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人参皂苷Rg1对人神经干细胞功能表达的膜片钳研究
目的:观察人参皂苷Rg1诱导人神经干细胞(neural stem cells of human,hNSCs)的功能表达.方法:采用全细胞膜片钳技术分析人参皂苷Rg1诱导hNSCs分化7d时,神经元样细胞的膜电生理特性以及钠、钾离子通道的功能表达.结果:人参皂苷Rg1(20 mg·L-1)诱导hNSCs分化7d时,神经元样细胞的膜静息电位为(-45.70 ±2.63)mV,膜电容为(26.89±1.91) pF,膜输入阻抗为(877.51±20.44) MΩ(与对照组相比均P<0.05);电压依赖性的快速激活、快速失活的内向Na+电流,检出率50%,平均峰值为(711.48±158.03) pA(与对照组相比P<0.05);外向K+电流的主要成分是快速激活快速失活的瞬时外向K+电流和延迟整流外向K+电流,其平均峰值为(1 070.42±177.18) pA(与对照组相比P<0.05).结论:人参皂苷Rg1可以促进hNSCs功能表达和成熟.
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基因芯片技术筛选人参皂苷Rg1促进人神经干细胞增殖的分子靶点研究
目的:采用基因芯片技术筛选出人参皂苷Rg1促进入神经干细胞(neural stem cells,NSCs)增殖的主要分子靶点.方法:首先通过MTT法筛选出Rg1促进NSCs增殖的佳作用质量浓度为120 mg·L-1.然后通过基因芯片技术,观察Rg1促其增殖7d时靶基因表达,通过数据演算筛选出Rg1促进NSCs增殖的主要的靶基因和信号转导途径.结果:在Rg1促进NSCs增殖第7天时,获得差异基因440个,其中显著上调的基因266个,显著下调的基因174个;HES1基因和CAMP(环磷酸腺苷)-PKA(蛋白激酶A),PI3K(磷脂酰肌醇-3激酶)-AKT信号传导通路与Rg1促进入NSCs增殖密切相关.结论:基因芯片筛选出的差异表达基因可能为研究Rg1促进NSCs增殖的分子机制研究提供线索.
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构建芯片技术探讨人参皂苷Rg1促进人神经干细胞分化的机制
目的:采用基因芯片技术筛选出入参皂苷Rg1促进NSCs分化的主要分子靶点.方法:通过基因芯片技术,观察Rg1诱导人神经干细胞(neural stem cells,NSCs)向神经元分化7d时靶基因表达,通过数据演算筛选出Rg1促进NSCs分化的主要的靶基因和信号转导途径,然后采用Western blot和免疫组化的方法对其中的ERK信号分子进行验证.结果:在Rg1诱导NSCs分化第7天时,获得差异基因675个,其中显著上调的基因255个,显著下调的基因420个;MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)通路中的ERK1/2(细胞外信号调节蛋白激酶)信号分子与NSCs分化直接相关.经Western blot和免疫组化证实,在Rg1诱导NSCs分化中,ERK1/2蛋白明显上调,磷酸化水平也明显增强,此作用能够被PD98059(ERK1/2阻断剂)所阻断,同时PD98059也可以明显阻断NSCs的分化.结论:ERK1/2是人参皂苷Rg1促进NSCs分化的重要分子靶点.基因芯片筛选出的差异表达基因可能为研究Rg1促进NSCs分化的分子机制提供线索.
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白介素-1α及与白介素-11、白血病抑制因子和胶质细胞源性神经生长因子联合诱导人神经干细胞向多巴胺神经元的分化
目的探讨细胞因子白介素-1α(IL-1α)及与白介素-11(IL-11)、白血病抑制因子(LIF)和胶质细胞源性神经生长因子(GDNF)联合应用对体外诱导人神经干细胞定向分化为多巴胺神经元的影响.方法采用无血清培养技术和单细胞克隆技术、免疫荧光双标技术.结果对照组仅有极少量的神经干细胞分化为不成熟的多巴胺神经元;IL-1α组分化的多巴胺神经元较多,但细胞形态欠成熟;联合因子组分化的多巴胺神经元多,细胞较为成熟. 结论IL-1α具有诱导人神经干细胞向多巴胺神经元分化的作用,联合应用IL-1α、IL-11、LIF和GDNF对人神经干细胞向成熟的多巴胺神经元分化具有协同作用.
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人神经干细胞治疗小儿脑瘫的临床安全性研究
目的:探讨人神经干细胞临床治疗小儿脑瘫的安全性.方法:对28例脑瘫患儿采用立体定向移植的方法,将培养好的、符合需要的入神经干细胞移植入患儿额叶、内囊前肢或脑室旁等脑实质处.比较手术治疗前后患儿的血常规常用指标、肝肾功能、出凝血时间以及体温、血压、精神状态等一般情况有无差异.结果:脑瘫患儿治疗前后红、白细胞总数、血红蛋白、血小板、总蛋白、尿素氮、肌酐以及出凝血时间、体温、血压等比较,差异均无统计学意义(P>0.05).结论:神经干细胞治疗小儿脑瘫的临床应用是安全可行的.
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NOV对人神经干细胞增殖和分化的影响
目的探讨NOV蛋白对人神经干细胞(HNSCs)增殖和分化的影响.方法NOV基因重组质粒转染COS-7细胞,收集COS-7细胞和NOV基因修饰COS-7细胞的条件培养液(COS-CM和NOV-CM),作用于培养的HNSCs,3H-TdR掺入液闪检测HNSCs的增殖,免疫细胞化学和流式细胞仪检测HNSCs的分化.结果(1)NOV-CM能明显促进HNSCs对3H-TdR的摄入,说明NOV-CM能明显促进HNSCs的增殖,另外NOV-CM的促细胞增殖作用具有一定的量效关系;(2)免疫细胞化学和流式细胞仪结果显示,NOV-CM促进HNSCs向神经元方向分化.结论NOV蛋白可能具有促进HNSCs增殖和分化的作用.
关键词: 肾母细胞瘤过度表达基因 人神经干细胞 增殖 分化 -
切割海马伞大鼠海马自然凝胶电泳差异蛋白条带诱导神经干细胞迁移的作用/非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析切割海马伞大鼠海马组织蛋白/人神经干细胞向多巴胺神经元的定向分化
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高-低密度法分离培养大胚龄人神经干细胞
目的从大胚龄人胚脑中分离培养并鉴定神经干细胞.方法采用高-低密度培养、无血清培养和单细胞克隆技术分离培养出神经干细胞,并应用免疫荧光染色鉴定.结果从13周龄胚脑中成功分离出具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞,它们具有连续克隆能力,可传代培养,表达神经巢蛋白抗原,分化后的细胞表达神经元细胞、胶质细胞和少枝胶质细胞的特异性抗原.结论高-低密度培养法能成功地分离和培养大胚龄人神经干细胞.
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世界首例成人神经干细胞自体移植成功/让狂跳的心脏安稳下来/"生育能力检测仪"问世/皮肤病诊疗取得新进展/过度紧张影响手术效果/"开枪"为你治病/德发明脑瘤早期快速诊断法/反复腰穿放液可治丘脑出血/人造心脏可以独立运行了
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干细胞移植:医学临床应用创奇迹(二)
脑部疾病世界首例成人神经干细胞自体移植治疗脑损伤手术在上海复旦大学附属的华山医院获得成功.<今晚报>于2001年6月24日报道了这一消息.患者是一位40岁的女性,被锐器刺入脑内深达10公分,造成了严重的颅内伤,不久出现了精神症状和定向障碍,认知能力受到明显的影响.移植手术后,病人恢复平稳,逐步可以从事细致的动作.
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神经干细胞的分离培养及体外分化
目前,脊髓损伤的修复和治疗,仍然是一个难以解决的世界性难题.虽然在动物实验中已取得了一些令人鼓舞的进展,但至今未找到一种能用于临床的有效方法.神经干细胞(neura l stem cells, NSCs)的发现为中枢神经系统(central nervous system, CNS)损伤修复及某些疾病的治疗带来了新的希望.因其具有很强的分裂、增殖和自我更新能力,人们把它视为中枢神经系统移植和替代治疗的理想材料.近年来神经干细胞的研究作为生命科学界的热点受到广泛关注.本文就神经干细胞的分离、培养及其体外分化作一综述,重点在于人神经干细胞的研究 .
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Hes1基因对人γ-氨基丁酸能神经元分化的影响
目的 观察单因素抑制Hes1基因的表达对人神经干细胞诱导分化为γ-氨基丁酸(GABA)能神经元分化率的影响.方法 对人神经干细胞进行原代培养,传代(神经干细胞5~7d传代1次).取传至第2代的神经干细胞进行神经元巢蛋白免疫荧光鉴定,证明其为神经干细胞后进行GABA能神经元的诱导分化.采用完全随机分组原则将第二代神经干细胞分为对照组和实验组.对照组为含胎牛血清的普通诱导分化液,实验组除加入抑制Hes1基因的寡核苷酸链外,其余成分同对照组相同.待诱导分化结束后分别对实验组及对照组进行GABA能神经元免疫荧光染色鉴定.结果 诱导分化后第6天,约半数以上细胞开始分化并出现汇聚现象,重新消化接种,第14天镜下可见90% ~ 95%细胞已贴壁完成分化.进行GABA能神经元免疫荧光染色鉴定,随机选取10个视野,实验组每个视野下在100个细胞中可见55 ~ 70个GABA阳性细胞,分化率可达(64.0±0.6)%,而对照组在同样情况下仅可见15 ~ 20个GABA阳性细胞,分化率仅为(16.6±0.6)%,两者比较差异有统计学意义.结论 抑制Hes1基因的表达可以显著提高入神经干细胞诱导分化为GABA能神经元的分化率.
关键词: Hes1基因 人神经干细胞 γ-氨基丁酸能神经元 诱导分化 -
新生鼠缺氧缺血性脑损伤后不同途径人神经干细胞移植的实验研究
缺血缺氧性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)是儿科常见导致中枢神经系统后遗症的原因,目前无特效治疗.近年来神经干细胞(neural stem cells,NSCs)移植治疗缺血缺氧性脑损伤的实验研究已见报道,其中成年动物神经干细胞移植的研究已有较长时间,相比之下,儿科相关研究很少,有限的新生动物神经干细胞移植研究结果表明,新生动物移植内环境明显优于成年动物,能取得较成年动物好的移植效果,为此我们进行了人神经干细胞经海马和脑室两种不同途径移植至缺氧缺血性脑损伤的新生鼠脑中的实验研究,目的是比较两种不同途径移植的效果,探索佳移植途径,为神经干细胞移植终应用于临床提供理论依据.现报告如下.
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人神经干细胞的研究现状及应用前景
人神经干细胞(HNSCs)可从胚胎和成年人中枢神经系统(CNS)成功分离并培养,具有自我更新和多分化潜能,经体外诱导或植入体内后均能分化为成熟神经元和神经胶质细胞,为多种CNS疾病特别是神经变性病的功能重建和神经再生提供了新的途径.本文就HNSCs的来源、分布、增殖和分化的调控因素以及治疗CNS疾病的应用前景作一综述.
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先天性巨结肠症神经干细胞移植研究进展
先天性巨结肠症(Hirschsprung disease,HSCR 或HD,也称先天性肠无神经节细胞症或先天性肠神经节细胞缺乏症)是一种以肠道末端肠壁和肌间神经丛副交感神经节细胞完全缺如为特征的消化道发育畸形.手术是治疗HD的首选方式,但存在术后近、远期并发症.有学者根据HD形成的机理,提出通过植人神经干细胞的方法,在外界刺激干预下,使神经干细胞在病变部位重新分化形成神经元和神经节细胞,达到治愈HD的目的.本文就神经干细胞移植研究进展综述如下.
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3~18周胎龄人胚胎神经干细胞的分离、培养及增殖
目的:在分离、纯化、培养3~18周胎龄人胚胎神经干细胞(NSC)的基础上,进一步研究3~18周胎龄NSC的增殖特点.方法:从3~18周龄流产人胚胎的大脑皮质和神经管组织中分离NSC,实验分组:A组(3~6周龄),B组(7~11周龄),C组(12~18周);培养、纯化NSC;以单细胞克隆实验及免疫细胞化学对其进行生物学特性鉴定;计数神经球数目、直径检测其生长情况.结果:从3~6周流产人胚胎大脑皮层和神经管组织中以及7~18周的人胚胎大脑皮层中均分离获得了可在体外生存增殖的NSC,经鉴定,该类细胞在生长方式、形态结构、功能特征、表面标志等方面,均具有典型NSC的生物学特征;A组人胚胎NSC的神经球数目和直径均大于B、C组(P<0.05).结论:3~18周胎龄组NSC的增殖能力均随胎龄的增加而逐步减弱.
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MPTP诱导人神经干细胞衰老模型的建立
目的:建立MPTP诱导的人神经干细胞(hNSCs)衰老模型,探讨其衰老的相关生物学特点,从而为人神经干细胞衰老的研究提供细胞模型工具.方法:人胚胎干细胞系(H9)经体外诱导分化得到hNSCs,将第3代细胞接种到培养皿.在完全培养基基础上加入终浓度400 μmol/L的MPTP处理24h,处理结束后通过CCK8和Ki67染色、β-半乳糖苷酶染色、活性氧水平检测验证神经于细胞衰老模型的建立,应用Western Blot法检测相关基因SOD2,p21和p53的表达变化.结果:400 μmol/L MPTP作用24h后,hNSCs提前衰老,表现为CCK8光密度值显著下降,ki67阳性细胞比例显著下降,β-半乳糖苷酶阳性细胞百分比显著升高,细胞活性氧水平显著升高.进一步在分子水平上表现为SOD2蛋白表达水平明显下降,p21,p53蛋白表达水平显著升高.结论:本研究证实400 μmol/L MPTP作用24h可建立人神经干细胞体外衰老模型,该模型的生物学变化可能是由SOD2,p21,p53的表达水平引起的.
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海马中56kD蛋白诱导人神经干细胞向神经元分化的作用
在已证明切割海马伞海马中差异表达的56 kD蛋白具有诱导神经干细胞迁移作用的基础上,进一步探讨其诱导神经干细胞向神经元和AChE阳性神经元分化的作用.取切割SD大鼠海马伞后14 d及正常海马组织的匀浆进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE).将用无血清培养技术获取的人胚神经干细胞球分别与切割海马伞后14 d和正常海马56 kD差异蛋白的胶条及空白对照胶条共培养,在倒置显微镜下观察神经干细胞球中细胞的迁移和分化情况,于第21 d分别应用MAP-2免疫荧光和AChE组织化学方法检测人神经干细胞分化为神经元和AChE阳性神经元的情况,并进行神经元的计数、细胞面积、细胞周长的图像处理和统计学分析.结果显示,分化的MAP-2阳性神经元的数量、细胞面积及细胞周长三项指标切割组好,正常组次之,而空白对照组差;三组AChE组织化学染色均为阴性结果.上述结果提示切割海马伞后海马中差异表达的56 kD蛋白具有诱导神经干细胞向MAP-2阳性神经元分化的作用,但不能诱导神经干细胞向AChE阳性神经元分化.
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海马中56kD蛋白诱导人神经干细胞迁移的作用
为了探讨切割海马伞后的海马和正常海马在蛋白表达方面的差异,获取海马中具有生物活性的特异蛋白,并观察其对人胚神经干细胞迁移的影响,取切割SD大鼠海马伞后10、14、20 d及正常海马进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE).将用无血清培养技术获取的人胚神经干细胞球分别与切割海马伞后14 d海马和正常海马的56 kD差异蛋白胶条及空白对照胶条共培养,观察神经干细胞球中神经干细胞迁移情况,第3 d时计数朝胶条方向1/4扇区内的迁出细胞数.结果显示,切割后各天组和正常组比较见多条差异蛋白条带,其中56 kD差异蛋白的密度积分正常组低,10 d组和20 d组较高,14 d组高.神经干细胞球中向56 kD差异蛋白胶条方向迁移的细胞数在切割组多,正常组次之,对照组少.提示切割海马伞后的海马与正常海马间存在多种差异蛋白,其中56 kD蛋白在切割海马伞后14 d表达量高,并具有诱导神经干细胞迁移的作用.
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人胚神经干细胞体外长期培养系统的建立
目的建立人胚神经干细胞的体外长期培养系统并研究其生物学特性.方法从胚龄为20周的人胚胎皮质组织分离出神经干细胞,连续传代培养并检测生长曲线,测定长期培养对细胞周期和细胞分化及冻存的影响.结果体外培养神经干细胞达到了10个月,传代25代,总的细胞数增加了105倍.干细胞只有培养1个月后才能有效去除前体细胞.细胞周期显示细胞保持了活跃的增殖,多次传代后细胞冻存对细胞的存活力无明显影响,多向分化潜力表现出稳定性.结论人神经干细胞可于体外长期培养,这也是细胞纯化的有效方法.