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内皮祖细胞在血管新生及血管组织工程化过程中的生物学意义
内皮祖细胞(EPCs)是能分化为成熟血管内皮细胞的祖细胞,参与了出生后的血管再生和受损内皮的修复过程.近年来围绕以EPCs作为种子细胞来促进血管新生、维持内皮功能完整并构建组织工程化血管方面展开了许多研究.本文就这方面的进展作一综述.
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左旋聚乳酸/卵磷脂共混物膜的血液相容性研究
采用溶液共混法制备可降解左旋聚乳酸(PLLA)和5%～15%卵磷脂(质量百分比例)的共混物膜,通过测定静态水接触角来评价材料的亲水性,采用分光光度计分析不同材料的溶血率,利用扫描电镜观察血小板在共混物膜上的形态和黏附量,以评价共混卵磷脂改性后PLLA的血液相容性.结果表明:随着共混物膜中卵磷脂含量的提高,材料的亲水性能明显增加,PLLA和5%～10%卵磷脂共混物膜上血小板的黏附量和变形程度小且溶血率低,获得良好的血液相容性,其在血管组织工程中的应用值得进一步开发研究.
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体外诱导人脂肪干细胞向内皮细胞分化的研究
目的 摘要目的 诱导人脂肪间充质干细胞(hADAS cells)成内皮细胞,探索佳诱导条件,为血管组织工程种子细胞的来源及其临床应用提供基础.方法 分为内皮细胞生长因子(VEGF)50 ng/ml和20 ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)10 ng/ml两组诱导脂肪干细胞成内皮细胞,流式细胞仪检测其表面抗原CD34、CD31表达,荧光显微镜下观察其吞噬乙酰化低密度脂蛋白(DiI-ac-LDL)和结合植物凝集素(FITC-Lectin)的能力,细胞免疫荧光法检测Ⅷ因子的表达.结果 流式证实间充质干细胞在诱导第4和8天CD31、CD34表达逐渐增加;可吞噬DiI-ac-LDL,与Letin结合;细胞免疫荧光法可检测到Ⅷ因子表达.结论 VEGF、b-FGF可诱导脂肪干细胞成内皮样细胞,对VEGF有很大的依赖性,成为血管组织工程种子细胞的选择之一.
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干细胞在心血管组织工程中的应用研究
先天性心脏病约占出生人口的1%,很多患儿需要采用补片或管道修复心脏缺损或重建心脏结构,但目前使用的各类补片、管道都没有收缩能力,无法辅助心脏功能,同时因为缺乏生长能力,随着患儿的生长,往往需要二次手术,给家庭和社会带来沉重的负担.
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3D打印技术在心血管组织工程中的研究进展
近年来，3 D打印技术已成为心血管组织工程领域的研究热点，并取得了一些进展。但是将来如何应用到临床上仍需进一步的研究。本文回顾近年来3D打印技术在心肌组织、心脏瓣膜、冠状动脉应用的研究进展，并对未来的研究进行展望。
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细胞外基质与组织工程血管表面修饰的研究进展
利用细胞外基质蛋白对血管组织工程材料进行表面修饰,对于改变组织工程血管材料的表面性能,提高其生物相容性有着非常重要的意义.本文分别综述细胞外基质的三大类成分(胶原、氨基聚糖和蛋白聚糖、糖蛋白)对于血管组织工程材料的表面修饰作用,并对其作用机制及表面修饰中相关的热点应用问题进行了分析.综合
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内皮祖细胞及其在血管组织工程中的应用
内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是指能从骨髓迁移到外周血,并分化为血管内皮细胞的祖细胞,又称血管内皮干细胞(endothelial stemcells).1997年Asahara等[1]应用免疫磁珠法从成人外周血中分离CD34+细胞,并在预衬纤维连接蛋白(fibronectin,Fn)的培养皿培养,得到的细胞可表达vWF、CD34、CD31、VEGFR-2等内皮细胞特异性抗原,因而将CD34+细胞命名为内皮祖细胞.
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骨髓间充质干细胞作血管组织工程种子细胞的研究进展
骨髓间充质干细胞易于分离培养,增殖能力强,体外培养多次传代后仍保持多向分化潜能其以自身多方面的特点已成为血管组织工程又一种可选择的种子细胞,对临床应用具有重要价值,但其进一步体外成血管的条件尚需深入研究.综述人骨髓间充质干细胞hMSCs体外培养、定向分化为内皮细胞的条件及相关研究进展.
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人骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞诱导分化的研究
目的:分析人骨髓间充质干细胞(hMSCs)和脐静脉内皮细胞(hUVECs)的基因表达差异,探讨体外基因转染诱导内皮分化的可行性以及作为血管组织工程种子细胞来源的应用前景.方法:分别从人骨髓和脐静脉分离间充质干细胞(hMSCs)和内皮细胞(hUVECs),扩增培养后进行流式细胞仪、免疫细胞化学,免疫荧光鉴定和超微结构观察.通过BiostarH-40S表达谱芯片分析,选择两者的差异表达基因,导入hMSCs,经RT-PCR、ELISA鉴定该基因的转染和表达,并分析hMSCs的内皮分化程度.结果:hMSCs表达内皮细胞的多种特异性mRNA,经VEGFl65基因瞬时转染后RT-PCR有明显条带,ELISA定量检测VEGF165蛋白表达为(707.9±11.3)ng/L,同时CD44表达明显下调38.80%,CD31则明显上调达56.82%,FI-1,FVⅢAg和CD34的表达也有不同程度升高.结论:hMSCs具有内皮分化潜能,体外基因转染诱导hMSCs产生功能性内皮细胞和组织工程化血管具有广阔前景.
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间充质干细胞诱导分化为血管内皮细胞的研究进展
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是一种起源于中胚层的成体干细胞,可以向所有中胚层来源的细胞及部分外胚层来源的细胞分化,且MSCs具有来源广泛、易于体外分离培养、免疫原性低,移植后无免疫排斥反应和易于基因转染等特点.血管内皮细胞属于中胚层细胞,MSCs可定向诱导分化为血管内皮细胞,在体外构建成理想的血管移植物,用于心脏组织工程瓣、血管组织工程以及再生医学领域.本文就间充质干细胞的生物学特性及诱导分化为内皮细胞的相关研究以及研究中存在的问题作一综述.
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Ang-(1-7)与肺高压状态下肺血管平滑肌细胞的增生
背景:Ang-(1-7)虽然具有抗血管平滑肌细胞增殖作用,但在不同的血管床中其作用可能存在差异.直接给予外源性Ang-(1-7)是否可抑制肺动脉高压大鼠肺血管平滑肌细胞的增殖尚不清楚.目的:探讨Ang-(1-7)对野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠肺血管平滑肌细胞增殖的影响.方法:雄性SD大鼠颈部一次性注射60 mg/kg野百合碱制备肺动脉高压模型.24 h后,分别经微泵持续泵入Ang-(1-7)(治疗组)或生理盐水(模型组),并设立未造模的对照组.给药2,4周,测定大鼠的右心室收缩压、心室质量、肺小动脉管壁厚度占管径的百分比及管壁面积占血管总面积的百分比.免疫组织化学方法检测肺血管平滑肌细胞α-平滑肌肌动蛋白及增殖细胞核抗原的表达.结果与结论:野百合碱诱导2周,与对照组比较,模型组大鼠右心室收缩压、各心室的质量无明显变化,肺小动脉管壁厚度占管径的百分比、管壁面积占血管总面积的百分比、增殖细胞核抗原阳性率显著增高,α-平滑肌肌动蛋白显著降低;野百合碱诱导4周,模型组大鼠右心室收缩压、各心室的质量、肺小动脉管壁厚度占管径的百分比、管壁面积占血管总面积的百分比、增殖细胞核抗原阳性率均显著增高,α-平滑肌肌动蛋白显著降低.而治疗组上述指标与对照组比较差异无显著性意义 (P > 0.05).说明在野百合碱诱导的肺动脉高压模型中,在肺动脉压增高之前已有肺血管形态学的变化,Ang-(1-7)可通过减轻肺血管平滑肌细胞的增生抑制大鼠肺动脉压的升高.
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血管冻干工艺过程中升华界面移动特性的微CT实验
背景:前期实验发现冻干过程中物料内部的孔隙分部、空隙连通度等对内部传热传质影响较大,但对于干燥过程热质迁移的机制未阐明.目的:在前期实验基础上,以微CT为分析工具,尝试对冷冻干燥过程中升华界面移动特性进行实验观察分析,希望对血管冻干工艺提供参考.方法:以新鲜猪主动脉为材料使用微CT扫描仪的扫描成像、图像重构及灰度值分析技术对血管在冻干时升华过程进行观察分析. 结果与结论:冻干温度曲线斜率初期较大,升华速率较快,由血管的二维横截面重构图像中可以看出冻干区与冰晶区的灰度值差别较大,升华界面明显,升华是在物料的外表面和内表面同时进行,界面移动明显.随着时间推移,温度曲线斜率变小,升华速率也随之变慢,界面移动逐渐不明显.对于竖直放置的血管在底部进行加热的干燥过程,升华是在外表面和内表面同时进行的.升华界面逐渐向血管壁面中心移动.冻干过程随时间推移热质传递阻力增大,升华速率减慢.
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血管组织工程种子细胞原代培养技术的改良
背景:如何获取高质量的种子细胞是构建组织工程血管的先决问题.目的:改良血管组织工稃种子细胞原代培养技术并观察其生物学特性.设计、时间及地点:以细胞为培养对象,观察性实验,于2006-12/2008-03在江西省分子医学重点实验室完成.材料:新曲兰家兔,体质量2kg左右,用十血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的原代培养.方法:以胶原酶胰酶序贯消化法获得血管内皮细胞、快捷贴擘法培养血管平滑肌细胞.主要观察指标:免疫细胞化学法对两者进行鉴定:流式细胞术检测第2代和第6代血管内皮细胞的增殖指数.结果:培养的种子细胞符合各自特征.免疫细胞化学鉴定其为血管内皮细胞和血管平滑肌细胞.内皮细胞第2代和第6代细胞增殖指数分别为(20.87±2.05)%和(9.75±1.76)%.结论:胶原酶胰酶序贯消化法和快捷贴壁法可以较稳定地获取血管内皮细胞及血管平滑肌细胞;第2代的内皮细胞较第6代更适用于构建组织工程血管.
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骨桥蛋白反义核苷酸对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响
背景:骨桥蛋白在血管损伤后新生内膜中的表达明显上调,而且能促进血管平滑肌细胞和外膜细胞的增殖、迁移.目的:探索骨桥蛋白反义核苷酸对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响.方法:培养大鼠A10主动脉血管平滑肌细胞,通过MTT比色法测定骨桥蛋白反义核苷酸对平滑肌细胞增殖的影响,流式细胞仪测定骨桥蛋白反义核苷酸对平滑肌细胞周期分布的影响;通过RT-PCR方法检测血管平滑肌细胞转染骨桥蛋白反义核苷酸对增殖细胞核抗原表达的影响.结果与结论:骨桥蛋白反义核苷酸对血管平滑肌细胞的增殖有明显的抑制作用,随时间延长对细胞增殖抑制率下降.骨桥蛋白反义核苷酸主要作用于G1/S限制点,能阻止血管平滑肌细胞由G0/G1期向S期推进,从而将血管平滑肌细胞阻滞于G0/G1期,抑制血管平滑肌细胞的增殖.血管平滑肌细胞转染骨桥蛋白反义核苷酸后,增殖细胞核抗原的表达水平均较对照组降低(P<0.05).因此,得出骨桥蛋白反义核苷酸通过阻止血管平滑肌细胞由G0/G1期向S期推进,从而抑制血管平滑肌细胞的增殖,进而抑制血管内膜增生.
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人脐动脉脱细胞支架的制备及其生物相容性
目的:制备脱细胞人脐动脉支架并检测其与内皮细胞的相容性.方法:实验于2005-11/2006-12在复旦大学上海医学院分子生物学实验室完成.实验材料:健康新生儿的新鲜脐带(产妇知情同意并自愿捐献).实验方法:①脱细胞脐动脉支架的制备:分离脐动脉放于离心管中,先用低渗后用等渗的十二烷基硫酸钠处理,再用核酸酶消化.脱细胞脐动脉支架作苏木精-伊红染色、Movat五色法染色及透射电镜观察.②支架与内皮细胞共培养:将脱细胞脐动脉支架切成小块,移入24孔培养板中.实验组每孔接种1.5 mL的脐静脉内皮细胞悬液,对照组未种细胞,只加1.5 mL的培养液,1周后进行扫描电镜观察.实验评估:①脱细胞脐动脉支架的形态.②血管内皮细胞在脱细胞脐动脉支架上黏附生长情况.结果:①脱细胞脐动脉支架的形态:光镜下对照组样品中观察到深蓝色的细胞核,实验组细胞结构被完全破坏,核破碎后被彻底清除,未见核碎片,血管壁纤维组织染成红色,呈整齐排列,组织结构未见明显的疏松;Movat五色法染色显示,脱细胞血管无红色的细胞质和黑色的细胞核,只见呈现整齐排列的波浪状黑色的弹性纤维,其间散布着蓝色的糖蛋白和网状纤维;透射电镜下观察到交错排列的胶原纤维和弹性纤维,有少量碎片存在,未见细胞样结构.②血管内皮细胞在脱细胞脐动脉支架上黏附生长情况:脐静脉内皮细胞种植于脱细胞脐动脉支架后,扫描电镜观察到可黏附生长并形成完整内膜层.结论:用十二烷基硫酸钠和核酸酶联合消化人脐动脉能够制备良好的脱细胞血管支架,并且对内皮细胞有良好的组织相容性.
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促红细胞生成素对大鼠内皮祖细胞生物学特点的影响
背景:内皮祖细胞是内皮细胞的前体细胞,可参与新生血管的形成.研究发现,促红细胞生成素对骨髓内皮祖细胞有动员作用,促进血管的新生和损伤组织修复.目的:观察不同浓度促红细胞生成素对体外培养的大鼠内皮祖细胞功能的影响.方法:提取Wistar大鼠股骨和胫骨骨髓,利用密度梯度离心方法分离单核细胞进行培养,分别在培养基中加入0,4,8 U/mL不同浓度的促红细胞生成索进行培养.培养7 d后,对内皮祖细胞利用FITC-UEA-1和Dil-Ac-LDL共同染色方法进行鉴定;同时利用CD34和CD133共同标记,以流式细胞仪进行鉴定;采用黏附实验、迁移实验及MTT实验对其功能进行评定.结果与结论:培养到7d左右,细胞形态变化完全,细胞之间形成联接,并可以围成似管腔状形态,十二三天时,细胞融合,形成铺路石样.培养细胞荧光染色显示内皮祖细胞里双阳性染色,经流式细胞仪鉴定培养的内皮祖细胞可以结合CD133和CD34.黏附实验、迁移实验及MTT实验显示,促红细胞生成素呈剂量依赖性提高内皮祖细胞的黏附、迁移和增殖能力.说明在0-8 U/mL浓度内,促红细胞生成素呈剂量依赖性提高内皮祖细胞的黏附、迁移和增殖功能.
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内皮前体细胞与平滑肌细胞联合培养构建组织工程血管:适比例验证
目的:由内皮前体细胞分化的内皮细胞与成熟平滑肌细胞联合培养可以为组织工程血管的形成提供更接近天然的条件.实验拟进一步证明两种细胞联合培养可促进血管内皮细胞生长,以及两种细胞的适比例.方法:实验于2006-01/2007-05在复旦大学上海医学院分子生物学实验室完成.①实验材料:新鲜脐带取自国际第一妇婴保健医院,产妇知情同意.②实验方法及评估:从人脐动脉中用组织块培养法分离并原代培养血管平滑肌细胞,免疫荧光方法鉴定其平滑肌肌动蛋白表达情况;采用密度梯度离心法分离脐血中的内皮前体细胞,经体外定向诱导分化和免疫荧光方法鉴定其表型;无菌条件下制作Ⅰ型胶原凝胶,在其上以3:1～4:1的比例混匀联合培养内皮前体细胞与平滑肌细胞,并观察两种细胞联合培养时的形态,分析两种细胞合适的种植比例;免疫荧光方法观察在Ⅰ型胶原凝胶联合培养中CD31、vWF的表达以及内皮细胞的生长情况.结果:①原代培养的平滑肌细胞呈典型"波峰谷"形态,荧光染色平滑肌肌动蛋白呈阳性.②脐血来源的内皮前体细胞定向诱导分化为内皮细胞后,呈现出"铺路石"样形态,表达CD31、vWF,结合荆豆凝集素,提示具备成熟内皮细胞特性.③在Ⅰ型胶原凝胶上两种细胞增殖力均旺盛,与平滑肌细胞以3:1～4:1的比例种植在I型胶原凝胶培养一段时间后,内皮前体细胞可从平滑肌细胞处得到支持,形成血管样网络结构.④共培养1周后,CD31与vWF阳性细胞即内皮前体细胞分化而来的内皮细胞互相连接,形成环形结构.结论:内皮前体细胞和平滑肌细胞以3:1～4:1共培养的模式可以促进微血管样结构的形成.
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改良贴壁法结合内皮细胞培养基培养小鼠肺微血管内皮细胞
背景:肺微血管内皮细胞是研究微循环的重要内皮细胞模型之一,众多培养方法中单纯贴壁法操作相对简便,但耗时长,杂质细胞多,是批量培养细胞的大障碍.目的:建立优化的小鼠肺微血管内皮细胞体外培养方案,观察细胞生长状态并鉴定细胞性质.方法:无菌状态下快速剪碎5 日龄C57BL/6J 小鼠的肺叶外周组织,肺组织颗粒贴壁法获得肺微血管内皮细胞,并用内皮细胞培养基培养.倒置显微镜观察培养细胞生长和行为状态,Ⅷ因子相关抗原免疫组化和免疫荧光进行细胞鉴定.结果与结论:肺组织块培养24 h 内可见梭形细胞爬出,传代后细胞生长迅速,形态规则呈鹅卵石状,纯度高达98%以上,结合Ⅷ因子相关抗原检测证实其为内皮细胞.结果可见联合运用肺组织颗粒贴壁和内皮细胞培养基可高效获得原代小鼠肺微血管内皮细胞.
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兔主动脉内皮细胞培养及鉴定:内皮细胞分离方式及培养条件的改良
背景:获取内皮细胞的方法有机械刮取、组织块移植和酶消化法3种.一直以来,内皮细胞的培养方法也在不断的更新.目的:探讨兔主动脉内皮细胞的培养和鉴定方法.方法:取1周龄新西兰大耳白兔主动脉,剥去外膜,内膜面向下铺入2 g/L Ⅰ型胶原酶、2 g/L Ⅲ型胶原酶,2 g/L Ⅳ型胶原酶和2 g/L Ⅴ型胶原酶混合消化液中(按1:1:1:1:1混合)消化20min,按1:1加入培养基以终止消化.轻轻刮下内膜层细胞,将细胞悬液离心,用DMEM培养液(含胎生血清20%、VEGF 1 μg/L、bFGF 2 μg/L,庆大霉素6 U/L)混匀沉淀细胞,吹打分散至单个细胞培养,48 h后用首次换液.再按1:2分瓶传代培养.采用倒置相差显微镜观察细胞培养结果.免疫组织化学及免疫荧光鉴定Ⅷ因子相关抗原.电镜观察Weibel-Paladed小体.结果与结论:体外获得并培养5代内皮细胞.Ⅷ因子相关抗原及电镜观察W-P小体均证实实验成功的培养了原代及传代内皮细胞.提示兔主动脉内皮细胞可从主动脉获得并通过培养成为细胞系,Ⅷ因子相关抗原及电镜观察W-P小体联合鉴定是确定内皮细胞的良好方法.
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细菌纤维素在组织工程中的应用
背景：细菌纤维素是纳米级纤维，具有许多独特的理化和机械性能及良好的生物相容性和可降解性等特性，目前已成为国际上新型组织工程材料的研究热点。
目的：分析细菌纤维素在组织工程中的应用。
方法：检索2004至2013年PubMed数据库和中国知网数据库中相关文献，英文检索词为“bacterial cel ulose；tissue engineering”，中文检索词为“细菌纤维素；组织工程”。选取有关细菌纤维素在组织工程中应用方面密切相关文献48篇进行分析。
结果与结论：细菌纤维素具有高结晶度、高持水性、高机械强度、可降解性、良好的生物相容性和超细三维纳米网状纤维结构等独特特性，能作为生物活性分子的载体，维持生物活性分子的活性。同时，细菌纤维素通过改性修饰能提高其机械和生物特性，促进损伤组织的修复重建。目前已开始将细菌纤维素应用于组织器官重建中。细菌纤维素能作为生物活性分子的载体，但存在难以降解和功能单一等缺点，通过对细菌纤维素的改性修饰可以改善它的功能和促进降解。
