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脐血红系祖细胞扩增的研究
脐血通过体外培养定向扩增为红系祖细胞及前体细胞作为新生红细胞血源有可行的实验室基础.红细胞生成涉及复杂过程,包括转录因子、生长因子、信号分子、红细胞相关蛋白.选择单个核细胞或CD34+为起始细胞对红系的区别不大,红系祖细胞CD71+CD36+CD34+CD117+CD48-CD123-.对CD34+造血干/祖细胞起作用有早期作用因子FL、TPO、SCF、IL-3、IL-6、SCF、IL-11,晚期作用因子如EPO、IGF-1、INS、TGFβ、Activin A.低氧促进造血祖细胞向红系定向,基质细胞对红系的扩增作用的影响不大.造血细胞向红系定向包括TAL1、LMO2、GATA-2转录因子参与;定向红系祖细胞分化包括NF-E2和EKLF转录因子.
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全反式维甲酸对脐血红系祖细胞Hoxb2、Hoxb4基因表达的影响
本研究探讨全反式维甲酸(ATRA)对人脐血造血干细胞向红系定向增殖分化过程进行干预后hoxb2、hoxb4基因表达的影响.取12例正常足月顺产新生儿断脐后的胎盘段脐血,采用造血干细胞体外培养技术及FQRT-PCR方法,以6×10-8mol/L的ATRA干预人脐血造血干细胞向红系定向增殖分化的过程,进而检测空白对照组、ATRA组在培养的第3天、第7天和第10天红系祖细胞hoxb2、hoxb4基因表达情况.结果表明:本实验各组的hoxb2、hoxb4基因在第3天时开始少量表达,在第7天表达明显升高,而在第10天表达强烈.在空白对照组中,第3天、第7天、第10天hoxb4基因相对表达量较hoxb2高.与空白对照组相比较,ATRA组Hoxb2、Hoxb4基因表达量明显增加.结论:hoxb2、hoxb4基因在脐血HSC向红系定向增殖分化过程中(体外)均有表达,说明hoxb2、hoxb4均与红系造血有相关性,且与hoxb2相比,可能hoxb4与红系造血相关性较大;6×10-8mol/L的ATRA能显著上调正常红系祖细胞hoxb2、hoxb4基因的表达.
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脐血CD34+细胞及红系祖细胞扩增的实验研究
脐血是造血祖细胞的丰富来源之一,选择合适的培养条件,体外诱导其定向扩增为红系祖细胞,输入体内产生成熟红细胞.本实验旨在探讨脐血单个核细胞(MNC)体外红系定向扩增的理想因子组合(Flt3配基FL联合TPO、SCF、EPO及FL、SCF、TPO)对CD34+细胞扩增的影响.将单个核细胞接种至stemspan无血清培养液中,共分3组:A组为对照组,B组为TPO+SCF+FL+EPO+IGF-1组,C组为TPO+SCF+FL组,C组在第6天及以后换液加入EPO和IGF-1.于培养0、6、10、14天进行细胞计数,细胞集落测定,流式细胞术测定细胞的CD34、CD34CD71、CD71GPA细胞的比例.结果表明:经10天培养后,B组总细胞数扩增6.89倍,而C组3.06倍;B组CD34+细胞增加4.83,而C组2.47倍;B组集落形成细胞数增加4.3倍,而C组增加2.5倍;B组红系祖细胞BFU-E和CFUE数增加5.4倍,而C组3.1倍;B组CD34+CD71+细胞数增加8.72倍,而C组3.37倍;B组CD71+GPA+细胞数增加53.4倍,而C组30.29倍.结论:脐血MNC在无血清培养液中加入FL+SCF+TPO实现了CD34+细胞及集落形成细胞的扩增.脐血MNC在无血清培养液中加入FL+SCF+TPO+EPO+IGF-1短期液体培养获得红系祖细胞的扩增,在第0天比6天加入EPO获得更多红祖细胞(P＜0.05).由于TPO+SCF+FL+EPO+IGF-1组的集落形成细胞数、CFU-E和BFU-E数于第10天多,故培养后收获时间宜控制在其体外培养的第10天.
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先天性纯红细胞再生障碍性贫血8例分析
先天性纯红细胞再生障碍性贫血(CPRCAA)是骨髓中红系祖细胞受损导致红系统受抑而粒系及巨核细胞造血正常的一种贫血[1],为提高对该病发生的机制、诊断和预防方面的认识,现将我院1985年～2006年收治的8例CPRCAA患儿与其母孕期贫血史、感染史、流产史、近亲史作回顾性分析报道.
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复方丹参注射液对放射损伤小鼠骨髓红系集落形成单位和红系爆式集落形成单位生成的影响
目的 观察复方丹参注射液(ISM)对60Coγ放射损伤小鼠骨髓红系集落形成单位(CFU-E)和红系爆式集落形成单位(BFU-E)生成的影响.方法 30只小鼠随机分为对照组(予生理盐水,不予注射)、模型组(予生理盐水,予照射)、模型+ISM给药组在60Coγ射线照射前后腹腔注射ISM,0.04ml/g,2次/d,连续注射6d,照射后第4天取股骨骨髓制备有核细胞悬液,甲基纤维素半固体培养法测定CFU-E和BFU-E集落.结果 ISM给药组CFU-E和BFU-E分别为(42.48±5.52)、(14.22±3.14)个,与模型组[分别为(16.32±2.68)、(4.62±1.88)个]相比,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 ISM能提高放射损伤小鼠骨髓红系干细胞集落形成和保护受损小鼠骨髓造血功能的作用.
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Notch配体δ-1对IL-6/sIL-6R融合蛋白诱导红系祖细胞分化成熟的影响
目的 探讨Notch配体δ-1在红系造血细胞分化过程中对可溶性IL-6受体(sIL-6R)生物效应的影响.方法 用CD34免疫磁珠和FACS Vantage流式细胞仪筛选脐血单个核细胞中的CD34+CD38-细胞;将CD34+CD38-细胞用含SCF、Flt3L、TPO和IL-3四种生长因子组合(4GFs)的培养基培养7 d,然后用CD36免疫磁珠分离CD36+红系祖细胞,用流式细胞术检测IL-6R和血型糖蛋白(GPA)的表达,并分选CD36+GPA-IL-6R+和CD36+GPA-IL-6R-细胞,将这两种表型的细胞分别进行集落分析;将CD36+GPA-IL-6R-细胞用含有4GFs、4GFs+IL-6或4GFs+IL-6/sIL-6R融合蛋白(FP6)培养基并在加与不加Notch配体δ-1的情况下培养14 d,并对CD36+GPAhigh成熟红细胞进行计数.结果 CD36+GPA+细胞中IL-6R-细胞占95%;CD36+GPA-细胞可分为IL-6R+和IL-6R-两部分,分别占46%和54%;IL-6R+细胞形成的粒-单核细胞集落形成单位(CFU-GM)数为2.1±1.8,IL-6R-细胞形成的红系祖细胞爆式集落形成单位(BFU-E)数为58.2±18.1,明显高于IL-6R+细胞形成的CFU-GM数(P＜0.05);在含有FP6的培养体系中,CD36+GPAhigh细胞计数为(1.400±0.180)×106;在含FP6和Notch配体δ-1的培养体系中,CD36+GPAhigh细胞计数为(2.460±0.190)×106,明显高于单独含有FP6的培养体系(P＜0.05).结论 Notch配体δ-1可增强IL-6-红系细胞分化过程中sIL-6R所介导的生物学效应.
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真性红细胞增多症患者内源性红系集落检测及其临床意义
目的了解真性红细胞增多症(PV)患者内源性红系集落(EEC)生长情况及其临床意义.方法应用半固体甲基纤维素培养体系培养26例PV患者及19名正常对照者骨髓单个核细胞中的EEC,应用流式细胞术检测8例PV患者及10名正常对照者骨髓单个核细胞Annexin Ⅴ并分析其与EEC之关系.结果①26例PV患者中25例(96.2%)检测到EEC,继发性红细胞增多症患者及正常对照组EEC检出率为0.②PV患者的EEC数、EEC/Epo依赖CFU-E(EEC率)与患者血红蛋白水平呈正相关(r=0.608,P＝0.01),EEC率与患者外周血白细胞和血小板计数及中性粒细胞碱性磷酸酶(ALP)指数无明显相关性.③EEC与血清Epo水平无相关性(r=0.518,P=0.125).④15例PV患者应用羟基脲(HU)和(或)干扰素(IFN)治疗,治疗前EEC率与达完全缓解(CR)所需治疗时间呈正相关(r=0.651,P=0.009),与缓解持续时间呈负相关(r=-0.592,P<0.02).⑤7例应用HU和(或)IFN治疗的PV患者,血常规恢复正常后EEC及EEC率均减低.⑥EEC率与血栓栓塞发生率呈正相关(r＝0.524,P=0.01).⑦PV患者骨髓单个核细胞的凋亡率较正常对照组明显减低,PV患者中EEC与骨髓细胞凋亡率呈负相关(r=-0.192,P<0.045).结论 EEC特异性见于PV,EEC率与血红蛋白浓度、达CR所需治疗时间及血栓栓塞发生率呈正相关,与缓解持续时间呈负相关;骨髓抑制治疗可降低EEC检出率,PV患者EEC与骨髓细胞凋亡率呈负相关.EEC是直接反映PV异常造血克隆负荷的一项敏感、特异的指标,可作为PV诊断及评价疗效的辅助指标.
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以红细胞生成素为基础的新型红系造血促进剂研究进展
红系造血的主要调节因子是红细胞生成素(Erythropoietin,Epo),它可通过与红系造血祖细胞表面的特异性受体结合,促进红系祖细胞的存活、增殖、分化和成熟,维持和增加循环中的红细胞数量[1].慢性肾功能衰竭、肿瘤放化疗、艾滋病和胃肠道炎症所导致贫血需要使用Epo来治疗.基因重组的人Epo体内半衰期短,大约为6h,需要反复多次给药.因此,人们希望发现更稳定、高效、方便的人Epo产品或其类似物,这方面的进展主要有高度糖基化Epo-Darbepoetin 或新的红系造血刺激蛋白(NESP)、Epo二聚体、GM-CSF/Epo、IL-3/Epo、Epo/Tpo(C)、Epo模拟肽(Epo mimetic peptide,EMP)和非肽活性小分子化合物等.
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红细胞造血过程中因子调控及胞内信号转导
由髓系造血干/祖细胞开始的红细胞造血经历了大约3个阶段,首先是定向分化为红系爆式集落形成单位(BFU-E),然后分化为红系祖细胞集落形成单位(CFU-E),后逐渐成熟,成为形态上可辨认的幼稚红细胞到去核红细胞.该过程受到多种因子调控并伴有复杂的胞内信号转导.现对该方面研究进展综述如下.
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肿瘤坏死因子α对红系祖细胞造血影响的实验研究
我们通过对正常人纯化的CD34+细胞的体外培养,观察特殊的红细胞标记血型糖蛋白A(Glycophorin A,GpA)和CFU-E的变化,以及TNF受体(TNFR)在红系祖细胞上的表达情况,探索TNF-α在人类红系祖细胞生长发育过程中对红系造血的影响.
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环孢菌素A联合泼尼松和雄激素治疗纯红细胞再生障碍的临床疗效研究
纯红细胞再生障碍(PRCA)是指红系祖细胞受损导致红细胞系统受抑制而发生的一类贫血。尽管PRCA病因很多，然而近年研究认为，其发病机制主要与机体免疫功能紊乱有关。我们应用体外造血祖细胞培养方法，结合免疫功能检查，应用环孢菌素A(CsA)合并康力龙和雄激素对12例PRCA进行研究，以探讨PRCA的发病机制及治疗方法。
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细胞因子与类风湿关节炎并发贫血的相关性研究
为探讨类风湿关节炎(RA)活动期患者血清细胞因子水平的变化及细胞因子与贫血发生的关系,我们对RA伴慢性疾病性贫血(能D)患者外周血细胞因子进行了检测,并运用骨髓培养技术对RA伴贫血患者骨髓细胞进行了体外培养,观察、研究细胞因子对红系祖细胞增殖和分化的影响,以探讨RA并发ACD的机制及细胞因子在临床治疗中的应用价值.
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脐血干/祖细胞的生物学特点
脐血是一重要的造血干/祖细胞（HSPC）来源,可用作临床干细胞移植,目前有关脐血的研究主要集中于HSPC的比例、细胞亚群的划分、对造血因子刺激的反应能力、增殖/扩增潜能的控制及HSPC体外扩增的条件等。研究表明，脐血和成人骨髓来源的HSPC功能有显著不同，我们力图在细胞和分子水平论述其生物学特点。1 脐血中HSPC的比例研究表明，1?ml脐血中大约有原始红系祖细胞(BFU-E)8?000个,髓系祖细胞(CFU-GM)13?000～24?000,多能祖细胞（CFU-GEMM)1? 000～10?000。由于培养条件的不同，各家报道有一定差异，特别是CFU-GM和CFU-GEMM两项指标差异更大。事实上，许多研究证实，在半固体培养中加入干细胞因子(SCF)会明显提高CFU-GM、CFU-GEMM检出率。脐血和骨髓中HSPC含量相似，但HSPC亚群比例尚有很大差异，主要表现在以下几个方面：①脐血中BFU-E水平高于骨髓；②脐血和骨髓中CFU-GM水平相似，但脐血中更幼稚的双能粒-单核祖细胞含量明显高于骨髓；③脐血中不成熟的巨核祖细胞集落（>200个细胞）较多；④脐血中CFU-GEMM数比骨髓高4倍。脐血中高增殖潜能集落形成细胞（HPP-CFC）比骨髓大约高8倍；体外检测中接近人干细胞的长期培养启始细胞（LTC-IC）的比例二者相似，骨髓和脐血LTC-IC培养5周和8周产生的鹅卵石区分别为1∶13?314和1∶33?949，1∶12?506和1∶34?546,从这些结果可推测脐血中干细胞数与骨髓相当。
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基因重组人红细胞生成素对骨髓增生异常综合征、再生障碍性贫血患者红系祖细胞的作用
观察大剂量基因重组人红细胞生成素(rh-Ep)体外对10例正常人,17例骨髓增生异常综合征难治性贫血(MDS-RA),19例再生障碍性贫血(AA)患者红系祖细胞(CFU-E)的作用.结果:MDS-RA和AA患者的CFU-E明显低于正常人(P均＜0.01),随rh-Ep剂量加大,各组红系祖细胞(CFU-E)均有不同程度增高,至100u/ml达高值,并接近或超过正常值.结果表明,大剂量rh-Ep可促进部分MDS-RA趾和AA患者CFU-E增殖.
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胸腺瘤合并单纯红细胞再生障碍性贫血
单纯红细胞再生障碍性贫血(Thymomas Associated With Pure Red Cell Aplasia,PRCA)是一组选择性导致红细胞生成障碍的综合症,骨髓中红系祖细胞(BFU-E)生长障碍,外周血中红细胞及网织红细胞减少,粒细胞和血小板正常.PRCA分为两大类型:先天性和获得性.而后者又分为两类,原发性和继发性.原发性PRCA无可疑的致病因素或药物;而继发性PRCA有某种致病因素,并且分为急性和慢性两种类型.
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促红细胞生成素对单侧输尿管结扎模型大鼠肾间质纤维化保护作用的研究
促红细胞生成素(EPO)作为一种主要调节红细胞生成的体液因子,促进红系祖细胞分裂分化为成熟的红细胞,增加血液中红细胞的数量,广泛用于治疗各种原因引起的贫血.但近年来,有关EPO在非造血方面的作用,国内外的研究也越来越多,发现EPO对肾脏具有纠正贫血以外的保护作用[1].
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Fas配体对人红系祖细胞抑制作用的研究
目的探讨Fas配体(Fas-L)在红系祖细胞造血过程中的作用及肿瘤坏死因子(TNF-α)、干细胞因子(SCF)对其作用的影响.方法 2001-01～2003-12对中国医科大学附属第一医院的人外周血CD + 34细胞利用免疫磁珠法(MACS)分离并纯化人,在体外与模拟Fas-L的抗Fas单克隆抗体、TNF-α和SCF一起培养,测定红系集落形成能力.结果 Fas单克隆抗体对红细胞爆裂型生成单位(BFU-E)无明显抑制作用,但能显著抑制红细胞集落生成单位(CFU-E)的形成,TNF-α与其有协同作用,SCF则能中和Fas单克隆抗体对CFU-E形成的抑制作用.结论 Fas与Fas-L途径在体外能抑制晚期红系祖细胞的生长,TNF-α可增强此种抑制作用,SCF则能保护红系祖细胞免于此种抑制作用.
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人类巨细胞病毒感染对脐血红系祖细胞同源盒B6基因表达的影响
目的 研究脐血红系祖细胞的HOXB6基因的表达情况以及人类巨细胞病毒(HCMV)感染对红系祖细胞的HOXB6基因表达的影响,以探讨HCMV导致脐血红系祖细胞损伤的机制.方法 在泸州医学院附属医院儿科以实时荧光定量PCR技术(FQ-RT-PCR)检测人类巨细胞病毒感染和(或)用全反式维甲酸(ATRA)处理后HOXB6基因的表达水平.结果 人脐血红系祖细胞可表达HOXB6基因;HCMV感染后,红系祖细胞HOXB6基因的表达明显下调;ATRA能显著上调红系祖细胞HOXB6基因的表达水平,且能够在一定时间内上调HCMV感染后的红系祖细胞HOXB6基因的表达.结论 HCMV感染能诱导脐血红系祖细胞HOXB6的表达下调,HCMV有可能通过调控HOXB6基因表达异常而引起红系祖细胞的增殖障碍.
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干扰素α-2b联合红细胞生成素对骨髓纤维化红系祖细胞作用的体外研究
目的:研究干扰素α-2b(IFN-α2b)联合红细胞生成素(EPO)对骨髓纤维化(MF)红系祖细胞(CFU-E)的作用.方法:采用细胞体外培养法对20例MF患者CFU-E进行观察.结果:单用IFN-α2b对MF患者CFU-E有明显促增殖作用;与EPO联合时其促增殖作用更加明显,使MF患者CFU-E接近正常对照组.结论:IFN-α2b联合EPO对MF患者红系祖细胞具有显著促增殖作用,为临床应用提供了可靠的依据.
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外周血红系祖细胞来源诱导多能干细胞的建立
目的 建立和鉴定外周血中红系祖细胞来源的诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs).方法 从健康人外周血标本中分选红系祖细胞,将表达Oct4、Sox2、Lin28、L-Myc和Klf4转录因子的oriP/EBNAl附着体电转染红系祖细胞使其重编程获得iPSCs,并通过核型鉴定、碱性磷酸酶染色、RT-PCR反应、畸胎瘤形成实验及类胚体形成实验检测其干细胞多能性特性.结果 获得的iPSCs核型正常,碱性磷酸酶染色呈阳性,表达干细胞多能性基因Sox2、Oct4、Nanog和Klf4和Lin28,体内畸胎瘤形成实验可分化为内、中、外三胚层细胞,体外可形成类胚体.结论 成功建立外周血红系祖细胞来源具有多向分化潜能的iPSCs.
