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一种新的干扰素基因刺激因子剪接异构体STING(sv)的结构和功能
干扰素基因刺激因子(Stimulator of interferon genes,STING)是病毒感染后机体抗病毒固有免疫反应过程中的重要蛋白分子.为了寻找STING新的剪接异构体,我们抽提了人类胚胎肾(Human embryonic kidney,HEK)293细胞RNA,用全长STING的mRNA(NM-198282.82)序列设计引物,作cDNA末端快速放大(RACE)及RT-PCR,生物信息学方法比较新序列,亚克隆STING野生型(wt)及STING剪接异构体(sv)至真核表达载体pEGFP-C1和pcDNA 3.1中.质粒EGFP-STING(wt)和EGFP-STING(sv)转染HEK 293细胞,用抗EGFP抗体作Western blot分析;质粒pcDNA-STING(wt)和pcDNA-STING(sv)转染HEK 293细胞,作荧光素酶功能分析以检测新剪接异构体对病毒诱导的干扰素β启动子荧光素酶活性的影响.我们发现了STING 3'端新的剪接异构体,与野生型相比,它缺失了第7外显子,导致阅读框架移位,相应蛋白质的C端30个氨基酸不同于野生型.Western blot出现相对分子质量(Mr)为58×103的STING(sv)蛋白强阳性条带.STING(sv)荧光素酶功能分析显示,该剪接异构体能明显抑制病毒诱导的干扰素β启动子活性.STING(sv)在多数组织和不同细胞系中都能表达.STING(sv)的发现为STING这一重要分子的功能调节提供了新的线索,它可能是病毒感染通路中干扰素的显性负性抑制剂,提示其为干扰素产生的精细调节成分,在人类病毒感染性疾病中的病理意义值得探究.
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一种新的干扰素调节因子拼接异构体IRF-3b的结构及功能
目的干扰素调节因子(interferon regulatory factors, IRF)3是病毒感染后调节干扰素基因转录重要的转录因子,寻找IRF-3新的基因拼接异构体, 研究其结构及功能. 方法抽提人类细胞RNA,用IRF-3已发表序列设计引物,作cDNA末端快速放大(RACE)及RT-PCR,生物信息学方法比较新序列,亚克隆IRF-3b至pcDNA3.1-flag,转染人胚胎肾上皮293细胞,用抗flag抗体作Western blot分析,用荧光素酶功能分析的方法观测IRF-3b对病毒诱导的干扰素β启动子荧光素酶活性的影响. 结果发现了一种新的IRF-3拼接异构体IRF-3b,IRF-3b用了紧接第七外显子前的16个第六内含子的碱基,导致阅读框架移位,相应蛋白质的C端第328～452位为不同于IRF-3的新C末端.Western blot出现预期的相对分子质量(Mr)为57.75×103的IRF-3b蛋白强阳性条带.新的外显子序列可在小鼠的表达序列标签(EST)表达库中找到同源序列,提示这种新的异构体在生物演进中有其保守功能,IRF-3b荧光素酶功能分析显示,该同分异构体能抑制病毒诱导的干扰素β启动子活性至对照组的40%～50%. 结论新的异构体的发现为IRF-3这一重要分子的功能调节提供了新的线索,它可能是病毒感染通路中干扰素的显性负性抑制剂,提示其功能为干扰素产生的精细调节成分,可防止干扰素的过度产生,它们在人类疾病中的病理意义值得进一步探讨.
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心理应激诱导原癌基因表达
20世纪80年代末,以c-fos/c-jun为代表的"原癌基因(proto-oncogens)"或"即刻早期基因 (immediate early genes ,IEG)"在神经和行为科学研究中开始被注意,因为其参与细胞的生长、分化、神经功能可塑性改变以及学习和记忆等多种生理和行为过程,不同生理心理刺激均可诱导原癌基因的表达[1, 2],具有对细胞外刺激的快速诱导性的特点.心理应激是机体通过认识、评价而察觉到应激源的威胁时所引起心理生理机能改变的过程,与神经内分泌-免疫系统之间有复杂的相互联系,原癌基因可由于心理应激等活动而进行转录、翻译,表达以Fos/Jun为主的核蛋白,然后返回核内参与组成对其它靶基因转录调节的"转录因子" .目前,检测fos和jun蛋白及用同位素标记原癌基因的DNA核酸片段的原位分子杂交,已成为研究心理应激的一个重要手段[ 3-5 ].本文期望能引起运动生理界的注意,为研究如何提高优秀运动员的心理素质,从而延长其运动生涯甚至寿命提供启发.
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靶向Cdc的42基因microRNAs在肿瘤中的研究进展
Ras相关GTP酶超家族包括约150个小单体鸟嘌呤核苷酸结合蛋白成员，主要包括5个亚家族：Rho、Ras、Rab、Arf/Sar和Ran [1]。 Rho 家族蛋白在非活性GDP结合形式和活性GTP结合形式之间循环主要通过鸟苷酸交换因子（guanine nucleotide exchange factors，GEFs）、GTP酶活化蛋白（GTPase activating pro-teins，GAPs）、GDP解离抑制因子（guanine nucleotide dissociation inhibitors，GDIs）3个特殊的蛋白质调节。Cdc42作为一个在肿瘤中表达常见的小GTP酶，已经公认Cdc42主要是通过影响细胞骨架和膜转运来调节细胞增殖、细胞运动、细胞极性、细胞分裂和细胞生长等生物进程[2]。肿瘤作为目前对人类健康造成威胁大的一类疾病，它的生长、转移依赖于肿瘤细胞的生存、生长、增殖和迁移。现普遍认为 Rho家族蛋白主要通过影响细胞形态、细胞迁移，以及细胞周期进展、基因转录调节、生长和增殖对肿瘤起作用。Cdc42作为Rho家族中的重要成员之一，具有潜在的临床意义，在肿瘤中异常表达的Cdc42可能成为判断预后的重要指标，它的信号途径有可能成为肿瘤治疗的新靶点。
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Axl及其配体蛋白Gas6在急性白血病中的表达及其与诱导缓解治疗疗效之间的关系
Axl属于受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases,RTK)家族成员,在基因转录调节中起重要作用,参与对细胞存活、增殖、黏附、迁移及抗凋亡的调节[1-2].Gas6为Axl的生物配体,已经发现Gas6-Axl与多种肿瘤细胞的增殖、存活、血管发生、侵袭有关[3-5].Hong等[6]在关于Gas6-Axl与白血病细胞株的体外研究中,发现Gas6-Axl可激活PI3K/Akt和Raf/MEK/ERK信号通路,从而介导白血病细胞多药耐药的发生.目前有关Gas6-Axl在急性白血病(AL)患者中的表达情况及其与多药耐药的关系报道甚少,为此我们采用实时定量RT-PCR法检测74例AL患者骨髓单个核细胞(MNC)中Axl、Gas6 mRNA的表达水平,并分析二者间的相互作用及其与临床疗效、多药耐药的关系.
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LASIK术后皱褶对早期角膜修复反应的影响及临床应用价值
本课题实验动物由南京大学医学院附属鼓楼医院实验动物中心提供,健康成年纯种新西兰白兔,体重大于2kg,雌雄兼用,裂隙灯检查无眼前节疾患.本部分研究通过建立兔LASIK皱褶模型和对照模型对比研究,观察角膜基质细胞凋亡情况、角膜基质细胞数量、角膜基质炎症细胞数量和白细胞介素1 (IL-1β)、转化生长因子(TGF-β 2)、核细胞转录因子(Nuclear cell transcription factor,NF-κ B)和性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达情况来讨论LASIK术后皱褶对上皮瓣细胞保留对早期角膜创伤愈合反应的影响.核细胞转录因子是一种免疫球蛋白,它能够特异性结合到核蛋白质因子,刺激细胞核内的基因转录调节.有研究表明,角膜内的NF-κB有调节细胞凋亡的作用.它不仅能调节角膜细胞的炎症介质和伤口愈合反应,还对细胞凋亡,增殖和活化,以及调节愈合过程中发挥调节作用.
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组蛋白去甲基化酶在前列腺癌中的作用研究进展
前列腺癌是一种常见的老年男性恶性疾病,在西方国家发病率位居恶性肿瘤首位[1].前列腺癌的生长是雄激素依赖性的,晚期前列腺癌抗雄激素治疗有效,但雄激素去势治疗一段时间后,大多数终发展为雄激素非依赖性前列腺癌或去势抵抗性前列腺癌(CRPC)阶段[2-3].组蛋白修饰是基因转录调节控制组织细胞发育分化的关键分子机制.研究发现,组蛋白修饰状态改变在肿瘤发生及进展中发挥重要作用.组蛋白修饰方式包括甲基化、乙酰化、泛素化、磷酸化修饰等[4-6],但它们在基因转录调节的作用不同.目前研究表明前列腺癌的发生及发展与组蛋白去甲基化密切相关[7-9].本文重点综述组蛋白去甲基化酶在前列腺癌发生及进展中的作用.
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泛素-蛋白酶体系统功能异常在神经退行性疾病中的作用
蛋白质降解调控着机体内几乎所有的生命活动，蛋白质在完成功能后，以及在合成、折叠、转运等过程中发生错误或损伤时都必须被降解和清除。人类细胞中主要存在两类蛋白质降解的途径，一是溶酶体降解途径，二是泛素-蛋白酶体降解系统（ ubiquitin-proteasome system ， UPS ）。其中UPS是真核细胞内ATP依赖的蛋白降解系统，可高度选择并高效降解细胞内的蛋白质，不仅是一种降解陈旧或损坏蛋白质的重要机制，而且还参与调节细胞周期进程、基因转录调节、受体胞吞、抗原呈递、细胞增生与分化以及信号转导等细胞的各种生理过程［1］。 UPS在维持细胞稳态、调节细胞生存过程中起着关键作用， UPS的功能异常将会影响到多种疾病的发生过程，包括癌症和神经退行性疾病。本文重点阐述UPS功能异常在神经退行性疾病中的作用。
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基因突变和转基因技术评价TLR-4信号受体在流体切应力诱导血管内皮细胞IL-8基因转录激活中的作用
用基因突变和转基因技术,评价TLR-4信号受体在层流低切应力刺激诱导血管内皮细胞IL-8基因转录激活中的作用.RT-PCR、Northern杂交和免疫荧光细胞化学染色均显示脐静脉血管内皮细胞表达TLR-4,同时RT-PCR和Northern杂交显示,层流切应力刺激1 h后血管内皮细胞TLR-4表达增强.用RT-PCR技术从血管内皮细胞扩增出胞内区段缺失突变TLR-4 cDNA,用PCR技术从其基因组DNA中扩增出IL-8上游调控序列,分别克隆于真核表达质粒pcDNA3和绿色荧光增强蛋白报告基因pEGFP1质粒,构建出重组TLR-4缺失突变基因真核表达质粒pcDNA3-mTLR4和IL-8报告基因表达质粒pEGFP1-IL8USCS.用pEGFP1-IL8USCS转染或pcD-NA3-mTLR4和pEGFP1-IL8USCS共转染ECV304细胞,4.2 dyne/cm2层流切应力刺激3 h后,流式细胞仪观察荧光蛋白表达强度变化.用pEGFP1-IL8USCS转染细胞,经层流切应力刺激3 h后荧光蛋白表达增强(1.06:2.71),同样用pcDNA3-mTLR4和pEGFP 1-IL8USCS共转染细胞,层流切应力刺激3 h后荧光蛋白表达未明显增强.提示TLR4/NF-κB信号传导通路可能介导层流切应力诱导血管内皮细胞IL-8基因的表达.
