达下调(Tet+Drol组:85.27±3.095,对照组:93.67±2.748,P＜0.05).经逆转剂单独及联合作用K562/A02细胞48小时时均检测到P-gp表达下调,且联合应用两药对P-gp表达下调作用明显(Tet+Drol:82.62±3.227,Tet:86.44±2.906,Drol:87.23±2.049,对照组:93.67±2.748,P＜O.05).检测结果与流式细胞仪检测结果一致.结论:逆转剂Tet和Drol对K562/A02细胞的P-gp下调呈时间依赖性.联合作用24小时时出现下调P-gp表达,单独作用48小时均下调P-gp表达,联合用药时下调作用明显.不同检测时间均未见下调MBP1和BCRP的表达.
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白血病细胞中NF-κB调控MDR1基因、P糖蛋白及逆转耐药的研究
本研究探讨NF-κB调控的血液肿瘤细胞抗凋亡机制中是否有mdrl的参与,并通过对NF-κB的抑制希望获得血液肿瘤的耐药逆转,为难治性白血病的治疗探索一条新的道路.取不同终浓度的NF-κB抑制剂PDTC作用的,或者同一浓度作用不同时间后的K562/A02细胞,分别用免疫组织化学加计算机图像分析仪方法半定量检测每1份样本中NF-κB的活性和P-gp的表达,以及用反转录多聚酶链反应方法半定量检测每2份样本中mdrl的活性,通过统计学来分析mdr1、P-gP的表达是否与NF-κB的活化有关.结果表明:随着NF-κB抑制剂PDTC作用浓度的不断升高、作用时间的不断延长,K562/A02细胞NF-κB/p65的表达不断降低,P-gP和mdrl mRNA的表达也逐渐降低,而且三因子之间均有显著相关性.结论:通过对K562/A02细胞高表达的NF-κB的抑制可降低该细胞的mdrlmRNA和P-gP的表达,从而提高血液肿瘤细胞的放化疗敏感性.
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槲皮素和山柰酚逆转白血病细胞系K562/A02多药耐药性的机制及相关基因表达谱的研究
目的 研究槲皮素(quercetin,Que)及山柰酚(kaempferol,Kae)单用及联合应用时对K562/A02细胞系多药耐药的影响及机制.方法 体外培养K562和K562/A02细胞经Que及gae处理,采用噻唑蓝(MTT)法计算药物单独及联合作用后细胞的生长抑制率及对多柔比星(adriamycin,ADM)的增敏倍数;流式细胞术检测药物作用后细胞内ADM浓度的变化;Annexin V/PI法观察细胞凋亡情况;Real-time PCR基因芯片检测药物转运蛋白及凋亡相关基因表达的变化.结果 药物作用48 h后,Que及Kae在5～160 μmol·L-1时时K562和1062/A02细胞均有剂量依赖性的生长抑制作用,K562/A02对ADM的敏感性显著增强,二者联用效果有协同性;在ADM为5μmol·L-1时,药物与细胞共培养2 h即可检出Que能增加细胞内ADM的浓度,而Kae则对ADM浓度无明显影响,两药联合作用的效果不及Que单独作用.Que和Kae均可剂量依赖性地诱导K562和K562/A02细胞的凋亡.二者可影响ABC、SLC家族等药物转运蛋白相关基因的表达,并可调节Bcl-2、TNF等凋亡相关基因的表达.结论 Que和Kae可通过多种途径逆转K562/A02的多药耐药性,但二者的作用机制可能不完全相同.
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尼洛替尼诱导K562/A02细胞凋亡及对HO-1基因表达的影响
目的 研究尼洛替尼(nilotinib,AMN107)诱导K562/A02细胞凋亡及对血红素加氧酶-1(HO-1)基因表达的影响.方法 采用荧光原住杂交(FISH)法检测K562/A02细胞中的BCR-ABL融合基因;用不同浓度的AMN107分别处理K562/A02细胞24 h后,通过实时荧光定量PCR(RQ-PCR)法检测BCR-ABL融合基因mRNA的表达水平;采用MTT法观察细胞增殖变化;通过An-nexin V/PI双染色法检测细胞凋亡和细胞周期;采用RT-PCR法和Western Blot法检测HO-1基因的表达.结果 FISH法分析结果显示,K562/A02细胞BCR-ABL融合基因阳性细胞占细胞总数98%;RQ-PCR法检测结果显示,0,5,10,20 μmol·L-1 AMN107作用于K562/A02细胞24 h后BCR-ABL融合基因表达随AMN107浓度增加而逐渐下降;MTT法和Annexin V/PI法显示与对照组相比,细胞存活率随AMN107浓度升高而下降,凋亡率逐渐增加;细胞周期分析显示,经AMN107处理的细胞,G0/G1期和S期细胞明显减少,细胞阻滞在G2/M期;RT-PCR法和Western blot法均检测到HO-1基因表达随AMN107浓度升高而降低.结论 AMN107可抑制BCR-ABL融合基因和HO-1基因表达,从而诱导慢性粒细胞白血病(CML)耐药细胞的凋亡,说明HO-I是CML细胞生长以及BCR-ABL基因存在的一个相关因子,HO-1基因是克服慢性粒细胞白血病耐药的一个潜在靶向.
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复方浙贝颗粒联合阿霉素对K562/A02移植瘤抑瘤率影响研究
目的 观察复方浙贝颗粒联合阿霉素对多药耐药细胞K562/A02裸鼠移植瘤抑制率的影响.方法 将多药耐药K562/A02细胞接种于BALB/c-nu裸鼠腋前皮下构建移植瘤模型,分别测实验各组肿瘤体积,实验结束后处死小鼠,剥离肿瘤称重,并依据公式计算抑瘤率.结果 复方浙贝颗粒各剂量组的肿瘤、瘤重与空白对照组比较,有统计学意义(P<0.05);复方浙贝颗粒高、中剂量组肿瘤体积,瘤重与阿霉素对照组比较,有统计学意义(P<0.05).结论 复方浙贝颗粒(高、中剂量)伍用阿霉素能够明显增加阿霉素对多药耐药细胞(K562/A02)移植瘤杀伤的敏感性.
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纳米囊制剂对白血病多药耐药细胞影响的体外实验研究
目的 探讨纳米囊制剂对白血病多药耐药细胞的影响.方法 采用溶剂挥发法制备共载中药甘草酸(GA)及化疗药物柔红霉素(DNR)的纳米囊,将其分为P-gp Ab修饰共载中药GA及化疗药物DNR组(A组);P-gp Ab修饰装载DNR化疗药物组(B组);DNR化疗药物组(C组);DNR+GA组(D组);P-gp Ab修饰纳米囊空载组(E组);GA组(F组);生理盐水对照组(G组).采用体外四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法评价细胞毒作用(白血病多药耐药细胞K562/A02),采用流式细胞仪检测细胞凋亡的情况,采用化学发光自显影免疫印迹法(Western Blot)检测蛋白B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)的表达.结果 A组的K562/A02的半抑制浓度指数(IC50)为(3.65±1.06),其降低效果优于其他组(P<0.05).B组IC50为(3.12±0.96),低于C、D、F组的(0.95±0.04)、(0.96±0.03)、(0.94±0.05)(P<0.05).C、D、F组的耐药指数(RE)均接近1,故认为对K562/A02的细胞无增强耐药作用,也无毒性作用.E组和G组为对照组,检测到的细胞掉凋亡率较小,不计入比较.A组的细胞总凋亡率高于其他各组(P<0.05).B组的细胞凋亡率高于C、D、F组(P<0.05).A组的Bcl-2的表达低于其他各组,Bax的表达高于其他各组(P<0.05).E组和G组的Bcl-2表达均高于其他各组,Bax的表达均低于其他各组,差异均具有统计学意义(P<0.05).结论 纳米囊制剂对白血病多药耐药细胞具有细胞毒性,中药GA+化疗药物DNR具有明显的协同效果,其作用机制可能与上调Bax表达与下调Bcl-2有关.
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米非司酮逆转K562/A02细胞多药耐药的研究
目的 研究孕激素拮抗剂米非司酮对白血病多药耐药细胞K562/A02的逆转作用及其机制.方法 MTT法检测米非司酮作用72 h后K562/A02细胞增殖及其对阿霉素杀伤敏感性的变化;流式细胞术检测米非司酮作用前后K562/A02细胞表面P糖蛋白的表达和细胞内柔红霉素的浓度;免疫组化法观察米非司酮作用前后K562/A02细胞凋亡相关蛋白bcl-2、Bax、caspase-3的表达;RT-PCR检测米非司酮作用后对K562/A02细胞内葡萄糖神经酰胺合成酶(GcS)mRNA表达的影响.结果 2.5、5.0和10.0 μmol/L米非司酮不抑制K562/A02细胞的增殖,但上述浓度的米非司酮作用后K562/A02细胞对阿霉素的敏感性较前分别增强了1.68、4.17和10.71倍.K562/A02细胞表面P糖蛋白的表达为(49.03±5.32)%,10 μmol/L米非司酮作用72 h后降低到(28.60±2.13)%(P＜0.01);K562/A02细胞内柔红霉素的浓度为(61.07±8.61)%,而10 μmoL/L米非司酮作用后升高到(92.72±3.48)%(P＜0.01).经10 μmol/L米非司酮作用后,bcl-2蛋白表达由(56±9)%降低到(37±6)%(P＜0.05);Bax蛋白由(40±5)%升高到(87±10)%(P＜0.01);caspase-3蛋白则由(36±7)%升高到(89±6)%(P＜0.01).RT-PCR结果显示K562/A02细胞GcS mRNA的表达较K562细胞明显升高,10μmol/L米非司酮能明显降低K562/A02细胞内GcS mRNA的表达.结论 米非司酮可逆转白血病K562/A02细胞的多药耐药,且具有剂量依赖性.10 μmol/L米非司酮能明显逆转白血病K562/A02细胞的多药耐药,其机制与降低P糖蛋白的水平,调节凋亡相关蛋白bcl-2、Bax、caspase-3的表达,降低GcS mRNA有关.
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WT1基因表达下调对K562/A02细胞阿霉素敏感性的影响
目的 探讨WT1基因表达下调对人红白血病耐药细胞系K562/A02阿霉素敏感性的影响.方法 将WT1mRNA的短发夹RNA(short hair RNA,shRNA)构建至真核表达载体后转染K562/A02细胞,流式细胞术检测转染效率;荧光定量RT-PCR和Western blot法分析WT1基因在转染前后表达的差异;pWT1shRNA转染K562/A02细胞48 h并经阿霉素作用后,MTT法检测各组细胞阿霉素IC50值;流式细胞术检测细胞阿霉素累积量及细胞凋亡率.结果 与未转染对照组及空载体组相比,转染WT1shRNA质粒的K562/A02细胞WT1mRNA和蛋白水平均明显降低;经阿霉素诱导24 h后,其对阿霉素的敏感性明显增高,相对逆转率为71.5%,细胞内阿霉素的累积量较各对照组明显增高(P值均<0.05),细胞凋亡率明显升高(P<0.05).结论 靶向WT1shRNA干扰质粒可有效抑制K562/A02细胞WT1基因表达,增强K562/A02细胞对阿霉素的敏感性.
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姜黄素、红霉素逆转K562/A02细胞多药耐药机制的研究
目的研究姜黄素(curcumin,Cur)及红霉素(erythromycin,EM)对多药耐药(MDR)细胞株K562/A02的影响及作用机制.方法MTT法测定Cur、EM作用后K562/A02细胞对阿霉素(ADM)敏感性的变化.流式细胞仪测定细胞内柔红霉素的平均荧光强度(DNR MFI).免疫组化法检测细胞膜上P-gp的表达.RT-PCR法检测细胞mdr1 mRNA水平.结果Cur、EM均可减低ADM对K562/A02细胞的IC50值,两药合用时逆转倍数可达11.3倍.K562/A02细胞内DNR MFI明显低于K562细胞(P＜0.01),Cur、EM均可明显增加K562/A02细胞内DNR MFI(P＜0.05),以两药合用时作用为明显,Cur 2.5μg/ml处理组细胞内DNR MFI略高于EM 120μg/ml处理组,但差异无统计学意义(P＞0.05).免疫组化检测结果显示K562/A02细胞P-gp表达明显高于K562细胞(P＜0.01),各组药物分别处理后,K562/A02细胞膜P-gp表达减低(P＜0.01),但仍高于K562细胞(P＜0.01);各药物组处理5 d细胞膜P-gp表达均低于3 d组(P＜0.01),Cur与EM合用时细胞膜P-gp表达降低为明显,低于其它处理组(P＜0.01).RT-PCR结果显示K562/A02细胞mdr1 mRNA水平明显高于K562细胞(P＜0.01),各组药物处理后,K562/A02细胞mdr1 mRNA水平均减低(P＜0.01),5 d组低于3 d组,但仍高于K562细胞(P＜0.01);Cur与EM合用时K562/A02细胞mdr1 mRNA水平降低为显著,Cur 2.5μg/ml处理5 d K562/A02细胞mdr1 mRNA水平低于EM 120μg/ml处理5 d组(P＜0.01).结论Cur、EM均可部分逆转K562/A02细胞的MDR,降低其P-gp的表达和功能,逆转作用有时间依赖性;两药联合应用时逆转作用明显增强,Cur 2.5μg/ml逆转作用略强于EM 120μg/ml.
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mdr1和GSTπ基因缄默逆转K562/A02细胞多药耐药性的研究
目的研究短发夹状小分子干扰RNA(short hairpin RNA,shRNA)对白血病多药耐药细胞株K562/A02 mdr1和谷胱甘肽S-转移酶(GST)π基因的表达和功能的影响.方法根据mdr1mRNA第79～99位和GSTπ mRNA第308～327位核苷酸为作用靶点,合成针对靶区域序列的shRNA,克隆入pSilencer2.1-U6 neo,克隆产物为pSilence-mdrl和pSilence-GSTπ,转染K562/A02细胞株.用实时荧光定量PCR检测K562/A02细胞mdr1和GSTπ mRNA的表达;MTT法检测阿霉素对K562/A02细胞半数抑制浓度(IC50).结果经pSilence-mdr1转染后的K562/A02细胞mdr1 mRNA表达量下降了71.5%,从(2.80±1.65)×108拷贝/μgRNA下降至(3.90±2.37)×107拷贝/μg RNA(P＜0.01);同时pSilence-GSTπ作用后,K562/A02细胞GSTπ mRNA表达量较对照组下降了39.8%,从(2.30±1.14)×105拷贝/μg RNA下降至(5.40±2.45)×104拷贝/μg RNA(P＜O.01);空载体转染后阿霉素的耐药指数为23,pSilence-mdr1转染后为8,pSilence-GSTπ转染后为10,差异有统计学意义(P＜0.01).结论shRNA可有效逆转K562/A02细胞mdr1和GSTπ的多药耐药性.
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源于细菌DNA的寡核苷酸对K562/A02细胞来源的树突细胞促成熟作用
目的 研究源于细菌CpG基序的寡核苷酸和含细菌短磷酸二酯骨架的寡核苷酸对K562/A02细胞来源的树突细胞(DC)的促成熟作用.方法 联合应用细胞因子rhGM-CSF和rhIL-4诱导K562/A02细胞成为DC.7 d后以瑞特-姬姆萨染色观察细胞形态的变化,流式细胞术检测细胞免疫表型的变化,用同种混合淋巴细胞反应、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性检测、IL-12和IL-6的分泌实验评价DC的成熟程度.然后在DC中分别加入源于细菌CpG基序的寡核苷酸CpG2006以及含细菌短磷酸二酯骨架的寡核苷酸A-ODN和T-ODN,处理3 d后再次检测该DC成熟度.结果 K562/A02细胞可在细胞因子rhGM-CSF和rhIL-4联合作用下分化成为DC,免疫表型检测发现CD83、HLA-DR和CD86分子的表达分别为(65.5±8.4)%、(32.0±4.3)%和(18.6±3.2)%,经CpG2006作用后表达升高到(88.9±3.6)%、(53.9±3.2)%和(39.9±7.3)%;经A-ODN作用后升高到(97.0±5.3)%、(63.9±7.3)%和(40.2±7.4)%;经T-ODN作用后升高到(93.3±4.6)%、(58.3±5.6)%和(36.2±6.8)%,与作用前相比差异均有统计学意义.经CpG2006、A-ODN和T-ODN作用后具有典型DC形态的细胞增多.上述3种寡核苷酸处理的DC均可刺激T细胞产生较强的增殖效应、诱导产生的CTL对靶细胞K562/A02的杀伤率明显增强,IL-6和IL-12分泌明显增高.结论 源于细菌CpG基序的寡核苷酸以及含细菌短磷酸二酯骨架的寡核苷酸对白血病源性DC有促成熟作用.
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HMGB1基因沉默对阿霉素诱导K562/A02细胞凋亡增敏作用的研究
目的 探讨高迁移率族蛋白1(HMGB1)基因沉默对白血病细胞耐药逆转的作用.方法 将HMGB1基因特异性干扰RNA(HMGB1 siRNA)导入K562/A02细胞中,通过Western blot和RTPCR方法检测HMGB1基因在转染前后的表达;WST8法检测阿霉素(ADM)对转染前后K562/A02细胞的半数抑制浓度(IC50);流式细胞术检测凋亡细胞百分率;Western blot检测线粒体促凋亡蛋白Smac/DIABLO的释放;采用caspase活性定量检测试剂盒分析caspase-3的活性.结果 ①与未经处理的K562/A02细胞组相比,转染HMGB1 siRNA的K562/A02细胞组HMGB1 mRNA和蛋白水平分别下降86%和71%;②HMGB1基因沉默使K562/A02细胞对ADM的药物敏感性增强,其IC50值从转染前的(4.83±0.08)μg/ml降低到(1.33±0.10)μg/ml,并在ADM浓度为1μg/ml和5μg/ml时,细胞凋亡百分率分别增加27%、32%;③HMGB1基因沉默可促进ADM所致Smac/DIABLO从线粒体向胞浆释放,并增加caspase-3的活性.结论 HMGB1基因沉默能明显增加K562/A02细胞对ADM的敏感性,逆转K562/A02细胞对ADM耐药.
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WAVE1基因在K562/A02白血病细胞多药耐药中的作用
目的 探讨WASP家族Verprolin同源蛋白1(WAVE1)基因在K562/A02白血病细胞多药耐药机制中的作用.方法 将pEFBOS-WAVE1真核表达质粒转染K562细胞构建WAVE1高表达的K562细胞,将WAVE1基因的特异性小片段干扰RNA(WAVE1 siRNA)转染K562/A02细胞构建WAVE1低表达的K562/A02细胞.Western blot和RT-PCR法检测基因转染前后K562/A02细胞及K562细胞WAVE1基因及蛋白的表达;可溶性噻唑盐WST-8染色法检测阿霉素对转染前后细胞的半数抑制浓度(IC50);Hoechest33258染色法检测细胞形态学改变并计算凋亡细胞百分率;RT-PCR检测多药耐药基因mdr1 mRNA表达;Western blot检测Bcl-2表达.结果 ①与K562细胞相比,K562/A02细胞WAVE1 mRNA表达水平增加70%,蛋白表达水平增加63%.②转染WAVE1基因的K562细胞WAVE1过表达,并降低了对阿霉素的药物敏感性,使IC50从转染前的(0.05±0.00)μg/ml,增加到(2.99±0.12)μg/ml,在阿霉素浓度为1、5 μg/ml时,凋亡细胞分别下降30%、35%.③转染WAVE1siRNA的K562/A02细胞WAVE1蛋白表达水平与未转染组相比明显降低,并可增强对阿霉素的药物敏感性,使IC50从转染前的(4.29±0.15)μg/ml下降到(1.85±0.07)μg/ml,阿霉素浓度为1、5 μg/ml时,凋亡细胞分别增加24%、21%.④转染WAVE1的K562细胞mdr1基因和Bcl-2蛋白表达水平均增高,而转染WAVE1 siRNA的K562/A02细胞mdr1基因和Bcl-2蛋白表达水平比转染前明显降低.结论 WAVE1参与了K562/A02细胞多药耐药的形成,其机制可能与调控mdr1和Bcl-2水平有关.
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联合转染mdr1和mcl1基因短发夹RNA干扰表达质粒逆转K562/A02细胞耐药的实验研究
目的构建针对mdr1和mcl1基因的短发夹RNA(shRNA)干扰表达质粒,并探讨联合转染对K562/A02细胞耐药的逆转作用.方法根据mdr1和mcl1基因表达序列设计有效的RNA干扰片段,分别将其构建入质粒表达空载体中,以获得两种基因特异性shRNA干扰表达质粒;然后在脂质体介导下分别和联合转染K562/A02细胞,用G418和(或)Hygro B筛选出稳定表达的细胞克隆.用RT-PCR分析mdr1和mcl1 mRNA的表达;MTT法检测阿霉素对K562/A02细胞的半数抑制浓度(IC50);流式细胞术测定细胞P-糖蛋白表达水平以及细胞凋亡率.结果成功构建两个基因的shRNA干扰表达质粒.mdr1、mcl1 shRNA干扰表达质粒单独和联合转染K562/A02细胞可有效封闭相应基因表达,联合转染组mdr1基因和mcl1基因的mRNA相对表达水平分别是未转染细胞的52%,44%.mdr1、mcl1 shRNA干扰表达质粒单独和联合转染后K562/A02细胞耐药逆转率分别为63.8%,71.1%,83.1%,转染两种质粒组对K562/A02细胞耐药逆转率高,P糖蛋白相对表达量由未转染组的19.70±1.15降至6.40±0.92(P《0.01),阿霉素诱导的细胞凋亡率由(1.53±0.42)%提高至(7.77±0.42)%(P《0.01).联合转染两种质粒组和单独转染组比较,细胞对阿霉素敏感性和阿霉素诱导的细胞凋亡率差异亦有统计学意义(P《0.05).结论转染mdr1或mcl1基因的shRNA干扰表达质粒可有效抑制相应基因表达,皆不同程度逆转K562/A02细胞对阿霉素的耐药性;联合转染两种质粒可显著增加逆转耐药的效果.mcl1基因可能与K562/A02耐药相关.
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蝎毒多肽对白血病干细胞 MDR1 mRNA和P－gp表达的影响
目的：探讨蝎毒多肽（ PESV）对多药耐药白血病干细胞MDR1 mRNA和P－gp表达的影响。方法：以K562／A02细胞株为例，免疫磁珠法分选对数生长期细胞后经CCK－8法确认其耐药性，将耐药的K562／A02干细胞接种于BABL／c裸鼠右腋下形成瘤块，再将瘤块皮下包埋建立耐药性稳定的白血病模型。成模裸鼠随机分为6组：模型对照组、ADM组、PESV组、ADM＋高剂量PESV组（高剂量组）、ADM＋中剂量PESV组（中剂量组）和ADM＋低剂量PESV组（低剂量组）。模型对照组给予等体积0．9％氯化钠溶液腹腔注射，其余组予相应剂量ADM和（或） PESV腹腔注射，连续给药14天。第21天观察各组裸鼠移植瘤生长情况，流式细胞术检测各组瘤组织P－gp表达， RT－PCR法检测各组瘤组织MDR－1 mRNA表达水平。结果：K562／A02细胞经免疫磁珠分选前后的CD34＋CD38－细胞比率和耐药率分别为31．5％、（60．33±10．68）μg／mL，92．8％、（58．33±9．72）μg／mL，分选后细胞干性显著提高，而耐药性无差异性损失。各组造模小鼠成瘤率100％， P－gp表达结果显示模型对照组89．8％、ADM组91．9％、PESV组88．4％、高剂量组53．9％、中剂量组78．0％、低剂量组78．7％，PESV＋ADM下调P－gp表达，并与PESV呈现浓度依赖关系。 MDR1 mRNA的表达量PESV组＞低剂量组＞高剂量组＞中剂量组＞ADM组，其中PESV组、中剂量组、低剂量组高表达，P－gp表达与MDR1 mRNA水平具有一定的一致性。结论：PESV降低ADM作用K562／A02干细胞耐药性的强度，并与PESV剂量呈现正相关，其机制可能为PESV通过调控P－gp和MDR－1 mRNA的表达，增强了K562／A02干细胞对ADM的敏感度。
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三氧化二砷对K562/A02细胞的凋亡及细胞周期的影响
目的:研究三氧化二砷对多药耐药急性白血病细胞株K562/A02凋亡与细胞周期的影响及可能机制.方法:取阿霉素(Adr)的耐药白血病细胞株分为未加药的对照组及加入不同浓度的三氧化二砷(其终浓度为4.0μmol/L、5.0μmol/L)组,流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期分布,Western blot方法检测不同浓度三氧化二砷对K562/A02细胞核NF-κ Bp65蛋白水平.结果:与对照组比较,三氧化二砷可显著增加Adr对K562/A02细胞凋亡率,阻滞细胞于G0/G1期,降低K562/A02细胞胞核中NF-kB p65的表达(P均＜0.05).结论:三氧化二砷可能是通过抑制NF-kB的胞内活化转位,从而促进K562/A02细胞凋亡及抑制细胞增殖.
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干扰α烯醇化酶对耐药细胞株K562/A02耐药性的影响
目的：肿瘤耐药的产生是肿瘤治疗失败的主要原因之一,α烯醇化酶( eno1)与肿瘤细胞耐药产生和发展密切相关。探究eno1对人慢性粒细胞白血病耐药细胞株 K562/A02生长及耐药的影响。方法筛选3株稳定干扰eno1的细胞系K562/A02-sheno1和对照细胞系K562/A02-shcon；采用细胞计数法测定细胞生长速率, MTT法测定细胞增殖能力,细胞内罗丹明123含量测定细胞外排药物能力,real-time PCR反应测定基因mRNA表达水平, Western blot实验测定基因蛋白表达水平。结果与敏感性细胞株 K562相比, eno1在耐药细胞株K562/A02中为高表达状态,其在mRNA水平和蛋白水平表达分别增高(2．85±0．56)倍和(1．43±0．05)倍；而K562/A02细胞生长速率与K562细胞相比差异无显著性。 K562/A02-sheno1细胞系与对照组 K562/A02-shcon相比生长速率降低,对抗肿瘤药物紫杉醇和阿霉素的敏感性均增强,且K562/A02-sheno1细胞系中罗丹明123含量也明显增高。 K562/A02-sheno1细胞系中耐药相关基因MDR1表达水平降低。结论稳定干扰 eno1表达能抑制K562/A02细胞生长,有效逆转K562/A02细胞耐药性,提高其对药物的敏感性,其机制与MDR1基因表达相关。
