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激光显微切割联合质谱分析继发淀粉样变性患者肾组织SAA蛋白
目的 利用激光显微切割联合质谱(LMD/MS)技术分析强直性脊柱炎(AS) 合并继发性淀粉样变患者肾活检组织标本血清淀粉样物质A(SAA)蛋白亚型及氨基酸突变序列.方法 甲醛固定肾活检组织,脱蜡后行刚果红染色,选取刚果红染色阳性区域进行质谱分析,通过数据分析软件对质谱结果进行整合评估,并将患者SAA蛋白氨基酸序列与变异蛋白数据库氨基酸序列进行比对确定是否有变异蛋白.结果 质谱鉴定到高丰度的SAA1及SAA2蛋白,同时有血清淀粉样蛋白P及载脂蛋白E,数据库比对未检测到SAA1及SAA2蛋白的变异序列.结论 本研究首次鉴定到了AS合并淀粉样变肾组织中的SAA1及SAA2蛋白,丰富了AS淀粉样变的发病机制,为将来AA型淀粉样变性的精准分型提供新的方法.
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结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤3例临床病理观察
目的 探讨结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤(NLPHL)的临床病理特征和病理诊断.方法 复习3例NLPHL患者的临床病理资料、免疫表型、EBV原位杂交及抗原受体基因重排PCR检测结果.结果 3例NLPHL中,淋巴结结构破坏,淋巴组织呈结节性或结节-弥漫性增生,可见进行转化的生发中心(PTGC),小淋巴细胞背景中散在大型单个核或多分叶核异型肿瘤细胞.免疫组化:3例肿瘤细胞CD20、PAX5、Oct-2和BOB.1均(+)；仅1例CD30弱(+)；2例bcl-6(+)；CD3、CD15和LMP1(-)；CD21(+)显示扩大的不规则滤泡树突细胞网.3例EBV原位杂交均(-).运用激光显微切割收集肿瘤细胞并对其进行抗原受体基因重排PCR检测,2例IgH单克隆性重排(+)(1例为Fr2a,1例为Fr3a),3例TCRγ多克隆性重排.结论 NLPHL是一种罕见的具有独特临床病理特征的霍奇金淋巴瘤亚型,细致的形态学观察及完善的免疫组化检查有助于诊断和鉴别诊断.
关键词： 结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤 免疫表型 基因重排 原位杂交 激光显微切割 -
淀粉样变性分型的研究进展
淀粉样变性是由蛋白结构异常造成的一组疾病.淀粉样物质在不同脏器沉积进而影响脏器功能.根据致病蛋白种类可将淀粉样变性分为多种亚型,每种亚型的临床表现、治疗方案和预后都不尽相同.传统的免疫荧光和免疫组织化学分型方法存在抗体种类有限、背景染色干扰等问题,具有一定的误诊率.近,以蛋白质组学为基础的激光显微切割联合质谱分析技术(LMD/MS)被成功应用于淀粉样变性分型.本文就淀粉样变性分型方法的新研究进展进行综述.
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食管鳞状细胞癌p53基因突变与p53蛋白过度表达的关系
p53基因是各种人类肿瘤包括食管癌中常见有突变的基因之一.我们应用激光显微切割,聚合酶链反应(PCR)-杂合性缺失(LOH),PCR-单链构象多态性分析(SSCP),p53测序及免疫组织化学方法,检测了食管癌高发区中国山西省的56例患者食管鳞状细胞癌 (ESCC) 中p53基因缺失、突变及p53蛋白表达情况,旨在更好理解p53基因突变等变化在食管癌发生发展过程中的作用.
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用荧光定量-聚合酶链反应比较不同核染色方法对经激光显微切割组织细胞DNA聚合酶链反应的影响
在石蜡切片中,对特定细胞或组织进行显微切割和分离是一项非常重要的技术,特别是对研究异质性肿瘤(如癌前病变、原发肿瘤等)的基因改变和形态学之间联系很有帮助.在进行显微切割时,为了辨别细胞或组织的形态或功能,往往要进行组织化学染色或免疫组织化学.
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应用激光显微切割技术检测组蛋白去乙酰化酶6在肝癌中的表达
近年研究表明,组蛋白去乙酰化酶6(histone deacetylase 6,HDAC6)与肿瘤关系密切,通过去除组蛋白的乙酰基和其他转录调控参与肿瘤发生和进展.在促进肿瘤转移,细胞移动、刺激组织器官的血管生成等方面发挥多种生物学功能.目前HDAC6与肝癌关系的研究甚少.我们应用激光显微切割联合RT-PCR的方法检测了48例HCC中HDAC6的表达,并对HDAC6与临床病理指标之间的关系进行了分析,以探讨其在肝癌发生、发展及转移中的意义.
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胃癌线粒体D-loop(CA)n和ND1及ND5基因突变的研究
目的:探讨胃癌线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)突变在胃癌发生发展中的作用.方法:利用激光显微切割技术分离胃癌组织及其切缘的正常组织,应用变性高效液相色谱技术DHPLC对胃癌线粒体D-loop调控区D-loop-(CA)n及电子传递链酶复合体Ⅰ的ND1和ND5基因进行突变筛查及测序分析.结果:胃癌组织样本中D-loop-(CA)n调控区、ND1和ND5基因突变率分别为50.8％(31/61)、39.3％(24/61)和21.3％(13/61),正常组织均未见有序列改变.胃癌组织D-loop-(CA)n调控区、ND1和ND5基因突变率与正常组织相比差异均有统计学意义,x2值分别为41.560、29.878和14.550,P值均＜0.001.测序共鉴定出17个突变位点,11个位点为同义突变未引起氨基酸改变,6个位点为错义突变发生了氨基酸改变.mtDNA突变类型主要为碱基替代(76.5％,13/17),其中碱基转换和颠换各占23.5％(4/17)和52.9％(9/17).结论:胃癌mtDNA突变参与了肿瘤的发生发展.
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胃癌及癌前病变微卫星不稳定的研究
目的 探讨胃癌及癌前病变微卫星不稳定(MSI)的存在与否及其作用.方法 利用激光显微切割技术分别收集胃癌、肠化、异型增生及正常胃黏膜,选择5个微卫星位点应用变性高效液相色谱技术检测MSI.结果 5个微卫星位点REF阳性表型中,肠化MSI为10.5％,异型增生MSI为21.12％,胃癌MSI为43.75％,正常胃黏膜无MSI.结论 激光捕获显微切割技术有效地解决了异质性问题.变性高效液相色谱技术检测MSI具有半自动化、快速、检出率高等优点.MSI从癌前到胃癌逐步增加,癌前MSI的检测对胃癌的早期诊断可能是一个潜在的预警指标.
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激光显微切割技术富集肿瘤细胞在基因突变检测中的意义
目的 探讨激光显微切割技术富集肿瘤细胞对检测非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因突变检测的影响以及其临床病理学意义.方法 采用激光显微切割技术富集49例NSCLC患者的石蜡包埋样本的肿瘤细胞,采用PCR技术对EGFR基因第18、19、20、21号外显子片段进行扩增后直接测序,分析其结果并比较其与常规肿瘤组织筛选后进行EGFR基因突变检测结果的异同.结果 49例NSCLC样本中21例(42.9％)存在EGFR基因突变,包括第19号外显子13例,第21号外显子8例,没有发现两者同时突变的样本.分析外显子突变情况发现,利用激光显微切割技术富集的样本检测突变率42.9％(21/49),高于利用常规筛选后的突变率34.7％(17/49),两种方法的差异有统计学意义(P=0.045 5＜0.05).且比较两种方法,可以发现前者检测得到的突变峰峰高明显高于后者.结论 利用激光显微切割技术富集肿瘤细胞能有效去除间质细胞对肿瘤细胞的基因组干扰,更能体现肿瘤细胞基因组状态,有效提高EGFR基因突变检测检出率,有利于患者靶向治疗的临床筛选.
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应用激光显微切割技术检测单个结肠细胞的基因表达
目的:探讨检测单个结肠细胞的基因表达的方法.方法: 应用激光显微切割技术(laser microdissection)从冰冻切片上将单个结肠细胞切下, 提取总RNA, 将RNA逆转录成cDNA, 采用巢式逆转录聚合酶链反应(nested RT-PCR)检测mRNA的表达.结果: 在显微镜下用紫外激光显微切割机, 将单个结肠细胞成功切下,提取RNA后, 逆转录成cDNA, 经过巢式RT-PCR扩增后,扩增产物在琼脂糖凝胶上清晰可见.结论: 联合应用激光显微切割和巢式RT-PCR可以检测单个结肠细胞的基因表达.
关键词： 激光显微切割 单细胞 基因表达 巢式逆转录聚合酶链反应 -
p53基因变异在F344大鼠肝癌发生过程中的作用
目的:研究p53基因在肝癌发生过程中的作用.方法:纯系F344大鼠经0.06%3'-甲基-4-二甲胺基偶氮苯饲喂6、12和24周致癌.激光显微切取肝脏癌前病变和癌灶(LCM样品),进行p53基因的PCR-SSCP分析和直接测序.结果:25%癌前病变LCM样品及45.8%癌LCM样品分别在外显子6/7或(和)8呈现PCR-SSCP电泳带移动率改变(P＞0.05).20.5%癌前病变LCM样品在外显子6/7或(和)8发生了错义突变,显著低于癌灶样品(62.5%,P＜0.01).在较晚的癌前病变和癌灶细胞核中发现变异的p53蛋白.结论:p53基因突变始发于肝脏化学性癌发生早期的癌前病变,提示突变导致p53基因的失活是肝癌发生的重要原因.
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利用激光捕获和高效液相色谱质谱对石蜡包埋口腔黏膜癌变组织的蛋白组学分析
目的：：对口腔黏膜癌变的蛋白组学分析和分子标志物筛选可能为早期诊断、预防和分子治疗提供依据和帮助。方法：对3例石蜡包埋口腔黏膜癌变组织样本，利用激光显微切割技术捕获口腔黏膜癌变上皮和癌旁正常黏膜上皮，抽提组织样本蛋白，利用高效液相色谱-质谱联用进行口腔黏膜癌变组织的蛋白组学分析。结果：激光显微切割-高效液相色谱质谱联用可以分析400~700个多肽序列，鉴定出100~200个蛋白，涉及到细胞骨架、细胞代谢、信号转导、细胞周期等各个方面。结合文献，对其中的角蛋白表达变化进行了分析和验证。结论：显微切割结合高效液相色谱质谱可以实现对石蜡包埋组织的蛋白组学研究，具有较高的重复性和可靠性。角蛋白表达谱的变化验证了该平台的作用和价值，也可作为口腔黏膜癌变的潜在标志物。
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激光捕获显微切割技术在实践中的应用和体会
组织是由大量的不同类型的相互影响的细胞群组成的复杂的三维结构,这对于分析、比较正常与病变组织产生了很大障碍.通过常规病理技术所获得的细胞往往是由多种细胞组成的复合体,因而所提取的DNA、RNA或蛋白质不能代表特定疾病特有标志的单一同类细胞的信息,而且复合组织中细胞在生化与物理性状方面容易受到周围类型细胞及远距离刺激的影响.因此,要分析疾病发展过程中的关键基因表达模式、功能及改变,就必须从复合组织中提取特定细胞[1].美国国立癌症研究所(NCI)的Emmert-Buck等于.
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激光显微切割-单细胞PCR技术在霍奇金淋巴瘤IgH基因检测中应用
Küppers等建立并应用"分子组织学技术"进行霍奇金淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma,HL)单个RS细胞Ig基因重排的研究,为阐明HL的性质作出重要贡献.但初期显微切割技术所存在的缺陷,一定程度上限制了分子组织学研究的开展.近年来激光捕获显微切割(Laser capture microdissection,LCM)技术的建立,推进了肿瘤基因组学研究的重要发展.本实验致力于建立一套优化的LCM-单细胞PCR技术应用于HL单细胞基因检测.
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食管鳞癌及癌前病变活检组织的微卫星改变
目的探讨食管鳞状细胞癌(ESCC)早期病变与遗传学改变之间的关系,筛选和评价可能作为食管癌早期诊断预警指标的微卫星标志物.方法选用曾被证实在浸润性食管鳞癌表现高频率杂合性缺失(LOH)的16个同位素标记微卫星标志物,应用激光捕获显微切割技术(LCM)分析37例食管镜活检组织不同程度病变存在的遗传学改变,包括15例不典型增生,22例ES-CC.结果16个微卫星标志物LOH频率和微卫星不稳定性(MSI)发生率分别为:轻度不典型增生(LGD)为2%和22%,重度不典型增生(HGD)为15%和33%,ESCC为35%和64%.LGD与HGD比较有非常显著性差异(P=0.02,P=0.001,P=0.007);HGD与ESCC比较无显著性差异.其中的10个标志物(D3S4545, D5S2501, D8S1106, D9S1118, D9S910, D13S1493, D13S894, D13S796, D15S655, D17S1303)分别在1例以上的癌前病变中出现等位缺失.结论LOH和MSI的发生频率均随病变的组织学严重程度而增高,且等位缺失在食管癌前病变检出率较高.食管癌的发生和进展与基因不稳定性密切相关,这种分子改变能够通过食管镜活检组织检测.微卫星标志物可能成为食管癌早期诊断的有用标志物.
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PRDM1在弥漫大B细胞淋巴瘤中表达和预后意义研究
目的:探讨阳性调控区I蛋白(PRDMl)在弥漫大B细胞淋巴瘤中的表达和预后意义.方法:采用免疫组织化学方法根据CDl0、BCL6和IRF4的表达将82例弥漫大B细胞淋巴瘤患者分为生发中心和非生发中心型,显微切割联合RT-PCR和Western杂交方法检测患者PRDMl的表达情况并观察对CHOP和美罗华联合CHOP方案(R-CHOP)治疗后生存期的影响;利用半定量RT-PCR和Western杂交观察PRDMl在B细胞淋巴瘤Namalwa细胞株中表达和美罗华、阿霉素以及美罗华联合阿霉素对其表达的影响,利用ELISA方法观察PRDMI表达与NF-kB活性的关系.统计分析软件SAS 8.2,P值小于0.05有统计学意义.结果:PRDM1存在α和β两种亚型,显著表达于弥漫大B细胞淋巴瘤非生发中心亚型的肿瘤细胞(73.5%比38.8%.39.4%比6.1%;P=0.0020和P=0.0009).而PRDMlB在CHOP方案治疗的非生发中心型患者中与短生存期相关.但在R-CHOP方案治疗组中未显示相关性;Namalwa细胞株中表达PRDM1β,美罗华和美罗华联合阿霉素均能够抑制PRDM1β表达,同时伴随NF-kB的失活.结论:PRDM1显著表达在弥漫大β细胞淋巴瘤非生发中心亚型中,PRDM1β可能与疾病的不良预后有关.
