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经导管肝动脉化疗栓塞对肝癌患者外周血黑色素瘤抗原1 mRNA的影响
目的 探讨经导管肝动脉化疗栓塞(TACE)对肝癌患者外周血黑色素瘤抗原1(MAGE-1)mRNA表达水平的影响.方法 采用巢式RT-PCR方法 测定18例肝癌患者TACE治疗前后外周血MAGE-1 mRNA的表达.分析其与肝癌临床病理特征间的关系.结果 18例肝癌患者治疗前外周血MAGE-1 mRNA表达10例阳性、8例阴性;TACE治疗后11例阳性、7例阴性.治疗前后外周血MAGE-1mRNA阳性率差异无统计学意义(55.6%比61.1%.P>0.05).治疗前后肝癌患者外周血MAGE-1mRNA阳性率与肿瘤TNM分期((0%比76.9%,20%比76.9%,P<0.05)、远处转移有关(85.7%比36.4%,100%比36.4%,P<0.05),而与肿瘤大小、血清AFP无关(P>0.05).结论 TACE治疗肝癌不会促进肿瘤的血源性转移,MAGE-1 mRNA可作为评估肝癌疗效的一个重要指标.
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肝细胞癌肝内微转移的研究
目的 探讨肝细胞癌肝内微转移分布的规律.方法 选择无临床肝内转移且无门静脉主干或一级分支内瘤栓、切缘充分的单发肝细胞癌切除标本43例为研究对象.用立体定位全取材切片和黑色素瘤抗原(MAGE)及甲胎蛋白(AFP)抗体免疫组化染色技术寻找肝内的微转移.结果 58.7%(25/43)的患者肝内微转移阳性,59.3%(179/302)的转移灶为门静脉内的微瘤栓.微转移距原发灶的远距离可达4.7 cm,P95为2.5 cm.单因素分析显示,微转移的发生与血清AFP水平、原发瘤直径、包膜完整性和Edmondson分级相关(χ2或t值分别为11.50,2.465,12.17和16.59,P＜0.05).多因素分析显示,原发瘤直径和包膜完整性是独立影响因素(Wald值为7.903和3.858,P＜0.05).在HE染色微转移阴性的切片中AFP染色阳性率为9.3%,MAGE为7.0%,至少有一项阳性者为14.0%.结论 (1)肝细胞癌肝内转移是较为普遍的现象,大部分位于原发瘤附近,主要形式为门静脉内的微瘤栓.(2)无临床转移的单发肝癌的理想手术切缘应为2.5 cm,并应根据肿瘤的生物学特性进行调整.(3)AFP和MAGE免疫组化染色有利于肝内微转移的检出.
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胸腹交界区巨大血管平滑肌脂肪瘤一例
患者男,40岁.4个月前无诱因出现右上腹、右下胸部隐痛不适而入院.疼痛以右侧卧位时明显,无咳嗽、咯痰及咯血,无发热、返酸、恶心及呕吐.体检:胸腹部未见异常体征.免疫组织化学(简称免疫组化):血小板内皮细胞黏附分子-1(CD31,+)、肌动蛋白-平滑肌(SMA,+)、肌动蛋白-广谱(MSA,+)、黑色素瘤抗原(A103,-)、黑色素瘤相关抗原(HMB45,+).血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)74 IU/L,葡萄糖6.15 mmol/L,红细胞、血红蛋白、甲胎蛋白及癌胚抗原(CEA)均正常.心电图、肺功能检查未见异常.B超检查示:前列腺增大伴钙化灶.胸部平片示左后肋膈角有一结节影.
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应用MAGE-1抗原肽从肝癌病人外周血中诱导产生特异性细胞毒T淋巴细胞
目的探讨应用MAGE-1抗原肽治疗肝细胞肝癌（HCC）的可行性。方法 应用RT-PCR法检测MAGE-1在8种HCC细胞株中的表达，筛选杀伤实验的靶细胞；将MAGE-1抗原肽NYKCRFPEI孵育的外周血单个核白细胞经照射后作为抗原呈递细胞，每隔7天刺激HCC病人自体外周血单个核白细胞一次，共4次后作为效应T淋巴细胞，应用流式细胞仪检测培养前后淋巴细胞的表型变化，应用乳酸脱氢酶法检测效应T细胞对靶细胞的杀伤效应。 结果 HCC细胞株BEL7405 MAGE-1和HLA-A24均阳性表达，可用作杀伤实验的阳性靶细胞，HLE等其它7种细胞不能双表达，可用作杀伤实验的阴性对照细胞；培养28天，淋巴细胞增加31倍；培养28天，CD3+ T和CD8+ T分别增加26%和20%；在效∶靶为10∶1时，效应T细胞对MAGE-1抗原九肽NYKCRFPEI孵育的自体淋巴母细胞、BEL7405的杀伤效应分别为62.5%和40.25%，均明显高于对自体淋巴母细胞（17.88%）、HLE（19.55%）及QGY7701的杀伤效应（1.6%）；在效∶靶为3.3∶1时，效应T细胞对肽孵育的自体淋巴母细胞的杀伤效应为53.6%，明显高于对自体淋巴母细胞（15.6%）、HLE（13%）和QGY7701的杀伤效应（1%）。 结论 本实验结果表明，应用MAGE-1抗原肽NYKCRFPEI，在体外从HCC病人的外周血单个核白细胞中成功地诱导出具有特异性杀伤能力的效应T细胞, 为应用MAGE-1抗原肽对HCC病人进行免疫治疗提供了理论基础。
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MAGE基因在肺癌疫苗研究进展
随着对肿瘤逃避免疫监视机制研究的不断深入,免疫治疗已成为一种有希望治疗肿瘤的新方法.其中肿瘤疫苗作为肿瘤的特异性主动免疫治疗成为肺癌非常有吸引力的靶向治疗策略之一,尤其适用于完全切除术后患者的辅助治疗.近年来肿瘤疫苗是采用MAGE多肽、基因和树突状细胞等方法来免疫肺癌患者,在Ⅰ/Ⅱ期临床试验中已观察到免疫反应和肿瘤的缓解,并取得了较好的临床疗效评价.目前正在进行国际多中心临床研究进行论证.
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黑色素瘤抗原-4基因在结肠腺癌中表达的检测
目的 检测黑色素瘤抗原-4(MAGE-4)基因在结肠腺癌中的表达情况.方法 采用RT-PCR方法检测44份结肠腺癌组织及15份癌旁正常组织标本中MAGE-4基因的表达.结果 44份结肠腺癌标本中,MAGE-4基因的阳性表达率为38.64%, 而在15份癌旁正常组织中均不表达,两组比较差异有显著意义.对阳性标本的RT-PCR扩增产物中目的基因片段进行DNA测序,证实为MAGE-4全长编码基因.结论 MAGE-4基因在结肠腺癌组织中呈特异性表达,提示该基因可用于结肠癌疫苗的开发.
关键词： 结肠腺癌 黑色素瘤抗原 逆转录-聚合酶链反应 -
人HSP70与MAGE-4表位基因原核表达载体的构建及表达
目的 构建热休克蛋白70(HSP70)与黑色素瘤抗原4(MAGE-4)抗原表位基因的原核表达载体,并对表达产物进行鉴定.方法 在热应激条件下,用PCR法从结肠腺癌细胞获取HSP70基因.在线用蛋白质二级结构预测软件分析MAGE-4抗原表位,PCR获取MAGE-4抗原特征表位基因.将二者分别克隆入pGEM-T easy载体,酶切鉴定后,将HSP70基因亚克隆入pET28a原核表达载体,再将MAGE-4基因克隆入HSP70基因的下游,构建重组质粒pET28a-HSP70-MAGE-4.转化大肠杆菌,IPTG诱导表达并鉴定.结果 所构建的HSP70与MAGE-4抗原表位基因表达载体pET28a-HSP70-MAGE-4,经PCR及DNA测序结果表明构建正确.SDS-PAGE及Western blot鉴定均在预期位置出现阳性条带.结论 已成功构建了人HSP70与MAGE-4抗原表位基因的原核表达载体,为疫苗研究提供了依据.
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肿瘤免疫-在确立人类肿瘤抗原的基础上面临新的飞跃
1 人类肿瘤抗原的确立1991年比利时科学家Boon和同事们经过20年的不懈努力,首次报道分离人类恶性黑色素瘤抗原MAGE-1成功,是肿瘤免疫学研究的划时代转折.从此,一个个肿瘤抗原相继被确定.如今已知MAGE-1属于至少有17个相关成员的基因家族,包括MAGE-A1～A12、MAGE-B1～B4、MAGE-1.之后,美国国立癌症研究所Rosenberg也从黑色素瘤分离到MART-1、gp100等肿瘤抗原.MAGE系列肿瘤抗原虽是从黑色素瘤分离到的,其成员在其他肿瘤也有一定的表达阳性率,因而可以认为是肿瘤共同抗原.
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三种MAGE基因在广西肝细胞癌中的表达
目的检测癌-睾丸抗原(CTA)基因MAGE-1、-3和-4在广西地区肝细胞癌(HCC)中的表达,探讨CTA作为疫苗对HCC治疗的可行性.方法用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法对25例广西HCC患者癌组织中MAGE-1、-3和-4基因mRNA的表达进行检测;随机选择MAGE-1、-3和-4阳性的RT-PCR产物各2例进行DNA序列测定.结果 MAGE-1和-3表达率均为40%(10/25),MAGE-4表达率为16%(4/25).DNA测序结果表明RT-PCR产物为MAGE-1、-3和-4基因.统计学分析显示MAGE-1、-3和-4基因的表达与HCC组织分化程度及临床分期无相关性(P>0.05),与HBV感染有相关性(P<0.05);此外,MAGE-1和-3的表达与肿瘤大小及AFP水平均存在相关性(P<0.05).在所检测的标本中,56%的标本至少表达上述1种MAGE,24% 的标本至少表达2种MAGE;16% 的标本表达3种MAGE.结论 MAGE-1和-3在广西HCC中有一定频率的表达,能否用于HCC的免疫治疗值得深入探讨.
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肝细胞癌MAGE-A9基因的克隆、表达及特性鉴定
目的:扩增和克隆人黑色素瘤抗原MAGE-A9(melanoma antigen A9)cDNA,构建原核表达载体,制备抗MAGE-A9单抗,观察其在肝细胞癌中的表达.方法:从人肝癌组织提取总RNA,用RT-PCR从中扩增出MAGE-A9 cDNA,插入载体pMD18-T中,测序正确后,构建重组表达载体pBAD/gⅢ-MAGE-A9,转化大肠杆菌TOP10株进行表达.重组蛋白经L-Arabinose诱导表达纯化后,制备抗MAGE-A9单抗,免疫组化检测MAGE-A9在肝细胞癌中的表达和定位.结果:获得MAGE-A9cDNA,测序结果与GenBank一致.成功构建表达载体,表达可溶重组蛋白,SDS-PAGE分析其相对分子质量为35kD.获得抗MAGE-A9单抗,MAGE-A9在肝细胞癌中的阳性表达率为21%(8/39),主要表达于胞浆,未见肿瘤异质性,统计学分析MAGE-A9的表达与患者年龄、性别、肿瘤大小和分化程度没有相关性.结论:有相当部分肝癌患者的肿瘤表达MAGE-A9抗原,且其表达与患者年龄、性别、肿瘤大小和分化程度没有相关性,MAGE-A9可能成为肝癌特异性免疫治疗的靶点.
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以黑色素瘤抗原基因mRNA为特异标记检测乳腺癌患者外周血肿瘤细胞
目的:以黑色素瘤抗原-A1(MAGE-A1)和MAGE-A3基因mRNA为特异性标记物,检测乳腺癌患者外周血中的肿瘤细胞,并探讨其临床意义. 方法:采集40例乳腺癌患者及20例非肿瘤患者的外周血,用巢式RT-PCR方法检测外周血单核细胞(PBMC)中MAGE-A1 和MAGE-A 3 基因mRNA.同时用RT-PCR方法检测乳腺癌患者肿瘤组织中上述MAGE基因的表达. 结果:12.5%(5/40)和17.5%(7/40)乳腺癌患者的PBMC中可分别检测到MAGE-A1和MAGE-A3基因的mRNA ,而相应乳腺癌组织中MAGE-A1和MAGE-A3的表达率分别为15.0%(6/40)和22.5 %(9/ 40),在25.0%(10/40)的乳腺癌患者PBMC中至少可检测到一种MAGE基因mRNA,癌旁组织、乳腺癌组织中不表达MAGE基因的患者以及20例非肿瘤疾病患者的PBMC中均未测出MAGE基因mRNA.乳腺癌患者PBMC中两种MAGE基因mRNA的检出率与肿瘤TNM分期密切相关. 结论:MAGE-A1 和MAGE-A3基因mRNA可作为特异性肿瘤标记物用于检测乳腺癌患者PBMC中的乳腺癌细胞,巢式RT-PCR的敏感性及特异性较高,其检测结果可能有助于判断乳腺癌患者的预后.
关键词： 乳腺癌 黑色素瘤抗原 巢式反转录聚合酶链反应 信使核糖核酸 -
以黑色素瘤抗原基因mRNA为标记检测乳腺癌患者循环肿瘤细胞
目的 以黑色素瘤抗原-A1和A3(MAGE-A1和MAGE-A3) 基因mRNA为标记,检测乳腺癌患者循环肿瘤细胞,并探讨其临床意义.方法 采集60例乳腺癌患者癌组织、癌旁组织标本及术前、化疗后外周血和60例非肿瘤患者外周血,用巢式RT-PCR检测癌组织、癌旁组织标本及外周血单核细胞(PBMC)中MAGE-A1和MAGE-A3基因mRNA.结果 28.3%(17/60)和23.3%(14/60)的乳腺癌患者PBMC中分别检测到MAGE-A1和MAGE-A3 基因的mRNA,35.0%(21/60)的乳腺癌患者PBMC中至少可以检测到1种MAGE基因mRNA.乳腺癌患者PBMC中MAGE-A1和MAGE-A3基因mRNA的检出率与肿瘤组织中MAGE的检出率相关(P＜0.0005),肿瘤组织及外周血中MAGE的表达与肿瘤的分期、肿瘤的病理类型、年龄、受体状况、CerbB-2、 Ki-67无相关性(P＞0.05).结论 MAGE-A1和MAGE-A3基因mRNA可以作为特异性肿瘤标记物用于检测乳腺癌患者PBMC中的乳腺癌细胞,其检测结果可能有助于判断乳腺癌患者的预后.
关键词： 乳腺癌 黑色素瘤抗原 巢式逆转录聚合酶链反应 信使核糖核酸 -
黑色素瘤抗原A家族与肝细胞癌
黑色素瘤抗原A (MAGE-A)是一组肿瘤相关性抗原,主要表达于以黑色素瘤为主的多种恶性肿瘤组织中.肝细胞癌(HCC)是发生于肝脏的上皮性恶性肿瘤,患病率高,寻找有效的诊断和治疗方法成为极其迫切的任务.目前已证实MAGE-A基因在HCC组织中高表达,对HCC诊治及预后判断具有重要意义.
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结膜色素痣和黑色素瘤的免疫组织化学特点分析
S-100抗体、人黑色素瘤抗体(melanoma black-45,MB-45)和黑色素瘤抗原T细胞(melanoma antigen recognized by T cell-1,MART-1)是鉴别良性或恶性皮肤色素痣和黑色素瘤的主要标记物,但对结膜黑色素细胞增生物的诊断仍存在争议[1-2].本研究拟筛选可鉴别结膜良性或恶性黑色素病变的免疫标志物.
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黑色素瘤抗原A8和A12在膀胱移行细胞癌中超表达的临床研究
目的:研究肿瘤特异性黑色素瘤抗原(Melanoma antigen,MAGE)家族成员MAGE-A8、MAGE-A12基因在膀胱移行细胞癌(Transitional cell carcinoma,TCC)组织中的表达情况及其与相应病例临床特点的关系,评价这些基因或基因产物作为膀胱TCC组织免疫学检测和免疫治疗、基因治疗分子标志物的可行性.方法:选择膀胱TCC组织标本42例,相应的癌旁组织8例,采用逆转录聚合酶链反应(RT PCR)方法对MAGE-A8、MAGE-A12基因的表达情况进行检测.结果:42例膀胱TCC组织中,MAGE-A8 mRNA阳性表达26例(62%),MAGE-A12 mRNA阳性表达18例(43%),MAGE A8及MAGE-A12同时表达8例(19%).8例癌旁组织均不表达MAGE-A8和MAGE-A12.结论:MAGE-A8、MAGE A12基因在膀胱TCC中超表达,有可能作为膀胱TCC组织免疫学检测的分子标志物,并且具有作为免疫治疗、基因治疗特异性靶位的潜在价值.
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黑色素瘤抗原A3基因过表达对人肝癌细胞株的影响
目的 观察黑色素瘤抗原A3(MAGE-A3)基因过表达对人肝癌细胞株增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响,探讨MAGE-A3基因在肝细胞癌发生发展过程中的作用.方法 将MAGE-A3重组慢病毒表达载体(LV-MAGE-A3)感染人肝癌细胞株HepG2和MHCC-97H;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot技术检测MAGE-A3 mRNA和蛋白在肝癌细胞中的表达;四甲基偶氮唑蓝(MTT)、平板克隆形成实验、Transwell迁移及侵袭实验检测MAGE-A3基因过表达前后肝癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力的变化;原位末端脱氧核糖核酸转移酶标记DNA链断端分析法(TUNEL)检测肝癌细胞的凋亡,流式细胞术(FCM)分析细胞周期的改变.结果 病毒感染肝癌细胞120 h荧光达到强且稳定,感染效率可达80％.RT-PCR和Western blot检测证实经LV-MAGE-A3感染的细胞高效表达MAGE-A3 mRNA与蛋白.HepG2和MHCC-97H细胞经LV-MAGE-A3感染后,迁移细胞数达到(187.00±13.52)、(121.00 ±4.16)个,侵袭细胞数达到(164.00±9.64)、(59.50±1.00)个,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01);FCM检测发现S期细胞比例增加,G1期细胞减少.肝癌细胞的生长增殖、克隆形成能力和凋亡指数在各组间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 MAGE-A3基因的过表达能提高肝癌细胞的迁移和侵袭能力,提示MAGE-A3基因与肝细胞癌的进展相关.
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膀胱移行细胞癌组织中MAGE-A基因及蛋白的表达
我们对45例人膀胱移行细胞癌组织中黑色素瘤抗原(MAGE)基因家族中的MAGE-A1、MAGE-A3及MAGE-A12基因的表达进行检测.
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人乳头瘤病毒-黑色素瘤抗原细胞毒T淋巴细胞表位嵌合基因克隆及其表达
目的 构建人乳头瘤病毒(HPV)6b型结构蛋白L1-黑色素瘤抗原(MAGE-A3)细胞毒T淋巴细胞(CTL)表位嵌合基因并表达目的蛋白,为下一步制备HPV6bL1/MAGE-A3-CTL嵌合疫苗提供理论基础和实验依据.方法 将MAGE-A3 CTL表位基因插入到HPV6bL1的羧基端序列中,将目的基因连入真核表达转移载体pFastBacTM1,构建重组质粒pFastBacTM1/HPV6bL1/MAGEA3-CTL,转化DH10Bac感受态细胞,获得重组杆状病毒Bacmid/HPV6bL1/MAGE-A3-CTL;将重组杆状病毒转染sf-9昆虫细胞表达嵌合目的蛋白,并经SDS-Page电泳、考马斯亮蓝染色及Western blot分析鉴定.结果 成功构建了重组质粒pFastBacTM1/HPV6bL1/MAGE-A3-CTL,获得了重组杆状病毒Bacmid/HPV6bL1/MAGE-A3-CTL,并在真核细胞sf-9昆虫细胞中成功表达了嵌合目的蛋白.结论 通过基因克隆方法能成功的将MAGE-A3 CTL表位基因插入到HPV6bL1基因中,并能在真核细胞表达系统中表达出嵌合目的蛋白,为进一步制备HPV6bL1/MAGE-A3-CTL嵌合疫苗提供理论基础和实验依据.
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葡萄球菌肠毒素A与黑色素瘤抗原A3共表达真核质粒致敏小鼠淋巴细胞对喉癌细胞模型的影响
目的 观察真核质粒pMAGEA3-IRES-SEA免疫小鼠后,鼠脾淋巴细胞对喉癌细胞模型B16/MAGE-A3的杀伤作用.方法 将葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal endotoxin A,SEA)和喉癌来源的黑色素瘤抗原A3(melanoma-associated antigen A3,MAGE-A3),构建成基因共表达的真核质粒pMAGEA3-IRES-SEA,用电转染的方法免疫BALB/C小鼠单侧股四头肌.末次免疫2周后,取脾分离淋巴细胞,与B16/MAGE-A3细胞共同培养,MTT法观察活化的淋巴细胞对B16/MAGE-A3的杀伤作用.结果 ptk-IRES-SEA、pIRES2-EGFP/MAGE-A3和pMAGEA3-IRES-SEA质粒组对B16/MAGE-A3细胞特异性杀伤率均高于空白质粒及生理盐水组(P＜0.05);pMAGEA3-IRES-SEA质粒组杀伤作用大于ptk-IRES-SEA、plRES2-EGFP/MAGE-A3质粒组(P＜0.05).结论 构建的pMAGEA3-IRES-SEA真核质粒可通过电转染的方式输入到小鼠体内,诱导特异性细胞免疫,可提高杀伤B16/MAGE-A3细胞的作用.为DNA疫苗接种途径、方法及抗喉癌疫苗的研究提供了实验依据.
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溶氧反馈-补料分批技术高密度培养基因重组MAGE1/HSP70/MAGE3工程菌
目的 建立人黑色素瘤抗原MAGE1/HSP70/MAGE3融合蛋白基因重组工程菌E.coli.BL21/pET-MHM的高密度发酵工艺.方法 以摇瓶发酵结果为基础,扩大至NBS Bioflo Ⅳ 20 L发酵罐发酵,利用溶氧反馈-补料分批培养技术,对影响工程菌生长及目的蛋白表达的因素如发酵培养基、活化时间、诱导浓度及时间、pH值及分批补加营养物质等进行优化.结果 保持培养过程中40%的溶解氧,采用半合成培养基、活化至对数生长期时0.2 mmol/L IPTG诱导5 h以及以甘油为碳源连续流加补料的条件发酵,连续3批重复发酵,终菌密度D(600)均达45～50时,菌体量可提高至70 g/L以上,目的蛋白的表达量占菌体蛋白总量的38%以上.结论 确定了周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺.
